阿曼古麗·艾則孜 馬紅梅 蘭衛(wèi)

關(guān)鍵詞洋甘菊總黃酮;脂質(zhì)沉積;降脂作用

近年來，隨著社會的飛速發(fā)展和人們物質(zhì)生活水平不斷提高，高脂血癥患者不斷增加，發(fā)病率逐年升高[1]。

游離脂肪酸（non-esterified fatty acids，F(xiàn)FA）、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）中的1種及以上升高或脂蛋白水平升高即可診斷為高脂血癥[2]。該病可引發(fā)如心肌梗死、心臟猝死、糖尿病、高血壓、脂肪肝等一系列疾病，是形成冠心病的主要原因之一[3]，因此，對高脂血癥的預(yù)防與治療意義重大。洋甘菊是菊科母菊屬，又稱德國洋甘菊，為菊科植物洋甘菊Matricaria chamomilla L.的干燥花或全草。洋甘菊具有降低血壓、降低膽固醇、發(fā)汗通便等功效，其提取物（如黃酮類）具有抗炎、抗氧化、抗肝毒性、抗病毒、保護血管和解痙等作用[4-5]。本實驗采用油酸和棕櫚酸聯(lián)合誘導HepG2 細胞建立脂質(zhì)沉積細胞模型，探討洋甘菊總黃酮對肝脂質(zhì)異常的調(diào)節(jié)作用及其降脂機制，以期為洋甘菊治療高脂血癥的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

STS-2 型脫色搖床購自上海琪特分析儀器有限公司;Benchmark Plus 型全波長酶標儀、Power Pac 型垂直電泳槽、Gel Doc XR+型凝膠成像分析系統(tǒng)、AB135-S 型電子分析天平購自美國Bio-Rad 公司;5424R 型低溫高速離心機購自德國Eppendorf 公司;SW-XJ-2F 型超凈臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;371 型直熱式CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific 公司;IX71-5-12FL/pH 型倒置熒光三目顯微鏡購自德國RoperScientific 公司;DW-HL668 型超低溫冰箱購自合肥中科美菱低溫科技股份有限公司;TCS SP8 型激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica 公司;RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠。

1.2 主要試劑

TG 試劑盒、FFA 試劑盒、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanineaminotransferase，ALT）試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartateaminotransferase，AST）試劑盒（批號分別為A110-1-1、A042-2-1、C009-2-1、C010-2-2）購自南京建成生物工程研究所;油紅O 溶液、棕櫚酸、油酸（批號分別為SLBW7964、SLBZ8298、0459K073）購自美國Sigma 公司;青霉素+鏈霉素雙抗、4%多聚甲醛組織固定液（批號分別為Bj111995904、1810473）購自合肥白鯊生物科技有限公司;乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、二?；视王；D(zhuǎn)移酶2（diacylglycerol transferase 2，DGAT2）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號分別為bsm-52486R、bsm-54469R、bs-12998R、bs-0061R、bs-0295G-HRP）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;牛血清白蛋白（批號EZ6688B182）購自德國BioFroxx 公司;10×TBST、D-101 大孔樹脂（批號分別為T1081、1021Q011）購自北京索萊寶科技有限公司;DAPI染液、Alexa Fluor488 標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號分別為C1005、A0423）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;DMEM培養(yǎng)基（批號AF29562465）購自美國HyClone 公司;胎牛血清、25%胰蛋白酶（批號分別為70101002、2186974）購自美國Gibco 公司;彩色蛋白Marker（40～300 kDa，批號26625）購自美國ThermoFisher Scientific 公司;彩色蛋白Marker（10～250 kDa，批號3580111）購自北京博泰斯生物技術(shù)有限公司;磷酸鹽緩沖液（PBS，批號26625）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;亞硝酸鈉、氫氧化鈉（批號分別為20200803、20210320）購自天津市盛奧化學試劑有限公司;硝酸鋁（批號20200305）購自天津市永晟精細化工有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分析純。

1.3 主要藥物

洋甘菊藥材采自新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院藥材基地，經(jīng)新疆醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院李永和主任中藥師鑒定為母菊屬一年生草本植物洋甘菊的干燥花。非諾貝特膠囊（規(guī)格0.2 g/粒，批號20181239）購自美國Abbott公司。

