許珂嘉 張子蒙 付傳奎 陳志鵬 李偉東 吳麗

關(guān)鍵詞黃芩素;漢黃芩素;肝癌細胞;能量代謝;糖酵解代謝表型;線粒體能量代謝

以有氧糖酵解為代表的能量代謝重編程是腫瘤細胞的重要特征，常伴有不同程度的線粒體能量代謝異常[1]。這種代謝變化是腫瘤細胞為滿足快速增殖需要，在提供一定數(shù)量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的同時，為蛋白質(zhì)、脂類和核酸等生物大分子的合成提供充足的中間體，并實現(xiàn)細胞能量代謝與物質(zhì)代謝相平衡的一種適應(yīng)性改變[1-5]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)很多腫瘤細胞的能量代謝出現(xiàn)了糖酵解和氧化磷酸化均顯著增強的特點，且在不同條件下存在顯著的異質(zhì)性和可塑性，能夠影響疾病的進展與轉(zhuǎn)歸[6-9]。這種能量代謝表型的改變?yōu)榭鼓[瘤治療提供了潛在的治療靶點。

現(xiàn)代研究表明，黃芩中的有效成分主要為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等，其中黃芩素和漢黃芩素具有共同的母核，黃芩素含有3 個相鄰羥基，而漢黃芩素中的1 個羥基被甲氧基取代，兩者同為黃芩抗腫瘤作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[10-11]。作者團隊前期的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果提示，黃芩素、漢黃芩素可通過抑制腫瘤細胞的能量代謝產(chǎn)生抗腫瘤作用[12]。本文旨在研究黃芩素和漢黃芩素影響肝癌細胞能量代謝的不同作用特點，分析兩者影響肝癌細胞能量代謝的構(gòu)效關(guān)系，以期為黃芩素和漢黃芩素的抗腫瘤作用機制研究提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器

A1301026 型低溫高速離心機購自上海艾測電子科技有限公司;SW-CJ-1G型雙人無菌操作臺購自蘇州市蘇杭科技器材有限公司;INCO108 型CO2細胞培養(yǎng)箱購自德國Memmert 公司;Seahorse XF96 生物能量檢測儀購自美國Seahorse Bioscience 公司;CKX-31 倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司;KQ5200DB臺式數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司;BP121S 電子分析天平購自瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 藥物與試劑

黃芩素（純度≥98%，批號H-018-170427）、漢黃芩素（純度≥98%，批號H-019-180823）標準品購自中國藥品生物制品檢定所;MTT（批號23305-68-2）、線粒體酶復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ（CⅠ～Ⅴ）抗體（批號分別為12444-1-AP、14865-1-AP、10894-1-AP、55070-1-AP、15999-1-AP）、己糖激酶（hexokinase，HK）抗體（批號22029-1-AP）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）抗體（批號55028-1-AP）、丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）抗體（批號15822-1-AP）、ATP5F1 抗體（貨號15999-1-AP）、NDUFS1 抗體（貨號12444-1-AP）、PK-Specific 抗體（貨號15822-1-AP）、CYB5R3 抗體（貨號10894-1-AP）、HK2抗體（貨號13105-1-AP）、MTCO2抗體（貨號55070-1-AP）、SDHA 抗體（貨號14865-1-AP）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體和羊抗兔IgG 二抗購自美國Proteintech 公司;二甲基亞砜（批號BCBR6170V）購自北京索萊寶科技有限公司;2- 脫氧-D- 葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG，批號BCBC9986V）、寡霉素（ATP 合酶阻滯劑，批號089K7008V）、魚藤酮（CⅠ抑制劑，批號MKBZ2534V）、線粒體壓力測試試劑盒（貨號103015-100）、糖酵解壓力測試試劑盒（貨號103020-100）購自美國Seahorse Bioscience公司;抗霉素A（C Ⅲ 抑制劑，貨號MS0070-10MG）購自上海懋康生物科技有限公司;RIPA裂解液（貨號P0013K）、苯甲基磺酰氟（PMSF，貨號ST506）、TBST緩沖液（貨號P0231）、增強型ATP 檢測試劑盒（批號112614170503）、BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒（批號102815160401）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 細胞

