余智濤 張 磊 溫建燔

環(huán)狀RNA為非編碼RNA家族成員，其廣泛存在于人體組織中，其表達(dá)具有組織特異性，是非編碼RNA 領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。既往研究顯示，環(huán)狀RNA具有多種生物學(xué)功能，其可通過mRNA海綿作用，提升靶基因的表達(dá)[2]。本課題組前期應(yīng)用芯片技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中環(huán)狀RNA TADA2A呈低表達(dá)。因此，為進(jìn)一步探討環(huán)狀RNA TADA2A與胃癌的關(guān)系，本研究對(duì)92例胃癌患者進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2020年1月至2021年1月于我院接受手術(shù)治療的胃癌患者92例納入研究，入組患者均經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性胃癌且術(shù)前均未行放化療。收集術(shù)后胃癌組織及癌旁組織(經(jīng)病理證實(shí)為正常胃組織)作為樣本，將新鮮組織樣本經(jīng)冷凍處理后置于-80℃冰箱待檢。環(huán)狀RNA TADA2A引物及內(nèi)參GAPDH委托上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 根據(jù)Trizol試劑盒(生產(chǎn)廠家：大連寶生物工程公司)說明書操作，取樣本組織80 mg，超聲勻漿后，經(jīng)1‰DEPC水溶解后，提取樣本中RNA的濃度、純度，另取1 μl RNA檢測(cè)RNA完整性。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(生產(chǎn)廠家：大連寶生物工程公司)說明書操作，反應(yīng)體系(20 μl)：2 μl RNA樣品、1 μl引物、1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶、1 μl GAPDH反向引物、1 μl dNTP混合物(10 mM)、0.5 μl RNase抑制劑 、4 μl 5×RT 緩沖液、9.5 μl不含RNase的H2O。反應(yīng)條件：42℃ 30 s，56℃ 15 min，85℃ 1 min，4℃ 5 min，產(chǎn)物置于-20℃保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(生產(chǎn)廠家：西安天隆科技公司)，按照PCR試劑盒(生產(chǎn)廠家：廣州銳博生物科技公司)說明書操作，反應(yīng)體系(25 μl)：2 μl稀釋的cDNA、12.5 μl SYBP Premix EX TaqTMⅡ、2 μl引物，加ddH2O水補(bǔ)至25 μl。反應(yīng)條件：95℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 1 min，42℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 結(jié)果計(jì)算 采用2-△△CT方法計(jì)算，GAPDH為內(nèi)參，取三個(gè)復(fù)孔均值，以 2-△△CT表示目的基因表達(dá)，環(huán)狀RNA TADA2A的相對(duì)表達(dá)量=2-△△CT值(環(huán)狀RNA TADA2A)-2-△△CT值(GAPDH)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織中環(huán)狀RNA TADA2A的相對(duì)表達(dá)量比較

環(huán)狀RNA TADA2A在胃癌組織中相對(duì)表達(dá)量為(0.83±0.14)，明顯低于癌旁組織(2.29±0.87)，兩組比較差異顯著(t=15.892，P<0.001)，見圖1。

圖1 組織中環(huán)狀RNA TADA2A的相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 環(huán)狀RNA TADA2A的相對(duì)表達(dá)量與胃癌臨床特征的關(guān)系

臨床分期高、深層浸潤、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有脈管癌栓的胃癌組織中環(huán)狀RNA TADA2A的相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，見表1。

表1 環(huán)狀RNA TADA2A的相對(duì)表達(dá)量與胃癌臨床特征的關(guān)系

2.3 環(huán)狀RNA TADA2A診斷胃癌的ROC曲線分析

由ROC曲線可知，環(huán)狀RNA TADA2A診斷胃癌的AUC為0.796(95%CI：0.683-0.925，P<0.05)，診斷特異度為80.21%，敏感度為88.43%，見圖2。

圖2 環(huán)狀RNA TADA2A診斷胃癌的ROC曲線

3 討論

臨床研究顯示，環(huán)狀RNA的分子結(jié)構(gòu)為封閉環(huán)狀，它是特殊的內(nèi)源性非編碼RNA，存在于人體細(xì)胞中且具有多種生物學(xué)功能[3]。近年來，環(huán)狀RNA與腫瘤的關(guān)系已成為臨床研究的熱點(diǎn)問題。陳炳合等[4]研究報(bào)道，胃癌組織中環(huán)狀RNA cRAPGEF5表達(dá)下調(diào)，其可能參與胃癌的侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移。羅再等[5]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中環(huán)狀RNA RUNX1呈高表達(dá)，且其表達(dá)與胃癌病理特征、患者預(yù)后有關(guān)。朱秋霞等[6]研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中環(huán)狀RNA TADA2A呈高表達(dá)，下調(diào)表達(dá)水平可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移。另有學(xué)者研究報(bào)道，F(xiàn)AM107A在胃癌等多種癌癥中呈低表達(dá)，TADA2A可能與FAM107A相互作用，共同參與細(xì)胞過程，發(fā)揮抑癌作用[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，胃癌組織中環(huán)狀RNA TADA2A的相對(duì)表達(dá)量明顯降低。結(jié)果提示，胃癌組織中環(huán)狀RNA TADA2A呈低表達(dá)。既往研究顯示，環(huán)狀RNA TADA2A位于人17號(hào)染色體，其在大腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，其可通過miR-374a-3p/KLF14軸抑制大腸癌的進(jìn)展[8]。另有研究報(bào)道，乳腺癌組織中環(huán)狀RNA TADA2A呈低表達(dá)，其可通過靶向miR-203a-3p/SOCS3軸抑制乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[9]。由以上研究可知，環(huán)狀RNA TADA2A在腫瘤組織中呈異常表達(dá)，其與惡性腫瘤的的發(fā)生有關(guān)。

本研究表明，臨床分期高、深層浸潤、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有脈管癌栓的胃癌組織中環(huán)狀RNA TADA2A的相對(duì)表達(dá)量顯著下降。通過ROC曲線分析，環(huán)狀RNA TADA2A診斷胃癌的特異度、敏感度較高，結(jié)果提示，環(huán)狀RNA TADA2A可能參與胃癌的發(fā)生進(jìn)展過程，其可能成為胃癌臨床診斷標(biāo)記物。有研究顯示，環(huán)狀RNA TADA2A可通過調(diào)節(jié)CREB3表達(dá)、海綿化miR-203a-3p，進(jìn)而促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展[10]。另有研究報(bào)道，環(huán)狀RNA TADA2A可通過抑制成纖維細(xì)胞的增殖和活化來緩解特發(fā)性肺纖維化[11]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，新型環(huán)狀RNA TADA2A可通過海綿化miR-203促進(jìn)卵巢癌的增殖和轉(zhuǎn)移。李震等[12]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA TADA2A可通過促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，而抑制癌細(xì)胞增殖，其在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用。因此，我們推測(cè)環(huán)狀RNA TADA2A在腫瘤組織發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，環(huán)狀RNA TADA2A在胃癌組織中呈低表達(dá)，其可能與胃癌的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)，但臨床尚需進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。