王睿斌， 盧雨征， 朱靜林， 王 為， 賈 光

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 急診科， 北京 100038

糖尿病是一種以高血糖為表現(xiàn)的慢性代謝性疾病。據(jù)2015年國際糖尿病聯(lián)合會統(tǒng)計，全球有4.15億人被診斷出患有糖尿病，500萬人死于糖尿病，中國糖尿病患者占全球病例的25%[1]。糖尿病已成為中國公共衛(wèi)生和經(jīng)濟社會發(fā)展的嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。糖尿病患者易發(fā)多種并發(fā)癥，其是并發(fā)細(xì)菌性肝膿腫的最大危險因素[2]。糖尿病患者由于對感染的遺傳易感性，且長時間的高血糖改變了細(xì)胞和體液免疫防御機制，以及局部血液供應(yīng)不足和神經(jīng)損傷，還有與糖尿病相關(guān)的代謝改變，從而易發(fā)生感染[3]。肝膿腫在糖尿病患者中發(fā)病率較高，且致病菌主要為肺炎克雷伯桿菌[4]。肝Kupffer細(xì)胞是位于肝竇中的巨噬細(xì)胞，其作用是參與清除侵入肝臟的細(xì)菌[5]。Kupffer細(xì)胞在對抗胃腸道來源的細(xì)菌感染方面發(fā)揮了重要作用。糖尿病患者Kupffer細(xì)胞被激活[6]，會釋放大量炎癥介質(zhì)[7]，如： TNFα、IFNγ、IL和NO等[5,8]。高血糖還會造成巨噬細(xì)胞缺氧應(yīng)激并損傷其功能[9-11]。因此，肝Kupffer細(xì)胞功能障礙可能是糖尿病患者易發(fā)肝膿腫的原因之一。利多卡因不僅是常用的局部麻醉藥物，其還可以通過作用于NF-κB信號通路，抑制炎癥介質(zhì)釋放而達(dá)到抗炎作用[12]。但利多卡因是否能改善糖尿病患者的Kupffer細(xì)胞功能尚未見報道。為探討利多卡因?qū)μ悄虿「蜬upffer細(xì)胞的保護(hù)作用及是否會影響肝膿腫的形成，本研究應(yīng)用利多卡因作用于克雷伯桿菌感染的糖尿病小鼠并體外培養(yǎng)其肝Kupffer細(xì)胞，觀察利多卡因?qū)ζ溲装Y反應(yīng)的抑制作用及對其吞噬功能的改善情況以及其對肝膿腫形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 SPF級C57BLKS/J db/db小鼠，C57BLKS/J db/m小鼠各10只，8周齡，雌性，體質(zhì)量26～28 g，購于常州卡文斯實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2018-0010，動物使用許可證號：SYSK(京)2017-0025。克雷伯桿菌菌株購自上海素冉生物科技有限公司(貨號：ATCC13883)，利多卡因購自北京紫竹藥業(yè)有限公司(批號:20170841)。胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，1640培養(yǎng)基，細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)單克隆抗體，IL-6，TNFα，IFNγ檢測試劑盒購自北京科碩生物技術(shù)有限公司(批號:A2040101，20650422，71671025， MA4506， BMS513HS，BMS706-2，PMC5025)。PVDF膜購自中科天銳(北京)科技有限公司(批號:H33072)。聚苯乙烯乳珠購自北京歐北生物科技有限公司(批號:8002-42-5)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 菌株復(fù)蘇后接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，150 r/min振蕩培養(yǎng)3～5 h，取100 μL菌液鋪于LB固體培養(yǎng)板，倒置于37 ℃孵箱，培養(yǎng)16 h后收集活菌于PBS，紫外分光光度計測定650 nm OD值確定細(xì)菌濃度。

1.2.2 試驗動物分組及給藥 將C57BLKS/J db/db小鼠分為糖尿病對照組和糖尿病+利多卡因組，將C57BLKS/J db/m小鼠分為非糖尿病對照組和非糖尿病+利多卡因組，每組5只。小鼠連續(xù)7 d口服20 μL含1×107CFU 高黏性肺炎克雷伯桿菌的懸液，利多卡因干預(yù)組給予利多卡因經(jīng)鼠尾靜脈注射(1 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)1周。1周后處死所有小鼠后迅速無菌取出股骨和脛骨及肝臟，肝臟組織病理切片檢查有無肝膿腫。

