張 璐，劉玉瓊，巨曉潔,2，謝 銳,2，汪 偉,2，劉 壯,2，褚良銀,2

(1.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065；2. 四川大學(xué)高分子材料工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065)

癌癥嚴(yán)重影響了人們的生命健康和生活質(zhì)量。腫瘤組織特殊的血管結(jié)構(gòu)使得腫瘤具有高通透性和滯留效應(yīng)（EPR 效應(yīng)），因此納米藥物載體可以通過EPR 效應(yīng)在腫瘤部位富集，有效實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的被動(dòng)靶向[1,2]。近年來，為了進(jìn)一步提高納米藥物載體的靶向控釋效果，研究者們致力于環(huán)境刺激響應(yīng)型納米載體的研究[3]。根據(jù)環(huán)境刺激因素的種類，環(huán)境刺激響應(yīng)型納米載體可分為外源性刺激響應(yīng)型和內(nèi)源性刺激響應(yīng)型2 類。常見的外源性刺激響應(yīng)型納米載體通過響應(yīng)外源性環(huán)境刺激（如溫度、光、磁場、超聲和電場等）實(shí)現(xiàn)藥物釋放，但其通常作用于整個(gè)病變部位，釋藥行為在胞內(nèi)和胞外可能同時(shí)發(fā)生，控釋不夠精準(zhǔn)，降低了藥物的生物利用度[4,5]。內(nèi)源性刺激響應(yīng)型納米載體能夠基于人體固有的生理環(huán)境不同（如pH、還原性物質(zhì)和酶濃度等）來實(shí)現(xiàn)藥物釋放，能更加精準(zhǔn)地在病變部位甚至細(xì)胞內(nèi)部釋藥[6,7]。靶向細(xì)胞內(nèi)精準(zhǔn)的釋藥方式可以進(jìn)一步提高藥物的生物利用度，減少給藥量且降低藥物的毒副作用。因此，設(shè)計(jì)制備能靶向細(xì)胞內(nèi)部控釋給藥的納米藥物載體對于疾病精準(zhǔn)治療具有重要意義。

生物體細(xì)胞內(nèi)外的鉀離子（K+）濃度存在顯著差異，細(xì)胞內(nèi)液K+濃度大約是細(xì)胞外液K+濃度的30 倍[8]。此外，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中存在高濃度的還原性谷胱甘肽（GSH），其濃度明顯高于正常細(xì)胞內(nèi)GSH 濃度[9]。因此，基于細(xì)胞內(nèi)外K+濃度差異和腫瘤細(xì)胞高GSH 濃度，設(shè)計(jì)構(gòu)建具有K+和GSH 雙重響應(yīng)特性的納米藥物載體有望實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的精準(zhǔn)控制釋放。

因此，本文制備了一種具有K+和GSH 雙重響應(yīng)性的多功能樹狀大分子作為抗癌藥物載體。一方面，將具有K+響應(yīng)性的聚(N-異丙基丙烯酰胺-共聚-苯并-18-冠-6-丙烯酰胺)（PNB）線型高分子和具有GSH 敏感性的二硫鍵（-ss-）先后引入聚酰胺-胺型樹狀大分子（PAMAM）表面；另一方面，將末端帶有葉酸（FA）的聚乙二醇（PEG）線型高分子引入樹狀大分子的最外層。如Fig.1 所示，載藥PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子經(jīng)靜脈注射進(jìn)入體內(nèi)后，首先，最外層的親水性PEG 鏈可以延長其血液循環(huán)時(shí)間，有利于其通過EPR 效應(yīng)在腫瘤部位被動(dòng)富集；并且，在體內(nèi)遞送過程中，PNB 高分子處于收縮狀態(tài)，保護(hù)內(nèi)載藥物不被釋放[10]。然后，基于FA與腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體（FR）之間的特異性識(shí)別作用，載藥樹狀大分子會(huì)主動(dòng)靶向于腫瘤部位[11]，經(jīng)FR 介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)中高濃度的GSH 刺激下，二硫鍵-ss-發(fā)生斷裂，裸露出來的PNB 高分子特異性地識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中高濃度的K+，分子構(gòu)象由收縮狀態(tài)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，釋放出包載的抗癌藥物。這種同時(shí)具有K+和GSH 響應(yīng)性的多功能樹狀大分子為實(shí)現(xiàn)癌癥的精準(zhǔn)有效治療提供了一種新材料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

