夏 亮 謝齊貴 陳湛蕾

肝癌是最常發(fā)生的惡性腫瘤之一[1]。盡管肝癌的治療手段不斷發(fā)展，包括手術(shù)切除、移植、消融、經(jīng)動(dòng)脈化學(xué)栓塞等，但療效仍不令人滿意[2]。芍藥苷是從白芍根中分離出來的一種生物活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖和降壓等作用[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷在多種人類癌癥中具有抗腫瘤功能，例如肺癌、乳腺癌、肝癌等[5-7]。然而，芍藥苷介導(dǎo)的抗肝腫瘤機(jī)制尚未完全明確。因此，本研究擬利用肝癌HepG2 細(xì)胞系，研究芍藥苷對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響及其潛在機(jī)制，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞HepG2（上海富衡生物科技有限公司，貨號(hào)FH0076）。

1.2 藥物及試劑 芍藥苷（麥克林，批號(hào)C10081578）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，批號(hào)11965092）；EDTA-胰蛋白酶消化液（美國Gibco 公司，批號(hào)25200072）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號(hào)12483020）、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)C0221A）；青霉素-鏈霉素溶液（美國Gibco 公司，批號(hào)15070063）；CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司，批號(hào)CK-04）；transwell 小室（美國Corning 公司，批號(hào)3422）；基質(zhì)膠（美國BD 公司，批號(hào)P0873K）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司，批號(hào)IK5013）；PrimeScriptRT 試劑盒、SYBRPremix Ex Taq 試劑盒（日本Takara 公司，批號(hào)RR047A、RR0584）；膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠（Annexin-V/PI）凋亡試劑盒（美國BD 公司，批號(hào)6301518）；RIPA 裂解液、磷酸酶抑制劑、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、ECL 發(fā)光顯影液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)P0013B、ST019、P0252、P0256、P0258、P0018FS、P0012S）；兔抗人Notch-1 單克隆抗體、鼠抗人Hes-1 單克隆抗體、鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（英國Abcam 公司，批號(hào)ab52627、ab119776、ab8226）。

1.3 儀器 FACS Calibur 流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；ELx800 酶標(biāo)儀（美國BioTek Instuments 公司）；奧林巴斯AI09 倒置光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Pierce ECL 系統(tǒng)（美國通用公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 使用含10%的胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2，并將其置入37 ℃、5%CO2的增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)傳代以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。將HepG2 細(xì)胞分為四組，空白對(duì)照組僅使用正常培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)既往發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，確定芍藥苷用藥濃度范圍，設(shè)置低、中、高劑量，組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入芍藥苷，分別使其藥物濃度為25、50、75 μmol/L。

2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞增殖活性 將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，按照104個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至次日。加入不同濃度芍藥苷（0、25、50、75、100、150 μmol/L）培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的吸光度值（A）。

2.3 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 將100 μL細(xì)胞懸液以5×103個(gè)/孔的密度接種于涂有基質(zhì)膠的Transwell 上層小室中，在無血清的DMEM 培養(yǎng)基中孵育，下層小室加入600 μL 含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基。24 h 后將細(xì)胞用甲醇固定15 min，并用2%結(jié)晶紫染色。用棉簽移除小室膜上未遷移的細(xì)胞，使用倒置顯微鏡拍照，記錄跨膜細(xì)胞數(shù)。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 將處于對(duì)數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，按上述分組處理細(xì)胞24 h，后消化細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞3 次，以3 000 r/min 離心10 min，留取細(xì)胞沉淀，加入500 μL 結(jié)合緩沖液后，依次加入5 μL Annexin-V/FITC 染液和10 μL PI 染液，室溫避光孵育15 min，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，記錄各組凋亡情況。

2.5 Western blot 檢測細(xì)胞表達(dá)蛋白水平 取對(duì)數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，次日按上述分組處理細(xì)胞24 h，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，冰裂30 min 后，以12 000 g、4 ℃離心30 min 吸取上清，用BCA 法測定蛋白濃度。每組取20 μg 蛋白加入SDS-PAGE 凝膠孔道進(jìn)行電泳，后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。使用封閉液室溫封閉膜1 h，后使用TBST 洗膜3 次，加入對(duì)應(yīng)一抗，置于4 ℃搖床孵育過夜。次日洗膜3 次，加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2 h，后用ECL 發(fā)光顯影液在曝光系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白條帶成像。使用ImageJ 軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。本研究中所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。單一處理?xiàng)l件下，組間比較采用單因素方差分析，兩組比較使用Student’s t 檢驗(yàn)。P＜0.05 視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芍藥苷對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖活性的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，與空白對(duì)照組細(xì)胞比較，隨著芍藥苷處理濃度增加，細(xì)胞增殖活性呈劑量依賴性顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組肝癌HepG2 細(xì)胞OD 值、增殖活性比較（）