1.4 細胞

人肝癌HepG2 細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法

2.1 洋甘菊總黃酮的制備

2.1.1 洋甘菊總黃酮的初步提取取洋甘菊藥材700 g，用12 倍體積（8 400 mL）的70%乙醇浸泡2 h，放入提取鍋在80 ℃提取3 次，每次2 h;合并提取液，用紗布過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在80 ℃濃縮回收乙醇，待濃縮液總體積為700～800 mL，冷凍干燥，收集干膏粉。

檢測洋甘菊總黃酮提取物中的總黃酮含量?？傸S酮含量檢測方法[6]：取干膏粉0.029 70 g，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲助溶，充分溶解;取10 mL置于25 mL量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液各1 mL，每加1 種試劑后，室溫放置6 min;再加入4%NaOH溶液10 mL，用甲醇定容至刻度，搖勻，在500 nm波長處檢測吸光度（A）值，按回歸方程A=0.011 30C+0.009 25 計算提取物中的總黃酮含量，其中C表示總黃酮含量。

2.1.2 洋甘菊總黃酮的分離純化取“2.1.1”項下干膏粉36.93 g，用3 000 mL蒸餾水溶解制成含總黃酮約0.8mg/mL 的溶液，用D-101 大孔樹脂（使用前均用95%乙醇浸泡2 h，再以大量蒸餾水洗至無醇味）填好分離柱后上樣，上樣量為16 倍柱體積，上樣速度為1.0 mL/min。上樣完成后，用大量蒸餾水洗去吸附在大孔樹脂柱中的還原糖類成分，洗脫速度為1.0 mL/min。最后用70%乙醇洗脫，收集吸附在大孔樹脂上的黃酮類成分，洗脫速度為0.5 mL/min。蒸餾水洗脫和乙醇洗脫用量均控制在柱體積的6 倍左右。洗脫液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70 ℃揮干乙醇，冷凍干燥，收集純化后的干膏粉。

取純化后的干膏粉0.028 10 g，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容，超聲助溶，充分溶解;取1 mL置于25 mL量瓶中，按照“2.1.1”項下同法檢測純化后的總黃酮含量。

2.2 造模

HepG2 細胞用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。待細胞處于對數(shù)生長期時，以5×104個/mL 接種于6 孔板，每孔500 μL。細胞分為對照組和模型組。待細胞貼壁后，對照組給予含10% 胎牛血清、1% 青/鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，模型組加入終濃度均為1mmol/L 的油酸和棕櫚酸混合液[7]，培養(yǎng)24 h 后收集培養(yǎng)液和細胞。根據(jù)AST、ALT、FFA檢測試劑盒說明書上的操作步驟，采用酶標儀檢測上清液中的AST、ALT、FFA水平。加細胞裂解液裂解細胞后，將細胞刮下來，以12 000 r/min 于4 ℃離心細胞裂解液10 min，取上清液，用BCA試劑盒檢測細胞中的TG、FFA水平。結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細胞中的TG、FFA水平顯著升高（P<0.01）;細胞上清液中的FFA 水平顯著升高（P<0.01），ALT、AST水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這說明造模后細胞內(nèi)脂質(zhì)類成分增加，但細胞未受到嚴重損傷，表明成功誘導HepG2 細胞建立脂質(zhì)沉積細胞模型[8]，可進行后續(xù)實驗。結(jié)果見表1。

2.3 TG、FFA水平檢測

采用Benchmark Plus型全波長酶標儀檢測。取對數(shù)生長期細胞，以5×104個/mL接種于6 孔板，每孔500 μL。細胞分為對照組、模型組、非諾貝特組（陽性對照，終質(zhì)量濃度為3.61 μg/mL）和洋甘菊總黃酮低、中、高劑量組（終質(zhì)量濃度分別為100、150、200 μg/mL）[7]。待細胞貼壁后，對照組給予含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，其余5 組按照“2.2”項下進行造模，再給予相應(yīng)劑量藥物干預(yù)24 h 后，吸取6 孔板中的培養(yǎng)液，分別按FFA檢測試劑盒說明書上的操作步驟檢測各組細胞上清液中的FFA水平和細胞中的TG、FFA水平。

