趙淑晶，高永堅，區(qū)淑蘊，劉勇，梁鳳友，肖艷

（國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528303）

對乙酰氨基酚為乙酰苯胺類解熱鎮(zhèn)痛藥，具有良好的解熱、鎮(zhèn)痛作用，在世界上廣泛應(yīng)用。分析各國藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及對乙酰氨基酚原料的合成工藝確認(rèn)已知雜質(zhì)共有15 個（見表1），其中對氯苯乙酰胺（雜質(zhì)J）和對氨基酚（雜質(zhì)K）為已列入《中國藥典》（ChP2020）、《英國藥典》（BP2022）、《美國藥典》（USP43）標(biāo)準(zhǔn)的雜質(zhì)，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)D為已列入《美國藥典》（USP43）標(biāo)準(zhǔn)的雜質(zhì)；另參考文獻(xiàn)[2-3]可知：雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)G 和雜質(zhì)I 是以對羥基苯乙酮為原料合成對乙酰氨基酚的過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，雜質(zhì)H、雜質(zhì)L、雜質(zhì)M、雜質(zhì)N、雜質(zhì)F、雜質(zhì)O均為以對氨基酚為原料合成對乙酰氨基酚的過程中引入的工藝雜質(zhì)。

表1 對乙酰氨基酚原料中已知雜質(zhì)Table 1 Known impurities in Acetaminophen API

通過查詢致癌性數(shù)據(jù)庫（carcinogenicity potency database,CPDB）及文獻(xiàn)[4-5]，確定對硝基氯苯（雜質(zhì)O）和對硝基苯酚（雜質(zhì)F）為遺傳毒性雜質(zhì)。根據(jù)2020 年版《中國藥典》四部通則9306 遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則、國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）M7（R1）和Q3D指導(dǎo)原則，對乙酰氨基酚每天總劑量不超過2 g，對硝基氯苯限度按473 mg/（kg·d）計算（CPDB），限度要求為0.02%，對硝基苯酚限度按13.8 mg/（kg·d）計算(未觀察到作用劑量，noobserved effect level,NOEL[4]），限度要求為0.06%。

目前，尚未有同時檢測對乙酰氨基酚原料多種有關(guān)物質(zhì)及遺傳毒性雜質(zhì)的文獻(xiàn)報道。本研究建立了對乙酰氨基酚原料中有關(guān)物質(zhì)及遺傳毒性雜質(zhì)的測定方法，對其中9 個已知雜質(zhì)（雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F、雜質(zhì)H、雜質(zhì)J、雜質(zhì)K、雜質(zhì)O）進(jìn)行測定，為本品質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20A、LC-2010A 型高效液相色譜儀（島津科技有限公司）；色譜柱：SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×200 mm，5 μm，依利特）、Ultimate AQ-C18（4.6 mm×200 mm，5μm，月旭）。

對乙酰氨基酚原料藥[河北冀衡（集團(tuán)）藥業(yè)有限公司，批號011805003、011806176、011806177；對乙酰氨基酚（批號100018-201610）、對氨基酚（批號100802-201604）、對氯苯乙酰胺（批號100850-201803）來自中國食品藥品檢定研究院；雜質(zhì)A（批號8-ANR-29-1）、雜質(zhì)C（批號5-SCC-154-1）、雜質(zhì)H（批號7-ABY-121-1）、對硝基苯酚（批號11-MWC-191-1）來自Toronto Research Chemicals（TRC）；雜質(zhì)B（批號20-HPE-04Y3）、雜質(zhì)D（批號38-END-12Y3）來自STC Research Chemicals Ltd；對硝基氯苯（批號H1313034）來自阿拉丁。甲醇為色譜純，醋酸銨為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品儲備液的制備 精密稱取對乙酰氨基酚對照品適量，用40%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇制成對乙酰氨基酚儲備液（54.3μg/mL）。

精密稱取對氨基酚對照品適量，用40%甲醇制成對氨基酚儲備液①（541μg/mL）；精密量取2 mL，置200 mL 量瓶中，用40%甲醇稀釋制成對氨基酚儲備液②（5.41μg/mL）。

精密稱取對氯苯乙酰胺對照品適量，用甲醇制成對氯苯乙酰胺儲備液①（208.2μg/mL）；精密量取1 mL，置200 mL 量瓶中，用40%甲醇稀釋制成對氯苯乙酰胺儲備液②（1.041μg/mL）。

精密稱取對硝基氯苯對照品適量，用甲醇制成對硝基氯苯儲備液①（454.3μg/mL）；精密量取1 mL，置10 mL 量瓶中，用40%甲醇稀釋制成對硝基氯苯儲備液②（45.4μg/mL）。