G4.0 PAMAM 樹狀大分子：威海晨源分子新材料有限公司；N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）：日本Kohjin, Co., Ltd；4-硝基苯并-18-冠-6，TCI；2,2’-二硫二吡啶（Py-S-S-Py）：上海弘邦醫(yī)藥有限公司；葉酸-聚乙二醇-巰基（FA-PEG-SH）：上海芃碩生物科技有限公司；阿霉素（DOX）：湖北康明德醫(yī)藥化工有限公司；GSH：TCI。實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水：來自Milli-Q 純水系統(tǒng)，電阻率為18.2 MΩ·cm。

納米粒度分析儀：ZEN 3690，英國Malvern；核磁共振氫譜儀(1H-NMR)：Varian-400，美國Varian；紫外-可見光分光光度計(jì)（UV-vis）：UV-1700，日本Shimadzu；傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）：IR Prestige-21，日本Shimadzu；酶標(biāo)儀：SAF-680T，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；流式細(xì)胞儀：CytoFLEx，美國Beckman Coulter；激光共聚焦顯微鏡（CLSM）：SP5，德國Leica；掃描電子顯微鏡（SEM）：JSM-IT800，美國Thermo Fisher。

1.2 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的制備

1.2.1 帶有羧基末端的PNB 線型高分子的制備：如Fig.2(a)所示，采用可逆加成斷裂自由基聚合法（RAFT）合成末端帶羧基的PNB 線型高分子。其中，三硫代碳酸酯（DMP）作為鏈轉(zhuǎn)移劑，偶氮二異丁腈（AIBN）作為引發(fā)劑，B18C6Am 參照文獻(xiàn)中的方法由4-硝基苯并-18-冠-6 合成[12]。反應(yīng)溶劑為四氫呋喃，NIPAM 和B18C6Am 作為單體，總單體濃度為0.3 mol/L，(NIPAM+B18C6Am)，DMP 和AIBN 的摩爾比為150 : 1 : 0.2，理論上B18C6Am 占總單體(NIPAM+B18C6Am)的摩爾分?jǐn)?shù)為15%。聚合反應(yīng)在70 ℃進(jìn)行24 h，產(chǎn)物用無水乙醚進(jìn)行沉淀純化，最后在40 ℃真空干燥24 h。

Fig. 1 Schematic diagram of targeted delivery and controlled release administration of PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA dendrimers in vivo

1.2.2 PAMAM-g-PNB 樹狀大分子的合成：如Fig.2(b)所示，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺（EDC）為催化劑、N-羥基琥珀酸亞胺（NHS）為羧基活化劑，通過酰胺縮合反應(yīng)將PNB 線型高分子接枝到PAMAM 樹狀大分子表面，制備PAMAM-g-PNB樹狀大分子。反應(yīng)以水為溶劑，在20 ℃反應(yīng)48 h，最后用透析法純化，冷凍干燥后得到產(chǎn)物。

1.2.3 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的合成：如Fig.2(c)所示，以正己胺為還原劑，在三丁基膦保護(hù)下對PAMAM-g-PNB 進(jìn)行還原，溶劑為四氫呋喃，25 ℃反應(yīng)2 h 得到末端帶巰基的PAMAM-g-PNB-SH；然后與二硫吡啶進(jìn)行交換反應(yīng)得到末端帶二硫鍵的PAMAM-g-PNB-ss-Py，反應(yīng)溶劑為甲醇，25 ℃反應(yīng)24 h；最后與FA-PEG-SH 高分子發(fā)生交換反應(yīng)制備得到PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子，反應(yīng)溶劑為二甲亞砜，在25 ℃避光反應(yīng)24 h，最后用透析法純化，冷凍干燥后得到最終產(chǎn)物。