人肝癌HepG2細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

2 方法

2.1 HepG2 細胞活力檢測

取對數(shù)生長期的HepG2 細胞接種至96 孔板中，每孔含1×104 個細胞，于37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。根據(jù)作者團隊前期實驗結(jié)果[12]，將細胞分為空白對照組（不給藥）、黃芩素不同劑量組和漢黃芩素不同劑量組（均為1.25、2.5、5、10、20 μmol/L），分別加入相應(yīng)劑量的黃芩素和漢黃芩素培養(yǎng)24 h，每組設(shè)6 個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入0.5% MTT 溶液20 μL，37 ℃孵育4 h后，每孔加入100 μL 二甲基亞砜振蕩10 min，在450 nm波長處檢測吸光度（A）值，計算得6 個復(fù)孔的平均A值。細胞生長抑制率（%）=（1-給藥組平均A 值/空白對照組平均A 值）×100%，利用SPSS 軟件計算2 種藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.2 HepG2 細胞中ATP濃度檢測

采用增強型ATP 檢測試劑盒檢測。將HepG2 細胞接種至48 孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每孔含2.5×104個細胞。根據(jù)“2.1”項下篩選結(jié)果，以不影響細胞活力為前提，將細胞分為空白對照組（不給藥）、黃芩素組、漢黃芩素組，分別加入相應(yīng)劑量的黃芩素和漢黃芩素培養(yǎng)12 h，每組6 個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，檢測細胞中ATP 濃度，再通過BCA 蛋白分析試劑盒將細胞內(nèi)的ATP濃度標準化為蛋白質(zhì)含量。

2.3 HepG2 細胞糖酵解壓力測試和線粒體壓力測試

將HepG2 細胞接種至96 孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每孔含5×103個細胞。根據(jù)“2.2”項下方法進行細胞分組、給藥，培養(yǎng)12 h，每組6 個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，采用帶有糖酵解和線粒體壓力測試試劑盒的生物能量檢測儀分別檢測細胞外酸化率和細胞耗氧率，評價細胞糖酵解及線粒體能量代謝水平。細胞使用測定培養(yǎng)基洗滌后，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。在糖酵解壓力測試中，于22 min時加入10 mmol/L葡萄糖，檢測基礎(chǔ)細胞外酸化率;于44 min時加入1 μmol/L寡霉素，檢測細胞最大酸化率，即細胞的最大糖酵解水平;于72 min 時加入50 mmol/L 2-DG，檢測細胞非糖酵解的酸化率。在線粒體壓力測試中，基礎(chǔ)耗氧率為加入寡霉素前的細胞耗氧率;于22 min 時加入0.5 μmol/L寡霉素;于44 min 時加入試劑盒自帶的氧化磷酸化解偶聯(lián)劑FCCP（0.5 μmol/L），檢測最大細胞耗氧率，呼吸儲備功能為最大細胞耗氧率與基礎(chǔ)細胞耗氧率之間的差異;于72 min 時加入0.5 μmol/L魚藤酮和0.5 μmol/L抗霉素A，檢測細胞非線粒體呼吸水平。

2.4 黃芩素和漢黃芩素影響能量代謝的靶點預(yù)測

以糖酵解、線粒體能量代謝關(guān)鍵酶（表1）為研究對象，使用分子對接技術(shù)分析黃芩素和漢黃芩素影響能量代謝的可能作用靶點。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB，http：//www.pdb.org）下載三維晶體結(jié)構(gòu)[13]。將受體的晶體結(jié)構(gòu)坐標加載到Discovery Studio 4 軟件，默認格式為線性結(jié)構(gòu)模型，優(yōu)化處理后保存?zhèn)溆?。使用ChemBioDrawUltra 12.0 軟件制備黃芩素和漢黃芩素的配體分子，并進行能量最小化優(yōu)化[14]。采用Discovery Studio 4 軟件的CDOCKER模塊對黃芩素和漢黃芩素與8 種能量代謝關(guān)鍵酶的蛋白質(zhì)分子對接，使用Compute 模塊下的3D質(zhì)子化功能，可自動優(yōu)化氫原子并對其質(zhì)子化[15-16]。按照上述方法將蛋白質(zhì)的能量進行最小化優(yōu)化，選擇分子對接結(jié)果顯示最有利的結(jié)合模式和負CDOCKER相互作用的最高能量值。目標蛋白（能量代謝關(guān)鍵酶）和不同化學(xué)成分結(jié)合力的強度通過能量值的大小來評估，以能量值的絕對值7 為劃分親和力強弱的界限，其絕對值越大，表示兩者間親和力越強，是藥物作用靶點的可能性越大[17]。