精密稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)H、對硝基苯酚對照品適量，用40%甲醇制成含雜質(zhì)A（100.4 μg/mL）、雜質(zhì)B（104.5 μg/mL）、雜質(zhì)C（109.4 μg/mL）、雜 質(zhì)D（106.6 μg/mL）、雜 質(zhì)H（113.6 μg/mL）和對硝基苯酚（133.2 μg/mL）的混合對照品儲備液。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密量取對乙酰氨基酚對照品儲備液2 mL、混合對照品儲備液1 mL、對硝基氯苯儲備液②1 mL、對氨基酚儲備液②2 mL、對氯苯乙酰胺儲備液②2 mL，置10 mL 量瓶中，用40%甲醇制成約含對乙酰氨基酚10 μg/mL、雜質(zhì)A 10μg/mL、雜質(zhì)B 10μg/mL、雜質(zhì)C 10μg/mL、雜質(zhì)D 10μg/mL、雜質(zhì)H 10μg/mL和對硝基苯酚12μg/mL、對硝基氯苯4 μg/mL、對氨基酚1 μg/mL、對氯苯乙酰胺0.2μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取對乙酰氨基酚原料藥適量，精密稱定，加40%甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含20 mg的溶液。

2.1.4 對照品溶液的制備 精密量取供試品溶液1 mL，置20 mL 量瓶中，用40%甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1 mL，置20 mL 量瓶中，用40%甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（4.6 mm×200 mm,5μm）；檢測波長為245 nm，柱溫為35 ℃。以0.05 mol/L 醋酸銨為流動相A，甲醇為流動相B，流速1.0 mL/min，按表2進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)樣量20 μL。

表2 流動相洗脫梯度Table 2 Mobile phase elution gradient

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.1.2”項混合對照品溶液作為系統(tǒng)適用性試驗溶液，按“2.2”項色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1 及表3?？梢?，各雜質(zhì)與主成分（對乙酰氨基酚）的分離度以及各雜質(zhì)間的分離度均大于1.5，表明該色譜條件專屬性良好。

表3 對乙酰氨基酚與各雜質(zhì)的保留時間和分離度Table 3 Retention time and separation of acetaminophen and impurities

圖1 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖Figure 1 Chromatogram of system suitability test

2.3.2 耐用性試驗 在選定的色譜條件下，微小改變流動相比例（醋酸銨濃度0.04～0.06 mol/L）、流速（0.8～1.2 mL/min）、柱溫（30～40 ℃）及選用同規(guī)格型號但不同批號的依利特（E2917651、E3020745）、不同品牌（月旭，221701657）色譜柱后，分別取“2.1.2”項混合對照品溶液進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示：不同條件下，各雜質(zhì)與主成分（對乙酰氨基酚）的分離度以及各雜質(zhì)間的分離度均大于1.5，表明選定的色譜條件耐用性良好。

2.3.3 線性范圍 精密稱取對氯苯乙酰胺、對硝基氯苯對照品適量，分別用甲醇制成對氯苯乙酰胺儲備液（233.6μg/mL）、對硝基氯苯儲備液（454.3μg/mL）；另精密稱取對乙酰氨基酚、對氨基酚、對硝基苯酚對照品適量，用40%甲醇制成乙酰氨基酚儲備液（52.3 μg/mL）、對氨基酚儲備液（549.5 μg/mL）、對硝基苯酚儲備液（125.1μg/mL），上述儲備液用40%甲醇稀釋制成一系列濃度溶液，按“2.2”項色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表4。

表4 線性范圍試驗結(jié)果Table 4 Results of linear range

2.3.4 檢出限和定量限試驗 取“2.1.1”和“2.3.3”項下對照儲備液適量，用40%甲醇逐級稀釋，依法測定，以信噪比為3∶1時計算檢測限，以信噪比為10∶1時計算定量限，結(jié)果詳見表5。

表5 檢出限和定量限試驗結(jié)果Table 5 Results of detection limit and quantitation limit

2.3.5 精密度試驗 取“2.1.2”項混合對照品溶液按“2.2”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，以峰面積計算RSD，結(jié)果在0.1%～8.1%之間，小于10%，表明方法精密度良好，見表6。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 參照“2.1.2”項混合對照品溶液配制方法，配制除對乙酰氨基酚外的雜質(zhì)混合對照溶液，分別置于室溫（10～30 ℃）和冰箱（4～6 ℃）中，室溫于0、4、8、12、24 h 時取樣，冰箱于0、17、40、78 h時取樣，依法測定，計算峰面積RSD，結(jié)果顯示，除在室溫、24 h 和冰箱、78 h 時，對氨基酚和對硝基氯苯的峰面積RSD 值大于2%外，其他雜質(zhì)對照RSD值均小于2%，見表7。