Fig. 2 Synthesis route of the PNB linear polymer(a), PAMAM-g-PNB (b) and PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA(c) dendrimers

實(shí)驗(yàn)中為了進(jìn)行對比，用類似合成方法制備了不含18-冠-6 基團(tuán)的PAMAM-g-PNIPAM 樹狀大分子。

1.3 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的成分和形貌表征

利用FT-IR，1H-NMR 對合成的PNB 線型高分子，以及PAMAM-g-PNB，PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA樹狀大分子的化學(xué)成分進(jìn)行表征，并根據(jù)1H-NMR譜計(jì)算出PNB 高分子中B18C6Am 的實(shí)際含量。

用SEM 對制備得到的PAMAM-g-PNB-ss-PEGFA 樹狀大分子的形貌進(jìn)行表征。

1.4 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的K+響應(yīng)特性表征

以KCl 和NaCl 配制細(xì)胞內(nèi)外液模擬液。其中，細(xì)胞內(nèi)液模擬液中K+濃度為150 mmol/L、Na+濃度為5 mmol/L，細(xì)胞外液模擬液中K+濃度為5 mmol/L、Na+濃度為150 mmol/L[8]。

首先，將PNB 線型高分子以5 mg/mL 的濃度分別溶解于去離子水、細(xì)胞內(nèi)液模擬液和細(xì)胞外液模擬液中，測定其溫度響應(yīng)特性。利用配有溫度控制單元的UV-vis 測定高分子溶液在不同溫度、500 nm波長下的透射率，每個(gè)溫度點(diǎn)恒溫10 min，繪制出高分子溶液的透射率隨溫度變化的關(guān)系曲線。線型高分子的相變溫度（LCST）值為溶液透射率降低到其初始透射率50%時(shí)的溫度[1,2]。然后，采用相同的方法，測定PAMAM-g-PNB 和PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子在去離子水、細(xì)胞內(nèi)液模擬液和細(xì)胞外液模擬液中的溫度響應(yīng)特性，評價(jià)其相應(yīng)LCST 變化。

1.5 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的還原響應(yīng)特性表征

以pH=7.4 的PBS 緩沖液配制了不同濃度的GSH 溶液來模擬細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液。其中，細(xì)胞內(nèi)液模擬液中GSH 濃度為10μmol/L，細(xì)胞外液模擬液中GSH 濃度為10 mmol/L。稱取一定量的樹狀大分子，以0.25 mg/mL 的濃度分別溶解于PBS 緩沖液、細(xì)胞內(nèi)液模擬液和細(xì)胞外液模擬液中，然后將各溶液轉(zhuǎn)移至溫度37 ℃的恒溫?fù)u床中，分別于0 min，15 min，30 min，45 min，60 min 時(shí)利用納米粒度儀測定樹狀大分子在不同溶液中水合半徑的變化。

1.6 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的體外藥物釋放研究

PAMAM 可通過疏水作用包載疏水性藥物。本實(shí)驗(yàn)使用DOX 作為模型藥物，制備載藥的PAMAMg-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子，簡寫為PSSPFA@DOX。 作為對照，還制備了負(fù)載DOX 的PAMAM-g- PNIPAM 樹 狀 大 分 子（ 簡 寫 為PNA@DOX）和負(fù)載DOX 的PAMAM-g-PNB 樹狀大分子（簡寫為PNBA@DOX）。

分別在不同的細(xì)胞內(nèi)外液模擬液中利用UV-vis測定了PSSP-FA@DOX 的藥物釋放曲線，考察PSSPFA@DOX 的K+和GSH 響應(yīng)性藥物釋放行為。

1.7 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的細(xì)胞毒性考察與其細(xì)胞內(nèi)釋放表征