2.5 HepG2 細胞中能量代謝關(guān)鍵酶表達的檢測

采用Western blot 法檢測。將HepG2 細胞接種至6孔板中，每孔含0.5×106～1.0×106個細胞。根據(jù)“2.2”項下方法進行細胞分組、給藥，培養(yǎng)24 h，每組6 個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，PBS 洗滌細胞2 次，裂解后采集細胞提取物。采用裂解緩沖液（由RIPA裂解液、PMSF 以100 ∶1比例組成）冰上采集細胞提取物，以12 000 r/min 于4 ℃離心5 min，取上清液，采用BCA 試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。將5×加樣緩沖液與標本蛋白按1 ∶4 比例混勻，沸水浴10 min，以12 000 r/min 于4 ℃離心10 min，取上清液，根據(jù)檢測的蛋白濃度確定上樣量，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（10%分離膠）。上樣后先用40mA跑120 min，再以100 V轉(zhuǎn)膜100 min，然后用5%BSA封閉液在4 ℃環(huán)境下封閉2 h;加入內(nèi)參抗體β-actin 和各一抗（ATP5F1、NDUFS1、PK-Specific、CYB5R3、HK2、MTCO2、SDHA、PKM2，稀釋度均為1 ∶ 100），4 ℃孵育過夜;1×TBST 洗膜6 次，每次5 min，加入二抗（稀釋度1 ∶200），4 ℃孵育1 h;1×TBST洗膜6 次，每次5 min。利用暗室顯影技術(shù)采集化學(xué)發(fā)光圖像。用Image Lab 軟件進行圖像分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x±s 表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用Scheffe檢驗，檢驗水準α=0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃芩素和漢黃芩素對HepG2 細胞活力的影響

MTT 實驗結(jié)果顯示，在2.5～20 μmol/L 劑量范圍內(nèi)，黃芩素和漢黃芩素均能抑制HepG2 細胞增殖（P<0.05），且呈劑量依賴趨勢。進一步計算IC50值，其中黃芩素的IC50值為12.84 μmol/L、漢黃芩素為24.09 μmol/L，提示黃芩素對HepG2 細胞活力的抑制作用較漢黃芩素更強。為排除細胞活力過低對能量代謝相關(guān)指標的影響，后續(xù)實驗采用對細胞活力無顯著影響的劑量開展研究，即黃芩素1.25 μmol/L 為黃芩素組劑量，漢黃芩素2.5 μmol/L為漢黃芩素組劑量。結(jié)果見圖1。

3.2 黃芩素和漢黃芩素對HepG2 細胞中ATP 濃度的影響

ATP檢測結(jié)果顯示，與空白對照組[（148.10±12.48）nmol/mg pro]比較，黃芩素組[（127.74±6.05）nmol/mgpro]、漢黃芩素組[（122.65±4.71）nmol/mg pro] HepG2細胞中ATP 濃度顯著降低（P<0.05），提示黃芩素和漢黃芩素均能明顯降低HepG2細胞中的ATP濃度。

