馮惠娟， 張 宇， 卓傳尚， 黃晨軍， 房 萌， 柳麗娟

1 福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院 檢驗科， 福州 350025； 2 上海東方肝膽外科醫(yī)院 實驗診斷科, 上海 200438

雙表型肝細(xì)胞癌(dual-phenotype hepatocellular carcinoma，DPHCC)是2011年首次被報道的肝細(xì)胞癌(HCC)的一種新亞型，其發(fā)生率約占HCC的10%[1-2]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，DPHCC患者在性別、年齡、HBV感染、血清甲胎蛋白(AFP)含量、臨床分期等方面與HCC患者無明顯差異，但DPHCC患者微血管侵犯及肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較HCC發(fā)生率更高，臨床預(yù)后更差，復(fù)發(fā)風(fēng)險也更高。因此DPHCC的精細(xì)分型對于HCC患者的精準(zhǔn)治療及提高臨床對HCC亞型的認(rèn)識具有重要意義。

目前，DPHCC的診斷主要依賴于免疫組化檢查，其組織病理學(xué)表現(xiàn)為典型的HCC特點，而免疫表型則具有HCC和肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)的雙重特性。當(dāng)腫瘤表現(xiàn)為單一的HCC組織學(xué)成分，同時表達任意HCC蛋白標(biāo)志物(如AFP、HepPar-1、pCEA等)和ICC蛋白標(biāo)志物(如 CK19、CK7、CA19-9等)的癌細(xì)胞數(shù)量>15%時，即可診斷為 DPHCC[3]。免疫組化為診斷DPHCC的金標(biāo)準(zhǔn)。目前常用的DPHCC血清學(xué)檢測指標(biāo)有AFP、異常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)、癌胚抗原(CEA)及糖類抗原19-9 (CA19-9)四項，主要為HCC與ICC的輔助診斷指標(biāo)，尚無特異性DPHCC的血清學(xué)指標(biāo)，因此，需要尋找新的血清學(xué)指標(biāo)用于DPHCC輔助診斷指標(biāo)。

肝臟參與了血清中近 50%糖蛋白中N-糖鏈的形成。N-糖鏈根據(jù)天線(或分支)的數(shù)量可分為二天線、三天線、四天線及四天線以上N-糖鏈結(jié)構(gòu)，其中三天線、四天線及四天線以上N-糖鏈結(jié)構(gòu)稱為多天線N-糖鏈結(jié)構(gòu)(Multi-glycan)[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)血清N-糖鏈表達水平(量)與糖鏈結(jié)構(gòu)(質(zhì))的改變可以成為HCC潛在診斷標(biāo)志物或治療靶標(biāo)，特別是血清中Multi-glycan表達水平的變化與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。Huang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清三天線N-糖鏈結(jié)構(gòu)豐度顯著增加，同時復(fù)發(fā)患者三天線及四天線豐度顯著增加，部分復(fù)發(fā)患者甚至出現(xiàn)四天線以上N-糖鏈結(jié)構(gòu)，Multi-glycan可以作為HCC患者復(fù)發(fā)的潛在標(biāo)志物之一。對于復(fù)發(fā)風(fēng)險更高的DPHCC而言，患者血清中Multi-glycan的表達情況目前尚無相關(guān)文獻報道。因此，本研究擬通過比較DPHCC中常見血清腫瘤指標(biāo)與Multi-glycan的表達，探討Multi-glycan對DPHCC的輔助診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2019年6月—2020年 12月福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院220例患者血清，分為DPHCC組、HCC組和肝硬化組。收集所有患者的一般臨床資料、實驗室檢測資料及病理資料。HCC診斷依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》[7]。DPHCC診斷依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[8]。LC診斷依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[9]。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 HCC及DPHCC組 HCC及DPHCC均為經(jīng)術(shù)后病理檢查明確診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)繼發(fā)性肝癌、其他器官惡性腫瘤、嚴(yán)重感染及其他器官嚴(yán)重疾病等；(2) HBV之外的其他病毒感染，如HAV、HCV等；(3)其他慢性肝病引起的肝癌，如：酒精性脂肪肝、自身免疫性肝病等。