采用CCK-8 法，利用酶聯(lián)免疫檢測儀對PAMAM，PAMAM-g-PNIPAM，PAMAM-g-PNB 和PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 4 種空白載體材料進(jìn)行安全性評價(jià)，對PSSP-FA@DOX 的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價(jià)。

DOX 能夠在一定波長下產(chǎn)生熒光，利用CLSM定性觀察了載藥樹狀大分子進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。同時(shí)用Hochest 33342 染色標(biāo)記細(xì)胞核，通過觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光情況表征藥物在細(xì)胞內(nèi)的釋放行為。

2 結(jié)果與討論

2.1 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的成分和形貌分析

PAMAM 樹狀大分子，以及合成得到的PNB 線型高分子、PAMAM-g-PNB 和PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的FT-IR 表征如Fig.3(a)所示。PAMAM 的FT-IR 譜 圖 中，3276 cm-1處 為 酰 胺 基 上—NH—的伸縮振動(dòng)吸收峰，2945 cm-1和2850 cm-1處為—CH2—的伸縮振動(dòng)吸收峰，1659 cm-1和1559 cm-1處為酰胺I 帶和II 帶的吸收峰。PNB 的FT-IR 譜圖中，1388 cm-1和1367 cm-1處出現(xiàn)了NIPAM 異丙基中甲基的對稱彎曲振動(dòng)吸收峰，1650 cm-1處是NIPAM 酰胺羰基的伸縮振動(dòng)峰；同時(shí)，1502 cm-1附近出現(xiàn)了B18C6Am 苯環(huán)的C=C 骨架伸縮振動(dòng)吸收峰，在1134 cm-1處出現(xiàn)了Ar—O—C 的C—O 不對稱伸縮振動(dòng)吸收峰，這些特征峰說明成功制備得到了PNB 線型高分子。PAMAM-g-PNB 的FT-IR 譜圖中同時(shí)出現(xiàn)了PAMAM 與PNB 的特征峰，且與PAMAM 對比，3480 cm-1附近的氨基特征峰減弱，這是因?yàn)镻NB 末端羥基與PAMAM 末端的氨基發(fā)生酰胺縮合，也進(jìn)一步證明了PNB 成功接枝到PAMAM 上。PAMAM-g-PNBss-PEG-FA 的FT-IR 譜圖中除了有PAMAM，PNB 的特征峰外，在1110 cm-1處的吸收峰為FA-PEG-SH 中C—O 的伸縮振動(dòng)吸收峰，說明成功將PNB 和FAPEG-SH 依次接枝到PAMAM 上得到目標(biāo)產(chǎn)物PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA。

Fig. 3 FT-TR spectra of PAMAM, PNB, PAMAM-g-PNB and PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA(a);1H-NMR spectrum of PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA(b)

利 用1H- NMR 對PNB，PAMAM-g- PNB 和PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子分別進(jìn)行表征。PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 的1H-NMR 圖 譜 中 同時(shí)出現(xiàn)了NIPAM，B18C6Am，PAMAM 和FA-PEG-SH的特征峰（Fig.3(b)），同樣證明了PNB 高分子和FAPEG-SH 高分子被成功接枝到PAMAM 樹狀大分子上。同時(shí)，根據(jù)PNB 線型高分子的1H-NMR 圖譜可以計(jì)算出線型高分子中冠醚單元的實(shí)際含量為14.9%。

采用SEM 對PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的形貌進(jìn)行表征，結(jié)果如Fig.4 所示?？梢钥闯觯琍AMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的平均粒徑在130 nm 左右，是一種表面具有類似“蘑菇狀”褶皺結(jié)構(gòu)的類球形顆粒。

Fig. 4 SEM photo of PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA dendrimers(scale: 100 nm)

2.2 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的K+響應(yīng)性

采用UV-vis 測定比較了PNB，PAMAM-g-PNB和PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 在不同濃度K+溶液中的溫度響應(yīng)特性，比較其LCST 遷移行為，進(jìn)而評價(jià)其K+響應(yīng)特性，結(jié)果如Fig.5 所示。

