郭麗麗，王東陽(yáng) ，朱坤龍 ，魏宇豪，李樹(shù)偉,*

（1塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

皮膚是哺乳動(dòng)物最大的器官之一［1］，毛囊是皮膚衍生物。毛囊具有獨(dú)特的立體空間結(jié)構(gòu)及周期性的再生功能，靜止?fàn)顟B(tài)的毛囊細(xì)胞在皮膚出現(xiàn)損傷后，表現(xiàn)出迅速增殖和多向分化的潛能，迅速修復(fù)壞死損傷的表皮、毛囊、皮脂腺等，而具體行使修復(fù)功能的細(xì)胞及調(diào)控機(jī)制研究尚且不清楚［2］。毛囊是皮膚附屬器之一，是哺乳動(dòng)物成體中最重要的且處于不斷再生狀態(tài)的器官之一，循環(huán)經(jīng)歷著生長(zhǎng)期、退行期和休止期［3］。毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育分期，對(duì)研究毛囊生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義［4］。毛囊屬于哺乳動(dòng)物皮膚的重要結(jié)構(gòu)和功能亞器官［5］，具有獨(dú)特的可再生能力和高度的自我更新能力，毛囊細(xì)胞經(jīng)增殖分化成熟后最終形成毛發(fā)。不同動(dòng)物的毛囊形態(tài)各有不同，但都具有毛球、毛干、內(nèi)根鞘、外根鞘等基本結(jié)構(gòu)［6］。國(guó)內(nèi)外對(duì)胚胎小鼠的毛囊［7］及出生后不同肢體部位的毛囊，從形態(tài)學(xué)及發(fā)育周期做了相關(guān)的研究［8］，而對(duì)出生后小鼠在不同生長(zhǎng)時(shí)期毛囊發(fā)育變化規(guī)律的研究較少，對(duì)隨著小鼠生長(zhǎng)周期變化，毛囊生長(zhǎng)發(fā)育周期差異缺乏深入研究，對(duì)隨著小鼠年齡的增加，毛囊、毛干生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)生巨大變化的研究目前尚不清楚。

本研究通過(guò)組織切片技術(shù)對(duì)小鼠出生后第1～12 d背部皮膚組織結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行觀察。利用新生同一窩小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)性、同步性，通過(guò)組織切片技術(shù)觀察其背部毛發(fā)變化并進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)差異分析，研究新生小鼠背部皮膚毛發(fā)隨年齡增加，毛干及毛囊生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)的變化規(guī)律。為進(jìn)一步探索皮膚毛囊發(fā)育差異及其調(diào)控機(jī)制提供一定的試驗(yàn)參考，同時(shí)通過(guò)觀察毛囊發(fā)育的規(guī)律，為后期研究藥物對(duì)毛囊發(fā)育的影響及創(chuàng)面愈合修復(fù)皮膚毛囊再生的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠毛囊樣品采集

選取妊娠晚期雌性昆明小鼠6只，來(lái)源于塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地。分籠單獨(dú)飼養(yǎng)，分娩后開(kāi)始隨機(jī)采集5只新生小鼠背部皮膚樣本，后期于同一時(shí)間點(diǎn)處死5只小鼠，將分別采集出生后第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d小鼠的背部皮膚組織樣本，一部分保存至-80℃冰箱備用，另一部分保存至液氮罐中備用。

1.1.2 主要試劑與儀器

試驗(yàn)儀器：LEICA S6E解剖顯微鏡（德國(guó)LEICA公司），MODEL Ckx41SF倒置顯微鏡（日本Olympus公司），LEICA組織攤片拷片機(jī)（德國(guó)LEICA公司），HODIIBOXUN超凈工作臺(tái)上（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），LEICA冰凍切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司），麥克奧迪可視化顯微鏡（廈門(mén)麥克奧迪醫(yī)療診斷有限公司）。

試驗(yàn)試劑：OCT冰凍包埋劑，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；蘇木精、伊紅，購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；多聚甲醛（PFA）、無(wú)水乙醇等生化常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 獲取標(biāo)本及保存方法

新生小鼠，1～12 d每日采樣，采用頸椎脫臼法處死新生小鼠，操作過(guò)程中嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理保護(hù)法，將小鼠于75%乙醇溶液消毒60 s，隨即轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中，剃毛后利用顯微外科剪分離新生小鼠背部皮膚，切成8 mm×8 mm皮片，并將游離皮片轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)上。OCT組織包埋，一部分皮片緊貼包埋盒側(cè)壁，用鑷子移動(dòng)皮片至包埋盒中央并與底面垂直，編號(hào)記錄縱切皮片，最后將包埋樣本轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍24 h備用。取出冰凍OCT組織包埋樣本并使用德國(guó)徠卡切片機(jī)，制作15μm厚度的毛囊縱向組織切片。一部分皮片緊貼包埋盒底面，用鑷子移動(dòng)皮片至包埋盒中央并與底面平行，編號(hào)記錄橫切皮片，最后將包埋樣本轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍24 h備用。取出冰凍OCT組織包埋樣本并使用德國(guó)徠卡切片機(jī)，制作15μm厚度的毛囊橫向組織切片。