取一批次樣品（批號011912026），按“2.1.3”項配制供試品溶液，“2.1.4”項配制對照溶液，并按“2.2”項色譜條件進(jìn)樣分析，供試品溶液在室溫、24 h及冰箱、78 h內(nèi)各時間點雜質(zhì)含量與0 h比較。外標(biāo)法計算對氨基酚、對氯苯乙酰胺、對硝基苯酚、對硝基氯苯，均未檢出；不加校正因子的主成分自身對照法計算其他雜質(zhì)，最大單雜和總雜含量變化的絕對值小于0.02%，表明溶液穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗 取一批次樣品（批號011912026），按“2.1.3”項供試品溶液和“2.1.4”項對照溶液方法制備，平行6 份，并按“2.2”項色譜條件進(jìn)樣測定；由不同的分析人員，使用不同的儀器和不同批號的色譜柱在不同日期進(jìn)行另外6 份供試品溶液測定，綜合12 次測定結(jié)果，均未檢出對氨基酚、對氯苯乙酰胺、對硝基苯酚和對硝基氯苯，最大單雜和總雜含量變化的絕對值小于0.02%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 回收率試驗 精密稱取9 份對乙酰氨基酚原料藥（批號011912026）0.4 g，分別精密加入“2.3.3”項對照品溶液適量，按“2.1.3”項方法制備供試品溶液9 份，按“2.2”項色譜條件進(jìn)樣分析，根據(jù)“2.3.3”項下的線性回歸方程計算各濃度準(zhǔn)確度溶液的測定得量，計算回收率，結(jié)果見表8。

表8 回收率試驗結(jié)果Table 8 Results of recoveries

2.4 樣品的測定

取3 批對乙酰氨基酚原料（批號：011805003、011806176、011806177）依法制備供試品溶液和對照品溶液，按“2.2”項色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示：3批原料中對氯苯乙酰胺的檢測結(jié)果分別為未檢出、0.001%、0.001%；對氨基酚的檢測結(jié)果分別為未檢出、未檢出、0.001%；其他單雜的檢測結(jié)果分別為0.02%、0.02%、0.02%；總雜的檢測結(jié)果分別0.04%、0.03%、0.03%；3批均未檢測出對硝基氯苯（檢測限：0.061 μg/mL）和對硝基苯酚（檢測限：0.053 μg/mL）。

3 討論

3.1 方法的優(yōu)化

對比各國藥典收載的對乙酰氨基酚原料有關(guān)物質(zhì)檢測方法，ChP2020 和USP43 均需使用2 個液相方法測定有關(guān)物質(zhì)，BP2022 雖然只使用1 個液相方法檢測，但只檢測了對氨基酚和對氯苯乙酰胺，其他特定雜質(zhì)的檢出能力未知，且規(guī)定的C18柱（100 mm×2.1 mm, 2.7 μm）一般要使用超高效液相測定，普通液相不適用。而本研究建立的方法可以使用普通液相同時檢測9 種已知雜質(zhì)，方法簡便快捷，檢驗效率高，推廣性好。

3.2 特定雜質(zhì)的確定

比較各國藥典中收載的對乙酰氨基酚原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對于已知雜質(zhì)，除USP43規(guī)定了5種雜質(zhì)的限度外，ChP2020、BP2022 均只規(guī)定了對氨基酚、對氯苯乙酰胺的限度。本研究建立的方法可以同時檢測9 種已知雜質(zhì)，但從節(jié)約檢驗成本角度出發(fā)，建議日常檢驗將對氨基酚、對氯苯乙酰胺作為特定雜質(zhì)控制，其他雜質(zhì)作為未知單雜控制。另外，為確保產(chǎn)品的安全性，建議增加對遺傳毒性雜質(zhì)（對硝基苯酚、對硝基氯苯）的控制。

3.3 雜質(zhì)限度的確定

參考各國藥典中收錄的雜質(zhì)及限度，并遵循從嚴(yán)原則，暫定普通雜質(zhì)限度標(biāo)準(zhǔn)：按外標(biāo)法以峰面積計算，對氨基酚不得過0.005% ，對氯苯乙酰胺不得過0.001%；不加校正因子的主成分自身對照法計算其他單個雜質(zhì)，不得過0.05%；各雜質(zhì)之和（即總雜）不得超過0.1%。另針對遺傳毒性雜質(zhì)，結(jié)合前面計算的限度要求，建議設(shè)定限度標(biāo)準(zhǔn)：按外標(biāo)法以峰面積計算，對硝基氯苯不得過0.02%；對硝基苯酚不得過0.06%。

本研究建立的方法能同時檢測對乙酰氨基酚原料中有關(guān)物質(zhì)（對氨基酚、對氯苯乙酰胺、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)H）及遺傳毒性雜質(zhì)（對硝基苯酚、對硝基氯苯）的含量，線性關(guān)系與精密度均良好，方法準(zhǔn)確度高，檢測下限與定量下限能滿足分析要求，此方法彌補了藥典中原料有關(guān)物質(zhì)檢測項的不足，確保了產(chǎn)品的安全性。