2.4 脂質(zhì)積累的觀察與脂質(zhì)含量的檢測

采用倒置顯微鏡觀察并用Benchmark Plus 型全波長酶標儀檢測。取對數(shù)生長期細胞，以5×104個/mL接種于6 孔板，每孔500 μL。細胞按照“2.3”項下方法分組、造模、給藥后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS 輕緩漂洗2 次;加入4%多聚甲醛溶液固定30 min左右，再用PBS輕緩漂洗2次;每孔加入1.5 mL的油紅O染液（去離子水與油紅O溶液體積比為3 ∶2）染色30 min，用PBS 漂洗1 次，60%異丙醇固定;用PBS 清洗掉多余的油紅O染液，甘油明膠封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照。細胞內(nèi)脂質(zhì)類成分可以與油紅O染液特異性結(jié)合呈橘紅色，橘紅色區(qū)域大小可以反映HepG2 細胞的脂質(zhì)沉積狀況。拍照結(jié)束后，吸棄上清液，每孔加入1 mL 異丙醇，輕柔搖晃10～15min 使染劑充分溶解，以酶標儀檢測在490 nm波長處的吸光度（A）值，用以表示脂質(zhì)含量。

2.5 DGAT2蛋白表達量的檢測

采用DAPI染液染色法觀察并檢測。取對數(shù)生長期細胞，以5×104個/mL接種至共聚焦皿中，每皿200 L。細胞按照“2.3”項下方法分組、造模、給藥后，以4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，PBS沖洗2 次，每次3 min;在圈內(nèi)滴加3%牛血清白蛋白溶液300 μL均勻覆蓋組織，封閉1 h 后，吸棄封閉液，PBS沖洗2 次，每次3 min;在圈內(nèi)滴加DGAT2 一抗（稀釋度1 ∶300），用封口膜封口，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜;次日吸走一抗，PBS 沖洗3 次，每次3min;圈內(nèi)滴加入300 μLAlexa Fluor488 標記的山羊抗兔IgG 二抗（稀釋度1 ∶300），室溫下繼續(xù)避光孵育2 h，PBS沖洗3 次，每次3 min;在圈內(nèi)滴加200 μL DAPI 染液避光染色10 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min;每皿加入1mL PBS 沖洗，用TCS SP8 型激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。DAPI染液染色后細胞核在紫外光激發(fā)下顯藍色熒光，DGAT2 蛋白陽性表達顯綠色熒光。每個樣本選取3 個視野，使用Image J 軟件統(tǒng)計DGAT2 蛋白表達的熒光強度，熒光強度越大表示蛋白表達量越高。

2.6 ACC、FAS、DGAT2 蛋白表達水平的檢測

采用Western blot 法檢測。細胞培養(yǎng)至形態(tài)正常且貼壁滿70%～80%時，消化計數(shù)后以5×104個/mL 接種至培養(yǎng)瓶中。細胞按照“2.3”項下方法分組、造模、給藥后，棄上清液，每瓶加PBS 2 mL沖洗2 次，每次1 min;每瓶加細胞裂解液200 μL，冰浴裂解30 min。將裂解的細胞刮下來并轉(zhuǎn)移至EP管中，以12 000 r/min 于4 ℃離心10 min;將細胞上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中;用BCA法檢測總蛋白濃度，樣品中加入4×蛋白上樣緩沖液和雙蒸水，使總蛋白濃度調(diào)成一致，100 ℃煮蛋白10 min，再置于-80 ℃冰箱備用。將蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，取出PVDF 膜置于含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中封閉1.5 h，洗滌3 次后加入一抗（ACC、FAS稀釋度1 ∶700，DGAT2、β-actin 稀釋度1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜，收集一抗，洗滌3 次;加入二抗（稀釋度1 ∶ 5 000），室溫避光孵育1 h，洗滌3 次;然后暗室中以ECL 發(fā)光試劑曝光，壓片、顯影、定影后用Image Lab 軟件分析圖像，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值表示目標蛋白的表達水平。