1.2.3 小鼠肝Kupffer細(xì)胞及中性粒細(xì)胞分離培養(yǎng) 肝臟組織切碎，約1 mm3大小，加入0.1%Ⅳ型膠原蛋白酶37 ℃消化40 min，消化液過濾并離心后用完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+1%PBS)重懸。沿離心管壁分別加入3 mL 70%、30%細(xì)胞分離液和2 mL上述離心重懸液，400 r/min離心20 min，吸管吸出上層薄層，完全培養(yǎng)基重懸，300 r/min離心5 min，共2次，鋪瓶，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。4 h后除去上清，PBS清洗1遍，去除未貼壁的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞為Kupffer細(xì)胞。

取股骨和脛骨剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔。1 mL無菌注射器，吸取少量含有10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的稀釋液，沖洗骨髓腔以獲取骨髓。制備成2×108～1×109/mL 的單細(xì)胞懸液備用。離心管中加入分離液并將細(xì)胞懸液平鋪到分離液液面上方，離心后出現(xiàn)明顯的分層：分離液中為粒細(xì)胞層。取細(xì)胞用完全培養(yǎng)基(1640+10%FBS+1%PBS)重懸，鋪瓶。

1.2.4 透射電鏡檢測Kupffer細(xì)胞細(xì)胞器改變 小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)移至含有2.5%戊二醛溶液的EP管中，固定1 h，后轉(zhuǎn)移至1 mol/L磷酸鹽緩沖液，并洗滌3次，每次5 min。1%鋨酸固定30 min，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌2次，每次5 min。3%～4%瓊脂預(yù)包埋固化后，切成約1 mm3的小塊。加入50%、70%、90%乙醇溶液和90%丙酮、10%丙酮脫水。環(huán)氧樹脂浸漬、包埋、聚合、超片，在FEI Tecnai G212透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.5 Griess法檢測NO水平 等量細(xì)胞培養(yǎng)基與Griess試劑在室溫下混合反應(yīng)20～25 min。546～550 nm波長處讀取NO的OD值，計算濃度。

1.2.6 ELISA法定量測定Kupffer細(xì)胞的IL-6、TNFα、IFNγ水平 純化抗體包被微孔板制成固相抗體，微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品及IL-6、TNFα、IFNγ抗體、HRP標(biāo)記親和素，徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-6、TNFα、IFNγ呈正相關(guān)。酶標(biāo)儀在(450±2)nm波長下測定OD值，計算樣品濃度。

1.2.7 Western Blot法檢測Kupffer細(xì)胞 ICAM-1表達(dá)水平 Kupffer細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解。提取蛋白質(zhì)通過二辛可寧酸定量分析。樣品加到SDS-PAGE凝膠加樣孔內(nèi)，后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，37 ℃下與一抗溫育過夜。 TBS-T洗滌3次，每次10 min，將膜與HRP綴合的二抗在室溫下孵育1.5 h。將膜置于免疫印跡儀內(nèi)，拍照并記錄結(jié)果。電泳帶灰度值掃描，并對目的蛋白半定量分析。以目的條帶與內(nèi)參條帶的吸光度比值表示目的蛋白的相對水平。

1.2.8 transwell小室檢測中性粒細(xì)胞的趨化功能 24孔8.0 μm孔徑PC膜transwell小室，每份中性粒細(xì)胞懸液加入2個小室。下室加入500 μL細(xì)胞密度為2×105/mL各組Kupffer細(xì)胞懸液，細(xì)胞匯合度達(dá)80%后棄去上清，加入500 μL完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+1%PBS)，上室加入200 μL中性粒細(xì)胞懸液(密度為2×105/mL)，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)2 h，棄去上室液體，PBS洗滌2遍，棉簽擦去上室膜的未趨化細(xì)胞，移去小室，倒置并風(fēng)干。下室加入0.1%結(jié)晶紫染液500 μL， 37 ℃孵育30 min，棄去染液，PBS洗滌2遍，隨機取5個視野，進(jìn)行中性粒細(xì)胞計數(shù)。