1.2.2 LC組 LC均經(jīng)過臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)HBV之外的其他病毒感染，如HAV、HCV等；(2)其他原因引起的肝硬化，如原發(fā)性膽汁性肝硬化、酒精性肝硬化、血吸蟲肝硬化等。

1.3 檢測方法 采用基于DNA測序儀的熒光毛細(xì)管電泳(DNA sequence-assisted fluorophore-assisted capillary electrophoresis, DSA-FACE)技術(shù)，通過N-糖鏈釋放、熒光標(biāo)記、去除唾液酸及測序儀檢測四個步驟，進行N-糖鏈結(jié)構(gòu)分析檢測，具體操作步驟見參考文獻[10]。

1.4 實驗室常規(guī)指標(biāo)檢測 收集所有對象的實驗室檢測資料，包括AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9、TP、Alb、TBil、ALT及AST。其中AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA 及CA19-9四項均采用LLMIPULSEG1200全自動化學(xué)發(fā)光儀(日本富士公司)及配套試劑檢測。TP、Alb、TBil、ALT及AST五項均采用AU5800全自動生化分析儀(貝克曼公司)及配套試劑檢測。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 DPHCC組65例，其中男55例、女10例，年齡(55.00±16.50)歲；HCC組 80例，其中男67例、女13例，年齡(56.50±16.00)歲；肝硬化組120例，其中男98例、女22例，年齡(55.00±19.00)歲。

2.2 血清總N-糖鏈結(jié)果 DSA-FACE檢測可將血清總N-糖鏈分為13個峰(paek1～peak12及peak9’)。各峰表示的N-糖鏈結(jié)構(gòu)如圖1所示，Peak1:NGA2F,無半乳糖-α-1,6-核心巖藻糖基化二天線結(jié)構(gòu)；Peak2:NGA2FB,無半乳糖-α-1,6-核心巖藻糖基化平分型二天線結(jié)構(gòu)；Peak3/Peak4:NG1A2F,單半乳糖-α-1,6-核心巖藻糖基化二天線結(jié)構(gòu)；Peak5:NA2,雙半乳糖二天線結(jié)構(gòu)；Peak6:NA2F,雙半乳糖-α-1,6-核心巖藻糖基化二天線結(jié)構(gòu)；Peak7:NA2FB,雙半乳糖-α-1,6-核心巖藻糖基化平分型二天線結(jié)構(gòu)；Peak8:NA3,三半乳糖三天線結(jié)構(gòu)；Peak9:NA3Fb,三半乳糖-α-1,3-分支巖藻糖基化三天線結(jié)構(gòu)；Peak10:NA3Fc,三半乳糖-α-1,6-核心巖藻糖基化-α-1,3-分支巖藻糖基化三天線結(jié)構(gòu)；Peak11:NA4,四半乳糖四天線結(jié)構(gòu)；Peak12:NA4Fb,四半乳糖α-1,3-分支巖藻糖基化四天線結(jié)構(gòu)。其中Peak1～Peak7為二天線N-糖鏈結(jié)構(gòu)，Peak8、Peak9、Peak9’及Peak10為三天線N-糖鏈結(jié)構(gòu)，peak11及peak12為四天線N-糖鏈結(jié)構(gòu)， Peak8、Peak9、Peak9’、Peak10、Peak11及Peak12即為多天線N-糖鏈結(jié)構(gòu)。

圖1 N-糖鏈各峰糖型結(jié)構(gòu)

2.3 三組中各指標(biāo)的表達水平 DPHCC組、HCC組及LC組之間性別及年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)；肝功能指標(biāo)中TP、Alb、ALT及AST差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，TBil差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；血清腫瘤指標(biāo)中AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA及CA19-9差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；采用logictic回歸方法構(gòu)建常見指標(biāo)模型(SUM，SUM=0.63×AFP+0.021×PIVKA-Ⅱ+0.01×CA19-9-0.006×CEA+0.037)，SUM在3組中差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。13個N-糖鏈中，peak1、peak2、peak7、peak8及peak12差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)，而peak3、peak4、peak5、peak6、peak9、peak9’、peak10、peak11及Multi-glycan差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，如表1所示。