2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s 表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 洋甘菊總黃酮的制備結(jié)果

初步提取得到的干膏粉中，總黃酮含量為6.72%;純化后的干膏粉中，總黃酮含量為56.20%。這表明分離純化后，洋甘菊總黃酮含量明顯提高。

3.2 洋甘菊總黃酮對細胞（上清液）中TG、FFA水平的影響

與對照組比較，模型組細胞中的TG、FFA水平和細胞上清液中的FFA水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，非諾貝特組和洋甘菊總黃酮低、中、高劑量組細胞中的TG、FFA水平和細胞上清液中的FFA水平均顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖1。

3.3 洋甘菊總黃酮對HepG2 細胞脂肪積累的影響

由油紅O染液染色結(jié)果可見，對照組細胞間結(jié)合緊密，基本上無橘紅色脂滴;模型組細胞中可見大量橘紅色脂滴堆積，表明1 mmol/L 油酸和棕櫚酸混合液干預(yù)24 h 能顯著增加細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積;非諾貝特組和洋甘菊總黃酮低、中、高劑量組細胞中脂滴堆積較模型組顯著減少。結(jié)果見圖2。

脂質(zhì)含量檢測結(jié)果顯示，與對照組細胞脂質(zhì)A 值（0.30±0.11）比較，模型組細胞脂質(zhì)A值（0.93±0.14）顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，非諾貝特組和洋甘菊總黃酮低、中、高劑量組細胞脂質(zhì)A 值（0.34±0.09、0.54±0.17、0.43±0.13、0.43±0.06）顯著降低（P<0.01）。以上結(jié)果進一步驗證了油紅O染液的染色實驗結(jié)果，說明洋甘菊總黃酮可以降低脂質(zhì)沉積細胞中的脂質(zhì)含量。

3.4 洋甘菊總黃酮對HepG2 細胞中DGAT2 蛋白表達量的影響

由DAPI 染液染色結(jié)果可見，模型組細胞綠色熒光明顯增強，表明DGAT2 蛋白表達量明顯上調(diào);非諾貝特組和洋甘菊總黃酮低、中、高劑量組綠色熒光明顯減弱，DGAT2 蛋白表達量明顯下調(diào)。結(jié)果見圖3。

熒光強度檢測結(jié)果顯示，與對照組（23.53±1.88）比較，模型組DGAT2 蛋白表達熒光強度（81.40±7.21）顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，非諾貝特組和洋甘菊總黃酮低、中、高劑量組DGAT2 蛋白表達熒光強度（35.85±2.97、44.77±1.05、35.95±1.42、35.72±1.17）顯著降低（P<0.01）。以上結(jié)果進一步驗證了DAPI 染液的染色實驗結(jié)果，說明洋甘菊總黃酮可以降低脂質(zhì)沉積細胞中的DGAT2 蛋白表達量。

3.5 洋甘菊總黃酮對HepG2 細胞中ACC、FAS、DGAT2 蛋白表達水平的影響

Western blot 法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組ACC、FAS、DGAT2 蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，非諾貝特組和洋甘菊總黃酮低、中、高劑量組ACC、FAS、DGAT2 蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖4。

4 討論

過量FFA蓄積在肝，超過肝的代謝能力時會對細胞產(chǎn)生脂毒性，并可能誘導脂肪肝的發(fā)生。棕櫚酸是大部分哺乳動物體內(nèi)FFA的重要組成部分，參與FFA在體內(nèi)的脂質(zhì)生物合成過程;其除對細胞有脂毒性外，與油酸共同作用可誘導肝細胞發(fā)生脂肪變性[9-10]。AST、ALT是細胞非特異性功能酶，AST 主要存在于肝細胞線粒體，ALT 存在于肝細胞的細胞質(zhì)，兩者可以較準確地反映肝臟病理損傷程度，已成為公認的最靈敏的肝細胞損傷指標[11-12]。本實驗以HepG2 細胞為研究對象，分別用1 mmol/L油酸和棕櫚酸混合液聯(lián)合誘導HepG2 細胞，結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細胞中的TG、FFA水平和上清液中的FFA 水平顯著升高，而細胞上清液中的ALT、AST 水平差異無統(tǒng)計學意義，說明模型組細胞未發(fā)生嚴重的脂質(zhì)性損傷，符合脂質(zhì)沉積細胞模型建立要求[8]，造模成功。