1.2.9 Kupffer細(xì)胞的吞噬功能測定 取接種于蓋玻片的Kupffer細(xì)胞，每皿加入聚苯乙烯乳珠 1×108個，培養(yǎng)60 min，蓋玻片PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，Giemsa染色后倒置顯微鏡下觀Kupffer細(xì)胞吞噬聚苯乙烯乳珠情況并計數(shù)。每片隨機取5個視野，每個視野隨機取10個Kupffer細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取每皿Kupffer細(xì)胞吞噬聚苯乙烯乳珠數(shù)的平均值。

2 結(jié)果

2.1 Kupffer細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 糖尿病小鼠(圖1a)與非糖尿病小鼠(圖1b)比較，Kupffer細(xì)胞中細(xì)胞核呈橢圓形或腎形，并偶可見核膜斷裂，線粒體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量減少，并可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫脹及脂滴增多，溶酶體稍有減少。

注：a，糖尿病小鼠；b，非糖尿病小鼠。紅色箭頭為線粒體；綠色箭頭為

2.2 各組小鼠Kupffer細(xì)胞NO、TNFα、IL-6、IFNγ及ICAM-1表達(dá)水平 糖尿病對照組與非糖尿病對照組相比NO、TNFα、IL-6、IFNγ水平均升高(P值均<0.05)(表1)，ICAM-1表達(dá)水平亦升高(P<0.05)(表1，圖2)。與糖尿病對照組比較，糖尿病+利多卡因組NO、TNFα、IL-6、IFNγ水平均降低(P值均<0.05)(表1)，ICAM-1表達(dá)水平亦減低(P<0.05)(表1，圖2)。非糖尿病對照組與非糖尿病+利多卡因組比較各項指標(biāo)均未見明顯變化(P值均>0.05)(表1，圖2)。

表1 各組小鼠Kupffer細(xì)胞 NO、IL-6、TNFα、IFNγ、ICAM-1水平

圖2 Western Blot檢測各組小鼠Kupffer細(xì)胞 ICAM-1表達(dá)

2.3 各組小鼠中性粒細(xì)胞趨化和Kupffer細(xì)胞吞噬功能

糖尿病對照組與非糖尿病對照組相比，中性粒細(xì)胞趨化增強(P<0.05)(表2，圖3a、b)，糖尿病+利多卡因組與糖尿病對照組相比，中性粒細(xì)胞趨化減弱(P<0.05)(表2，圖3b、d)，非糖尿病對照組與非糖尿病+利多卡因組相比，中性粒細(xì)胞趨化無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2，圖3a、c)。糖尿病組與非糖尿病對照組相比，Kupffer細(xì)胞吞噬能力減弱(P<0.05)(表2，圖4a、b)，糖尿病+利多卡因組與糖尿病對照組相比，Kupffer細(xì)胞吞噬能力增強(P<0.05)(表2，圖 4b、d)，非糖尿病對照組與非糖尿病+利多卡因組相比，Kupffer細(xì)胞吞噬能力無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2，圖4a、c)。

表2 各組小鼠中性粒細(xì)胞招募、吞噬功能水平

注：a，非糖尿病對照組;b，糖尿病對照組;c，非糖尿病+利多卡因組;

2.4 各組小鼠肝膿腫形成 糖尿病對照組小鼠形成2例(40%)肝膿腫,余各組均無肝膿腫形成(圖5)，各組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：a，非糖尿病對照組; b，糖尿病對照組; c，非糖尿病+利多卡因組;d，糖尿病+利多卡因組。

注：a，肝膿腫形成；b，正常肝臟。

3 討論

2019年全球約4.63億20～79歲成人罹患糖尿病，預(yù)計到2030年，糖尿病患者將達(dá)到5.784億；中國是糖尿病患者數(shù)量最多的國家[13]。糖尿病患者由于多有免疫功能障礙，神經(jīng)病變和血液循環(huán)不良，因此容易促進(jìn)細(xì)菌生長導(dǎo)致感染的發(fā)生[14-15]。與正常人相比，糖尿病患者發(fā)生化膿性肝膿腫的風(fēng)險增加35.3%[16]。糖尿病相關(guān)肝膿腫的致病菌主要為肺炎克雷伯桿菌，這可能與糖尿病患者血管內(nèi)膜異常，易使獲得性肺炎克雷伯桿菌發(fā)生血源性播散有關(guān)[17-18]。Kupffer細(xì)胞是肝血竇內(nèi)的巨噬細(xì)胞，是病原體進(jìn)入肝臟的第一道防線，參與清除入侵肝竇的細(xì)菌和病毒[5,15,19]。本研究通過透射電鏡觀察了糖尿病小鼠Kupffer細(xì)胞的線粒體、溶酶體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，發(fā)現(xiàn)它們的數(shù)量明顯低于非糖尿病小鼠且質(zhì)量不佳。因炎癥反應(yīng)與應(yīng)激信號可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)影響細(xì)胞代謝，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改變在2型糖尿病的發(fā)展過程中也起到了一定的作用[20]。線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量減少可能意味著Kupffer細(xì)胞的功能減弱[21]。因此患有糖尿病的小鼠，其Kupffer細(xì)胞的功能受到了顯著影響。同時由于糖尿病小鼠的Kupffer細(xì)胞功能紊亂，吞噬能力明顯低于非糖尿病小鼠。此前的研究也證實高血糖可通過缺氧應(yīng)激導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能受到抑制[9-11]。