2.4 三組中血清腫瘤指標(biāo)及Multi-glycan的表達 DPHCC組與HCC組比較，僅Multi-glycan差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9及SUM差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)；DPHCC組與LC組比較，Multi-glycan、AFP、PIVKA-Ⅱ、CA19-9及SUM差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)，而CEA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.14)(圖2)。

圖2 三組中血清腫瘤指標(biāo)及Multi-glycan的表達

2.5 三組中血清腫瘤指標(biāo)、差異N-糖鏈及Multi-glycan的AUC比較 DPHCC組與HCC組比較，各指標(biāo)診斷DPHCC的AUC分別為：AUCMulti-glycan為0.775(95%CI:0.699～0.850)、AUCpeak3為0.596(95%CI:0.502～0.691)、AUCpeak4為0.566(95%CI:0.472～0.660)、AUCpeak5為0.559(95%CI:0.465～0.653)、AUCpeak6為0.656(95%CI:0.567～0.746)、AUCpeak9為0.583(95%CI:0.489～0.677)、AUCpeak9’為0.685(95%CI:0.599～0.772)、AUCpeak10為0.570(95%CI:0.457～0.683)、AUCpeak11為0.655(95%CI:0.566～0.744)、AUCAFP為0.507(95%CI:0.699～0.850)、AUCPIVKA-Ⅱ為0.584(95%CI:0.490～0.677)、AUCCEA為0.537(95%CI:0.442～0.632)、AUCCA19-9為0.505(95%CI:0.410～0.600)及AUCSUM為0.561(95%CI:0.467～0.655)。其中，AUCMulti-glycan顯著高于AUCpeak3(Z=4.96,P<0.001) 、AUCpeak4(Z=4.81,P<0.001)、AUCpeak5(Z=4.73,P<0.001)、AUCpeak6(Z=2.97,P=0.003)、AUCpeak9(Z=3.79,P<0.001)、AUCpeak10(Z=3.19,P<0.001)、AUCpeak11(Z=3.10,P<0.001)、AUCAFP(Z=4.62,P<0.001)、AUCPIVKA-Ⅱ(Z=3.30,P=0.001)、AUCCEA(Z=3.99,P<0.001)、AUCCA19-9(Z=4.49,P<0.001)及AUCSUM(Z=3.60,P<0.001)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3，表2)。

表1 三組中各指標(biāo)的表達水平

DPHCC組與LC組比較，各指標(biāo)診斷DPHCC的AUC分別為：AUCMulti-glycan為0.780(95%CI:0.713～0.848)、AUCpeak3為0.699(95%CI:0.625～0.772)、AUCpeak4為0.629(95%CI:0.552～0.706)、AUCpeak5為0.690(95%CI:0.616～0.763)、AUCpeak6為0.760(95%CI:0.704～0.806)、AUCpeak9為0.564(95%CI:0.479～0.649)、AUCpeak9’為0.606(95%CI:0.527～0.685)、AUCpeak10為0.631(95%CI:0.555～0.707)、AUCpeak11為0.508(95%CI:0.428～0.589)、AUCAFP為0.767(95%CI:0.691～0.844)、AUCPIVKA-Ⅱ為0.743(95%CI:0.645～0.841)、AUCCEA為0.537(95%CI:0.476～0.656)、AUCCA19-9為0.689(95%CI:0.625～0.779)及AUCSUM為0.713(95%CI:0.628～0.788)。其中，AUCMulti-glycan顯著高于AUCpeak3(Z=5.65,P<0.001) 、AUCpeak4(Z=2.40,P=0.01)、AUCpeak5(Z=3.93,P<0.001)、AUCpeak6(Z=3.40,P<0.001)、AUCpeak9(Z=2.28,P=0.02)、AUCpeak9’(Z=5.31,P<0.001)、AUCpeak10(Z=2.59,P=0.009)、AUCpeak11(Z=4.14,P<0.001)及AUCCEA(Z=3.87,P<0.001)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3，表2)。