洋甘菊是常用中藥材，洋甘菊總黃酮提取物主要成分有槲皮素、木犀草素及其衍生物等[13]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素是一種潛在的生物類黃酮，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗衰老、神經(jīng)保護等藥理活性，對肥胖癥、癌癥、糖尿病具有明顯的治療作用[14]，對大鼠脂質(zhì)代謝紊亂、肝功能損傷及神經(jīng)精神行為障礙有改善作用[15]。槲皮素可以顯著降低血清TG、TC、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和組織中TG、TC 水平，顯著升高血清高密度脂蛋白水平[16]。木犀草素及其衍生物可以改善糖和脂代謝紊亂[17]。本課題組前期研究顯示，洋甘菊70%醇提物可以顯著改善實驗性高脂血癥大鼠的血脂水平，具有明顯的降脂保肝作用，且有效降脂成分主要為總黃酮[18]。洋甘菊70%醇提物中總黃酮含量較低（只有5%左右），若用大孔樹脂進行分離純化后可提高提取物中總黃酮含量（達50%左右）。因此，為提高洋甘菊總黃酮的降脂功效，本研究先對提取物進行分離純化，得到較高含量的洋甘菊總黃酮（56.20%），再進一步研究洋甘菊總黃酮的降脂機制。非諾貝特是過氧化物酶增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα）激活劑，而PPARα在肝臟組織中高表達，可以調(diào)控脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因DGAT2 的表達[19-20]，所以本研究選擇非諾貝特為陽性對照藥來觀察洋甘菊總黃酮的降脂作用機制。

本研究建立HepG2 細胞的脂質(zhì)沉積細胞模型后，給予洋甘菊總黃酮100、150、200 μg/mL干預(yù)24 h。結(jié)果顯示，與模型組比較，洋甘菊總黃酮低、中、高劑量組細胞中的TG、FFA水平和細胞上清液中的FFA水平均顯著降低，脂滴堆積得到明顯改善，脂質(zhì)含量顯著降低。這說明洋甘菊總黃酮可以有效改善HepG2 細胞的脂質(zhì)沉積情況。

參與脂肪及TG生物合成的酶很多，其中FAS 催化脂肪合成的全過程;ACC是一種生物素依賴酶，催化長鏈脂肪酸合成過程;DGAT2 是參與二酰甘油/TG 生物合成的關(guān)鍵限速酶，可促進DGAT2 表達、增加TG合成、導致脂質(zhì)累積[21-22]。以上酶在肝細胞脂肪酸合成及TG生物合成中起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，消痰化瘀類中藥通過調(diào)控固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatoryelement binding protein 1c，SREBP-1c）、FAS 和ACC 基因的過度表達，抑制脂質(zhì)合成，促進脂肪酸氧化，從而減少肝臟脂質(zhì)沉積[23] ;胰島素類似物Exendin-4 可通過下調(diào)SREBP-1c、FAS和ACC基因的表達而降低由胰島素引起的HepG2 細胞中TG水平的升高程度[24]，減輕脂肪變性程度。楊玲等[25]研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸可引起B(yǎng)RL 3A細胞氧化應(yīng)激，并通過提高SREBP表達及核轉(zhuǎn)位效率，上調(diào)ACC、FAS、DGAT1、DGAT2 的mRNA及蛋白表達水平，促進TG合成，誘導脂肪變性。本研究結(jié)果表明，洋甘菊總黃酮能夠下調(diào)脂肪酸誘導HepG2 細胞中TG合成相關(guān)蛋白ACC、FAS、DGAT2的表達。

綜上所述，洋甘菊總黃酮可以抑制脂質(zhì)沉積模型HepG2 細胞的TG合成，減少細胞脂質(zhì)積累，防止細胞脂質(zhì)損傷，其機制可能與下調(diào)ACC/FAS/DGAT2 通路表達有關(guān)。