表1 各組肝癌HepG2 細(xì)胞OD 值、增殖活性比較（）

注：空白對(duì)照組給予芍藥苷0 μmol/L；芍藥苷25 μmol/L 組給予芍藥苷25 μmol/L；芍藥苷50 μmol/L 組給予芍藥苷50 μmol/L；芍藥苷75 μmol/L 組給予芍藥苷75 μmol/L；芍藥苷100 μmol/L 組給予芍藥苷100 μmol/L；芍藥苷150 μmol/L 組給予芍藥苷150 μmol/L；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與芍藥苷25 μmol/L 組比較，bP＜0.05；與芍藥苷50 μmol/L 組比較，cP＜0.05；與芍藥苷75 μmol/L 組比較，dP＜0.05；與芍藥苷100 μmol/L 組比較，eP＜0.05

3.2 芍藥苷對(duì)HepG2 細(xì)胞增侵襲能力的影響 與空白對(duì)照組比較，芍藥苷低、中、高劑量組的細(xì)胞穿膜數(shù)顯著減少（P＜0.05），且芍藥苷低、中、高劑量組抑制細(xì)胞侵襲能力呈劑量依賴性（P＜0.05），見表2和圖1。

表2 各組肝癌HepG2 細(xì)胞穿膜數(shù)目比較（個(gè)，）

表2 各組肝癌HepG2 細(xì)胞穿膜數(shù)目比較（個(gè)，）

注：空白對(duì)照組給予芍藥苷0 μmol/L；芍藥苷低劑量組給予芍藥苷25 μmol/L；芍藥苷中劑量組給予芍藥苷50 μmol/L；芍藥苷高劑量組給予芍藥苷75 μmol/L；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與芍藥苷低劑量組比較，bP＜0.05；與芍藥苷中劑量組比較，cP＜0.05

圖1 芍藥苷對(duì)HepG2 細(xì)胞增侵襲能力的影響（2%結(jié)晶紫染色，×40）

3.3 芍藥苷對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡反應(yīng)的影響 Annexin-V/PI 雙染法結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，芍藥苷處理組HepG2 細(xì)胞凋亡率顯著增加（P 均＜0.05），且細(xì)胞凋亡率隨芍藥苷的處理濃度增加而升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡率比較（%，）

表3 各組肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡率比較（%，）

注：空白對(duì)照組給予芍藥苷0 μmol/L；芍藥苷低劑量組給予芍藥苷25 μmol/L；芍藥苷中劑量組給予芍藥苷50 μmol/L；芍藥苷高劑量組給予芍藥苷75 μmol/L；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與芍藥苷低劑量組比較，bP＜0.05；與芍藥苷中劑量組比較，cP＜0.05

3.4 芍藥苷對(duì)HepG2 細(xì)胞Notch-1 信號(hào)通路的影響 與空白對(duì)照組比較，芍藥苷處理組Notch-1 及Hes-1 蛋白表達(dá)顯著降低（P 均＜0.05），且隨芍藥苷處理濃度增加，蛋白表達(dá)逐漸降低（P 均＜0.05）。

4 討論

目前，肝癌死亡的主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[10]。因此，抑制肝癌細(xì)胞侵襲、增殖具有重要意義。化療藥物為抑制肝癌轉(zhuǎn)移的主要治療手段，但其低特異性導(dǎo)致了眾多不良反應(yīng)和毒副作用[11]。與典型的化療藥物相比，藥物植物有望成為更有效的治療方法[12]。本研究結(jié)果表明，芍藥苷可呈劑量依賴性降低肝癌細(xì)胞增殖活性。此外，在用芍藥苷處理HepG2細(xì)胞24 h 后，隨著芍藥苷給藥濃度的增加，細(xì)胞侵襲性逐漸降低，表明芍藥苷成功地抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲能力。Liu 等[7]發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可抑制HepG2 肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，與本研究結(jié)果一致。

表4 各組肝癌HepG2 細(xì)胞蛋白表達(dá)比較（）

表4 各組肝癌HepG2 細(xì)胞蛋白表達(dá)比較（）

注：空白對(duì)照組給予芍藥苷0 μmol/L；芍藥苷低劑量組給予芍藥苷25 μmol/L；芍藥苷中劑量組給予芍藥苷50 μmol/L；芍藥苷高劑量組給予芍藥苷75 μmol/L；與空白對(duì)照組相比，aP＜0.05；與芍藥苷低劑量組比較，bP＜0.05；與芍藥苷中劑量組比較，cP＜0.05

Notch 信號(hào)通路是一種保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)細(xì)胞發(fā)育和凋亡非常重要[13-15]。在哺乳動(dòng)物的四種Notch 受體中，Notch-1 是主要受體[16]。既往有研究證明，Notch-1 信號(hào)通路與肝癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[17-18]；因此，通過抑制該信號(hào)通路的活性有可能抑制肝癌細(xì)胞的上述功能。本研究觀察了Notch 信號(hào)通路在芍藥苷抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲，并誘導(dǎo)凋亡中的潛在作用。我們發(fā)現(xiàn)，HepG2 細(xì)胞暴露于芍藥苷24 h 后，參與Notch-1 信號(hào)通路的Notch-1 和Hes-1蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性顯著降低。提示芍藥苷可能通過抑制Notch-1 信號(hào)通路，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲，并誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，芍藥苷顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2 增殖和侵襲能力，還可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能與芍藥苷抑制Notch-1/Hes-1 信號(hào)通路有關(guān)。