2.6 三組中血清腫瘤指標(biāo)及Multi-glycan的診斷效能分析 DPHCC組與HCC組比較，Multi-glycan的靈敏度與SUM相同均為69.23%，且比AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9分別提高33.85%、41.54%、10.77%、35.38%；Multi-glycan的特異度與AFP相同均為73.75%，且比PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9、SUM分別提高32.5%、51.25%、20%、17.5%。

DPHCC組與LC組比較中，Multi-glycan的靈敏度為89.23%，且比AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9、SUM分別提高58.46%、24.61%、56.92%、76.92%、17.35%；Multi-glycan特異度為66.67%，且比CEA、CA19-9、SUM提高1.67%、20%、20.84%，而稍低于AFP、PIVKA-Ⅱ(表2)。

圖3 三組中血清腫瘤指標(biāo)、差異N-糖鏈及Multi-glycan的ROC曲線

表2 三組中各指標(biāo)的診斷效能

3 討論

DPHCC是近幾年新發(fā)現(xiàn)的HCC新亞型，其總生存期和無復(fù)發(fā)生存期顯著低于普通型HCC患者[1]。因此，DPHCC的早期診斷對于改善患者的診療現(xiàn)狀、提高患者的預(yù)后生存具有重要意義。

N-糖鏈作為蛋白質(zhì)翻譯后糖基化修飾的產(chǎn)物之一，近年來已成為無創(chuàng)性腫瘤標(biāo)志物的研究方向之一，可以作為胃癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等腫瘤的血清學(xué)輔助診斷指標(biāo)[11-13]。N-糖鏈主要通過蛋白Asn-XXX-Ser/Thr 序列(XXX為除脯氨酸以外的氨基酸)中Asn殘基上的-NH2與蛋白相連[14-15]。多數(shù)糖蛋白的N-糖鏈為二或三天線(或分支)結(jié)構(gòu)，少數(shù)為四天線結(jié)構(gòu)，四天線以上較為罕見。其中三天線及以上天線結(jié)構(gòu)的N-糖鏈稱為Multi-glycan。

本研究結(jié)果顯示，HCC組與DPHCC組中四天線N-糖鏈結(jié)構(gòu)(peak11及peak12)及Multi-glycan的豐度均高于LC組，與Huang等[6]文獻報道相似。同時，DPHCC組中Multi-glycan的豐度也顯著高于HCC組(P<0.05)，提示Multi-glycan的豐度可能可用于DPHCC患者的血清學(xué)診斷。

DPHCC組與LC組ROC曲線分析結(jié)果顯示，DPHCC組中Multi-glycan的AUC 不僅高于各單項差異N-糖鏈結(jié)構(gòu)的AUC(peak3、peak4、peak5、peak6、peak9、peak9’、peak10、peak11)，也顯著高于AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9及SUM模型。Multi-glycan的靈敏度(89.23%)也均高于四項血清腫瘤指標(biāo)及SUM模型。DPHCC組與HCC組ROC曲線分析結(jié)果顯示，DPHCC組中Multi-glycan的AUC也顯著高于各單項差異N-糖鏈結(jié)構(gòu)、四項血清腫瘤指標(biāo)及SUM模型，且Multi-glycan的靈敏度(69.23%)與SUM模型相同，均高于四項血清腫瘤指標(biāo)。診斷效能分析結(jié)果進一步表明，Multi-glycan不僅能區(qū)分DPHCC與LC患者，也能很好的區(qū)分DPHCC與HCC患者。綜上所述，Multi-glycan可以作為DPHCC的血清學(xué)輔助診斷指標(biāo)。

倫理學(xué)審查：本研究于2020年2月14日經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批號：科審2020_008_01。所有對象均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：馮惠娟、柳麗娟負(fù)責(zé)設(shè)計研究方案；張宇負(fù)責(zé)樣本收集及分析；黃晨軍、房萌負(fù)責(zé)樣本檢測與數(shù)據(jù)整理分析；卓傳尚負(fù)責(zé)指導(dǎo)論文的撰寫與修改。