Fig. 5 Curves of light transmittance with temperature of aqueous solution, extracellular fluid simulation solution and intracellular fluid simulation solution containing PNB

可以看出，隨著K+濃度從5 mmol/L 升高到150 mmol/L，3 種高分子的LCST 都相應(yīng)升高，這是由于PNB 高分子中的B18C6Am 能夠與溶液中的K+形成1:1 的主客體絡(luò)合物，絡(luò)合物間相互排斥使得高分子的親水性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致3 種高分子的LCST 均往高溫遷移。雖然，在細(xì)胞內(nèi)外液模擬液中還存在不同濃度的Na+，但由于Na+尺寸與B18C6Am 空腔不匹配，無法形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，因此，Na+對高分子的LCST 不會(huì)產(chǎn)生影響。還可以看出，將PNB 接枝到PAMAM 樹狀大分子上后，高分子的K+響應(yīng)性不受影響，但因?yàn)镻AMAM 樹狀大分子具有親水性，所以PAMAM-g-PNB 高分子受K+誘導(dǎo)的的LCST 遷移比PNB 高分子要大。同時(shí)，PEG 高分子鏈也具有親水性，因此PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 的LCST 遷移得更多。

另一方面，3 種高分子在細(xì)胞外液模擬液中的LCST 都低于37 ℃，而在細(xì)胞內(nèi)液模擬液中的LCST都高于37 ℃。這意味著在體溫37 ℃下，當(dāng)PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 所處環(huán)境從細(xì)胞外液變成細(xì)胞內(nèi)液時(shí)，樹狀大分子中的PNB 鏈段將由疏水收縮狀態(tài)變成親水伸展?fàn)顟B(tài)，負(fù)載藥物快速釋放，如此可實(shí)現(xiàn)靶向細(xì)胞內(nèi)藥物控制釋放。

2.3 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的GSH響應(yīng)性

利用納米粒度儀測定了PAMAM-g-PNB-ss-PEGFA 樹狀大分子在不同濃度GSH 溶液中（pH7.4）的粒徑變化來考察其GSH 響應(yīng)性。如Fig.6 所示，PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 在GSH = 10μmol/L 的 細(xì)胞外液模擬液中，其粒徑在60 min 內(nèi)未發(fā)生明顯變化；而在GSH = 10 mmol/L 的細(xì)胞內(nèi)液模擬液中，PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 的粒徑明顯變小，這是由于在高濃度GSH 下，PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 結(jié)構(gòu)中的二硫鍵發(fā)生斷裂，PEG 從樹狀大分子上分離，導(dǎo)致其表面水化層減少，粒徑減小。這意味著，在血液循環(huán)中，PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，藥物被很好地包封在樹狀大分子內(nèi)；當(dāng)PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 被腫瘤細(xì)胞攝取后，在高濃度GSH 刺激下，二硫鍵斷裂，樹狀大分子發(fā)生初步解離，協(xié)同后續(xù)K+響應(yīng)性，最終實(shí)現(xiàn)靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物釋放。

Fig. 6 Particle size of PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA at the GSH concentration of 10 μmol/L(a) and 10 mmol/L(b)

2.4 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的體外藥物釋放

Fig.7(a)是37 ℃下PSSP-FA@DOX 在含有不同濃度K+的細(xì)胞內(nèi)外液模擬液中的藥物釋放曲線?？梢钥闯?，DOX 從樹狀大分子中的釋放行為具有明顯的K+響應(yīng)性。在K+濃度為5 mmol/L 的細(xì)胞外液模擬液中，藥物釋放緩慢，96 h 時(shí)才基本達(dá)到平衡，累積釋藥率為30.1%。但在K+濃度為150 mmol/L 的細(xì)胞內(nèi)液模擬液中，PSSP-FA@DOX 具有較快的釋藥速率，124 h 左右達(dá)到釋放平衡，累積釋藥率為72.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA樹狀大分子受K+誘導(dǎo)的藥物控釋性能。