糖尿病患者微環(huán)境通常處于異常的全身慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)[22-24]，其體內(nèi)Kupffer細(xì)胞被內(nèi)毒素、TNF等激活，并大量釋放TNFα、TGF、IFN、IL、氧自由基、NO等炎癥介質(zhì)[5,8]。靜息狀態(tài)下Kupffer細(xì)胞表面ICAM-1呈低表達(dá)，但可通過炎癥介質(zhì)上調(diào)其表達(dá)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠中Kupffer細(xì)胞表面的ICAM-1呈高表達(dá)，因此證實糖尿病小鼠的Kupffer細(xì)胞處于激活狀態(tài)。糖尿病組與非糖尿病組小鼠相比其Kupffer細(xì)胞中NO、IL-6、IFNγ和TNFα的分泌增加，ICAM-1的表達(dá)增強。因此，糖尿病小鼠的Kupffer細(xì)胞處于激活狀態(tài)，與糖尿病是一種由于營養(yǎng)代謝異常導(dǎo)致的全身性慢性炎癥性疾病的認(rèn)知相符[22,24]，而轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在糖尿病和慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[26-27]。

利多卡因被廣泛用作局麻藥和抗心律失常藥。有研究表明利多卡因?qū)ρ芟到y(tǒng)有保護(hù)作用[28-29]，并可抑制炎癥因子的表達(dá)[12]，還具有抗腫瘤作用。通常認(rèn)為局麻藥具有良好的抗炎作用，其可減弱炎性Src信號并抑制PI3K-Akt-NO通路，從而可阻斷Src依賴的中性粒細(xì)胞粘附和內(nèi)皮細(xì)胞高通透性[28]。利多卡因可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)[9]，還可通過抑制炎癥介質(zhì)來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能[28]。本研究發(fā)現(xiàn)利多卡因可抑制糖尿病小鼠炎癥介質(zhì)的釋放，下調(diào)了其Kupffer細(xì)胞表面ICAM-1的表達(dá)，并減少了粒細(xì)胞招募，同時也改善了糖尿病小鼠Kupffer細(xì)胞的吞噬能力。由此認(rèn)為利多卡因可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路改善糖尿病小鼠的全身性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，使糖尿病小鼠Kupffer細(xì)胞由激活狀態(tài)調(diào)整為靜息狀態(tài)，并使其吞噬能力得到改善；提示利多卡因?qū)μ悄虿⌒∈驥upffer細(xì)胞起到了一定程度的保護(hù)作用。但在本研究中利多卡因并未顯示可減少糖尿病小鼠肝膿腫形成的風(fēng)險。

本研究的主要局限性包括樣本量相對較小和對假設(shè)的分子機制缺乏功能驗證。ICAM-1表達(dá)只檢測到了翻譯水平，而不是轉(zhuǎn)錄水平。而小鼠細(xì)菌性肝膿腫模型的建立因樣本量較少也缺乏代表性。

綜上所述，糖尿病小鼠的Kupffer細(xì)胞激活招募粒細(xì)胞，顯著地釋放炎癥介質(zhì)且有吞噬功能的障礙，而利多卡因具有恢復(fù)吞噬功能和抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用，但對細(xì)菌性肝膿腫的形成并沒有明顯的改善作用。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2016年10月經(jīng)由北京世紀(jì)壇醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批，批號：sjtkyll-lx-2016(103)，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王睿斌負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；盧雨征、朱靜林參與整理數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析；王為、賈光參與實驗操作及論文撰寫。