3.3 黃芩素和漢黃芩素對HepG2 細胞糖酵解的影響

糖酵解壓力測試結(jié)果顯示，與空白對照組比較，黃芩素組、漢黃芩素組HepG2 細胞基礎(chǔ)酸化率均顯著降低（P<0.05），表明其能明顯降低細胞糖酵解水平;且給予寡霉素抑制ATP 合成酶的活性后，2 個給藥組細胞最大酸化率均較空白對照組顯著降低（P<0.01），提示黃芩素和漢黃芩素不僅能直接抑制糖酵解，還能抑制細胞在應(yīng)激狀態(tài)下能量代謝表型的轉(zhuǎn)變。進一步比較黃芩素組、漢黃芩素組的結(jié)果顯示，漢黃芩素組細胞基礎(chǔ)酸化率較黃芩素組顯著降低（P<0.05），提示漢黃芩素對糖酵解的抑制作用較黃芩素更強。結(jié)果見圖2。

3.4 黃芩素和漢黃芩素影響糖酵解能量代謝關(guān)鍵酶的靶點預(yù)測結(jié)果

分子對接評估黃芩素和漢黃芩素與糖酵解能量代謝關(guān)鍵酶HK、PFK、PKM2 相互作用的結(jié)合能量值，結(jié)果顯示，黃芩素和漢黃芩素與PKM2 對接的最大能量值分別為-7.904、-7.626 kJ/mol，親和力較強;黃芩素和漢黃芩素與HK、PFK 對接的最大能量值的絕對值均小于7，親和力較弱。

進一步分析黃芩素和漢黃芩素與PKM2 的作用力發(fā)現(xiàn)，黃芩素與PKM2 的作用以氫鍵、范德華力為主，而漢黃芩素與PKM2 之間的作用力主要為范德華力。分析原因為：黃芩素有2 個芳香環(huán)、3 個相鄰羥基，在分子結(jié)構(gòu)上共軛程度強，電子傳遞能力強，易與糖酵解關(guān)鍵酶形成穩(wěn)定氫鍵，結(jié)合力更強;而漢黃芩素只有2 個相鄰羥基，與糖酵解關(guān)鍵酶形成穩(wěn)定氫鍵的結(jié)合力較弱[18]。該結(jié)果部分解釋了黃芩素和漢黃芩素對糖酵解的抑制機制。

3.5 黃芩素和漢黃芩素對HepG2 細胞糖酵解能量代謝關(guān)鍵酶表達的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，漢黃芩素組HepG2 細胞中HK、PFK、PKM2 的蛋白表達水平顯著降低（P<0.05 或P<0.01），提示下調(diào)糖酵解關(guān)鍵酶表達是漢黃芩素抑制HepG2 細胞能量代謝的重要機制;黃芩素組糖酵解關(guān)鍵酶的蛋白表達水平雖有下降趨勢，但與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），綜合分子對接結(jié)果，提示黃芩素可能通過抑制PKM2 蛋白活性進而抑制糖酵解。結(jié)果見圖3。

3.6 黃芩素和漢黃芩素對HepG2 細胞線粒體能量代謝的影響

線粒體壓力測試結(jié)果顯示，與空白對照組比較，黃芩素組、漢黃芩素組細胞的基礎(chǔ)耗氧率均顯著降低（P<0.05 或P<0.01），提示這2 種成分能干預(yù)線粒體呼吸鏈的氧化還原反應(yīng)，降低細胞的線粒體能量代謝水平。給予寡霉素后，黃芩素組、漢黃芩素組細胞耗氧率均明顯下降，但與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

給予FCCP后，細胞耗氧率顯著增加，迅速達到最大耗氧率;與空白對照組比較，黃芩素組、漢黃芩素組均能降低HepG2 細胞的最大耗氧率，其中黃芩素組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示黃芩素和漢黃芩素能不同程度地抑制線粒體能量代謝的呼吸儲備功能。結(jié)果見圖4。

黃芩素和漢黃芩素對HepG2 細胞線粒體能量代謝均有不同程度的影響，分析原因如下：（1）在肝癌細胞中，線粒體能量代謝被激活，氧化磷酸化作用異常強烈，導(dǎo)致藥物作用明顯[19];（2）氧化磷酸化的關(guān)鍵酶均集中在線粒體膜上，而細胞內(nèi)線粒體數(shù)量多（每個細胞約含1 000 個線粒體），導(dǎo)致藥物作用靶點較多且集中[20]。