Fig.7 Drug release curves of PSSP- FA@DOX in low concentration potassium solution (5 mmol/L), in high concentration potassium solution (150 mmol/L) (a), and in low concentration GSH solution(10 μmol/L), in high concentration GSH solution (10 mmol/L)

Fig.7(b)是37 ℃下PSSP-FA@DOX 在不同濃度GSH 溶液中的藥物釋放行為?？梢钥闯觯贕SH 濃度為10μmol/L 的溶液中，DOX 從樹狀大分子中的釋放比較緩慢，其累積釋藥率為24.4%。而在模擬細(xì)胞內(nèi)的條件下（pH7.4，GSH = 10 mmol/L），DOX從樹狀大分子中的釋放比較迅速，累積釋藥率達(dá)到57.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣驗(yàn)證了PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子受GSH 刺激的藥物控釋性能。

以上結(jié)果說明，PSSP-FA@DOX 能夠在正常的血液循環(huán)系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，藥物釋放較少；而當(dāng)PSSP-FA@DOX 通過被動(dòng)及主動(dòng)靶向作用到達(dá)腫瘤部位并進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部后，能夠在細(xì)胞內(nèi)的高K+、高GSH 環(huán)境刺激下，快速釋放藥物，發(fā)揮其抗腫瘤作用。

2.5 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的生物相容性

通過CCK-8 實(shí)驗(yàn)，采用2 種腫瘤細(xì)胞（HeLa 和4T1）和1 種正常細(xì)胞（L929）來考察PNB 線型高分子，以及PAMAM，PAMAM-g-PNIPAM，PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 這3 種空白樹狀大分子的細(xì)胞毒性，結(jié)果如Fig.8 所示。

Fig. 8 Cytotoxicity of PNB, PAMAM, PAMAM-g-PNIPAM, PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA in different concentrations after incubation with HeLa cells (a), 4T1 cells (b) and L929 cells (c) for 48 h

Fig. 9 CLSM photos of 4T1 cells after incubation with free DOX, PNA@DOX, PNBA@DOX and PSSP- FA@DOX for 2 h, 6 h and 16 h

可以看出，未經(jīng)修飾的PAMAM 樹狀大分子對3種細(xì)胞均有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，特別是在濃度達(dá)到300μg/mL 時(shí)，正常L929 細(xì)胞的存活率低于40%，這是因?yàn)镻AMAM 表面帶有許多伯氨基，在生理?xiàng)l件下帶正電荷，容易破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。相比之下，表面接枝了PNIPAM 的PAMAM-g-PNIPAM 樹狀大分子，細(xì)胞毒性顯著減小，這可能是因?yàn)镻NIPAM 的加入降低了PAMAM 表面的電荷。另外，接枝了PNB 的PAMAM-g-PNB，其細(xì)胞毒性略高于PAMAM-g-PNIPAM，這可能是因?yàn)楣诿鸦鶊F(tuán)具有一定的生物毒性。最終產(chǎn)物PAMAM-g-PNB-ss-PEGFA 樹狀大分子，由于表面修飾了具有良好生物相容性的PEG，其細(xì)胞毒性相對PAMAM-g-PNB 降低，即使在濃度達(dá)到300μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率仍可以達(dá)到85%以上。結(jié)果表明，PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA樹狀大分子在使用范圍內(nèi)幾乎無細(xì)胞毒性，可以作為一種具有良好生物相容性的納米給藥載體材料。

2.6 PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的細(xì)胞攝取

以4T1 作為模型細(xì)胞，采用CLSM 來觀察載藥樹狀大分子進(jìn)入細(xì)胞后，DOX 在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，結(jié)果如Fig.9 所示。可以看出，游離DOX 組和載藥樹狀大分子組的細(xì)胞中均能觀察到紅色熒光，并且紅色熒光強(qiáng)度隨著孵育時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，表明4T1 細(xì)胞對游離DOX 和載藥樹狀大分子的攝取具有時(shí)間依賴性。在相同孵育時(shí)間內(nèi)，游離DOX組的紅色熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于載藥樹狀大分子組，這是由于，DOX 能夠通過自由擴(kuò)散快速進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并直接作用于細(xì)胞核，而載藥樹大分子需要通過內(nèi)吞作用才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外，3 個(gè)載藥樹狀大分子組的4T1 細(xì)胞的細(xì)胞核中紅色熒光隨著孵育時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，并且呈現(xiàn)PSSP-FA@DOX ＞PNBA-DOX ＞PNA@DOX 的規(guī)律，這可能是由于PNBA-DOX 能夠響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的高濃度K+信號并釋放藥物，而PSSP-FA@DOX 能夠同時(shí)響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)高濃度K+和GSH 信號，促進(jìn)藥物更快速地釋放。

2.7 載藥PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子的細(xì)胞毒性

選擇4T1 細(xì)胞來考察載藥樹狀大分子的細(xì)胞毒性，結(jié)果如Fig.10 所示。從圖中可以看出，游離DOX 與載藥樹狀大分子對4T1 細(xì)胞均表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴的細(xì)胞毒性。在相同給藥劑量下（尤其是高劑量），PNBA@DOX 對4T1 細(xì)胞的毒性明顯大于PNA@DOX，這是由于在細(xì)胞內(nèi)液高K+濃度條件下，PNBA@DOX 樹狀大分子中的PNB 鏈由疏水收縮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水伸展?fàn)顟B(tài)，快速釋放DOX；而PNA@DOX 樹狀大分子沒有K+響應(yīng)性，在細(xì)胞內(nèi)液仍然保持收縮狀態(tài)，藥物釋放緩慢，從而表現(xiàn)出較低的腫瘤細(xì)胞殺傷力。此外，PSSP-FA@DOX 對腫瘤細(xì)胞的毒性略大于PNBA@DOX，這是由于PSSPFA@DOX 同時(shí)具有K+和GSH 響應(yīng)性，在細(xì)胞內(nèi)高濃度K+和GSH 環(huán)境中，PNB 鏈發(fā)生分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變，同時(shí)二硫鍵斷裂使得PEG 鏈段分離，兩者共同作用促進(jìn)了藥物的胞內(nèi)釋放，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

Fig. 10 Antitumor activity of free DOX, PNA@DOX, PSSP- FA@DOX and PNBA@DOX with different DOX concentrations after incubation with 4T1 cells for 24 h (a), 48 h (b) and 72 h (c)

3 結(jié)論

本文成功制備了一種同時(shí)具K+和GSH 雙重響應(yīng)性的樹狀大分子PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA。37 ℃下，PAMAM-g-PNB-ss-PEG-FA 樹狀大分子在高鉀溶液中成功實(shí)現(xiàn)了K+誘導(dǎo)的收縮-伸展分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變；同時(shí)，該樹狀大分子在低濃度GSH 溶液中，粒徑無明顯變化，而在高濃度GSH 溶液中，由于二硫鍵的斷裂，樹狀大分子的粒徑減小至初始粒徑的50%，表現(xiàn)出良好的GSH 響應(yīng)性。以抗腫瘤藥DOX為模型藥物，載藥樹狀大分子表現(xiàn)出明顯的高濃度K+和高濃度GSH 誘導(dǎo)下的快速釋藥行為。在一定濃度范圍內(nèi)，所制備的空白樹狀大分子對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均無明顯的毒性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，負(fù)載DOX 的樹狀大分子能夠被4T1 細(xì)胞攝取，并且在細(xì)胞內(nèi)高濃度K+和高濃度GSH 環(huán)境下可以快速釋放藥物，而且釋放的藥物能有效地殺死腫瘤細(xì)胞。該多功能樹狀大分子有望作為納米載體實(shí)現(xiàn)靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物精準(zhǔn)釋放。