3.7 黃芩素和漢黃芩素影響HepG2 細胞線粒體能量代謝關(guān)鍵酶的靶點預(yù)測結(jié)果

分子對接評估黃芩素和漢黃芩素與線粒體能量代謝關(guān)鍵酶CⅠ～Ⅴ相互作用的結(jié)合能量值，結(jié)果顯示，黃芩素具有最有利的構(gòu)象，易與CⅠ、CⅡ、CⅣ蛋白上的活性位點結(jié)合，其對接的最大能量值分別為-7.786、-7.030、-7.693 kJ/mol;而漢黃芩素可與CⅠ、CⅡ、CⅣ蛋白結(jié)合，但親和力較弱，其最大能量值的絕對值均小于7。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，黃芩素可與CⅠ（氫鍵、共價鍵）、CⅡ（氫鍵、共價鍵）、CⅣ（氫鍵、共價鍵）相互作用。分析原因為：黃芩素和漢黃芩素均有2 個芳香環(huán);黃芩素有3 個相鄰羥基，易與受體蛋白的氨基酸殘基形成穩(wěn)定的氫鍵，與線粒體能量代謝關(guān)鍵酶親和力強，易形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu);漢黃芩素有1 對間位羥基，且相鄰1 個甲氧基，具有較大的空間位阻，影響氫鍵的形成[21]，故與受體蛋白的親和力較弱。該結(jié)果部分解釋了黃芩素和漢黃芩素對線粒體能量代謝的抑制機制。

3.8 黃芩素和漢黃芩素對HepG2 細胞線粒體能量代謝關(guān)鍵酶表達的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，漢黃芩素組細胞中CⅠ、CⅡ、CⅣ的蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05 或P<0.01），而黃芩素組細胞中線粒體能量代謝關(guān)鍵酶的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示黃芩素主要與關(guān)鍵酶結(jié)合，通過影響關(guān)鍵酶的催化活性來調(diào)節(jié)HepG2細胞的能量代謝。結(jié)果見圖5。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，黃芩素和漢黃芩素均能降低HepG2細胞糖酵解和線粒體能量代謝水平，抑制細胞能量代謝。更重要的是，兩者均能降低HepG2 細胞線粒體能量代謝的儲備能力，抑制細胞應(yīng)激狀態(tài)下糖酵解和線粒體能量代謝的轉(zhuǎn)化功能，導(dǎo)致細胞對惡劣環(huán)境的適應(yīng)能力減弱。

進一步實驗表明，黃芩素與PKM2、CⅠ、CⅡ、CⅣ蛋白的親和力強，但對其蛋白表達水平無顯著影響，推測這可能與黃芩素具有3 個相鄰羥基有關(guān)：一方面黃芩素容易與蛋白上的活性位點形成穩(wěn)定的氫鍵，表現(xiàn)出強親和力，結(jié)合力更高;另一方面黃芩素易失去氫質(zhì)子使區(qū)域內(nèi)電負性增強，而線粒體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜向內(nèi)折入形成嵴，內(nèi)膜外側(cè)帶正電，內(nèi)膜內(nèi)側(cè)帶負電，形成約-180 mV的膜電位[22-24]，且黃芩素易溶于脂溶性溶劑，故黃芩素可能更容易進入線粒體，從而干預(yù)能量代謝關(guān)鍵酶的功能，抑制細胞能量代謝。漢黃芩素只與PKM2 蛋白的結(jié)合力較強，這可能與漢黃芩素除含有2個羥基外還引入了甲氧基有關(guān)，較大的空間位阻阻礙了較多氫鍵的形成，故與蛋白的親和力較弱[24]。Westernblot 結(jié)果提示，漢黃芩素可顯著下調(diào)HK、PFK、PKM2、CⅠ、CⅡ、CⅣ蛋白的表達，其抑制能量代謝的機制與下調(diào)能量代謝關(guān)鍵酶的表達有關(guān)。

綜上所述，黃芩素和漢黃芩素均能抑制肝癌細胞能量代謝，但作用機制不同：黃芩素的作用與影響關(guān)鍵酶活性有關(guān)，而漢黃芩素的作用與抑制能量代謝關(guān)鍵酶表達有關(guān)。