1.2.2 HE常規(guī)染色

將保存于-80℃冰箱的縱向、橫向組織切片盒取出，于組織攤片拷片機(jī)上在溫度40℃條件下晾干10 min，移入染色盒內(nèi)，蒸餾水浸潤(rùn)3 min；滴加蘇木素染色5 min；蒸餾水漂洗1 min，待載玻片上多余的蘇木素染液明顯漂洗干凈后；再移入染色盒，滴加1%鹽酸乙醇分化5 s，移入清洗盒，蒸餾水漂洗1 min；再移入染色盒，滴加伊紅染色30 s；移入清洗盒，蒸餾水漂洗2 min，洗凈載玻片上多余的伊紅染液；于50%、75%、100%的乙醇中順濃度梯度各浸泡20 s；使用Histoclear透明劑透明6 s；移入組織切片盒，自然晾干后中性樹(shù)膠封片，轉(zhuǎn)移至麥克奧迪可視化顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 新生小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)形態(tài)觀察

觀察新生昆明小鼠1～12 d皮毛生長(zhǎng)情況，可以發(fā)現(xiàn)剛出生的小鼠皮膚紅潤(rùn)，肉眼看不到皮毛，直到出生后第5 d才可以觀察到小鼠背部長(zhǎng)出細(xì)小的白色絨毛（見(jiàn)圖1）。

小鼠出生時(shí)背部皮膚有大量的褶皺，隨著日齡的增加，褶皺逐漸變淺，于7日齡褶皺消失。小鼠出生時(shí)背部皮膚為鮮紅色，隨著小鼠日齡的增長(zhǎng)，皮膚顏色逐漸變淺，毛發(fā)逐漸發(fā)生變化，于5日齡可以觀察到小鼠背部長(zhǎng)出細(xì)小的白色毛發(fā)，這種變化主要是毛發(fā)密度和毛發(fā)長(zhǎng)度的增加。

2.2 新生昆明小鼠毛囊縱切面觀察

將不同日齡的小鼠皮膚樣本進(jìn)行縱切，HE染色，用（40×、100×、200×、400×）顯微鏡觀察皮膚毛囊發(fā)育情況，可以發(fā)現(xiàn)毛囊長(zhǎng)而直，在皮膚內(nèi)斜向生長(zhǎng)。毛球較毛干著色較深，真皮乳頭較清晰，根鞘完整，毛囊的長(zhǎng)度隨著小鼠日齡的增加不斷增加（見(jiàn)圖2）。

觀察毛囊切片，利用分析軟件測(cè)量毛囊的深度，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并進(jìn)行差異顯著性分析，由圖3分析可知，昆明小鼠毛囊的深度隨著年齡的增長(zhǎng)而不斷加深，這種隨著年齡增長(zhǎng)不斷加深的趨勢(shì)主要集中在出生后1～7 d，在第7 d后逐漸趨于平穩(wěn)。

圖3 新生昆明小鼠毛囊深度分析

2.3 新生昆明小鼠毛囊橫切面觀察

將不同日齡小鼠皮膚進(jìn)行橫切，HE染色，觀察毛囊發(fā)育情況，可以發(fā)現(xiàn)毛囊的密度越來(lái)越大，數(shù)量不斷增加（見(jiàn)圖4）。

圖4 新生昆明小鼠毛囊橫切面觀察

分別于新生小鼠出生后第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d取樣，每次5只小鼠，每只小鼠皮膚橫切2個(gè)載玻片，進(jìn)行HE染色，每個(gè)載玻片選取一個(gè)（400×）視野計(jì)數(shù)，由圖5的結(jié)果可知，昆明小鼠毛囊的數(shù)量隨著年齡的增長(zhǎng)而不斷增加，這種隨著年齡增長(zhǎng)毛囊數(shù)量增加的趨勢(shì)主要集中在出生后1～9 d，在第9 d后逐漸趨于平穩(wěn)。

圖5 新生昆明小鼠毛囊計(jì)數(shù)

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育分化及毛囊的生長(zhǎng)周期有相關(guān)的研究報(bào)道［9-10］，發(fā)現(xiàn)有關(guān)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控信號(hào)通路［11］。皮膚在哺乳動(dòng)物的體表起保護(hù)作用，是面積最大的器官［12］，其主要包括毛囊、皮脂腺、毛干等附屬結(jié)構(gòu)。毛囊是一個(gè)形態(tài)和結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的皮膚附屬器官，并且具有獨(dú)特的立體構(gòu)象，其控制著毛發(fā)的生長(zhǎng)，具有自我更新和周期性生長(zhǎng)的特點(diǎn)。在皮膚分化發(fā)育的過(guò)程中，毛囊也按照固定的形式分階段分化發(fā)育成熟。毛囊在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受多種因子的共同調(diào)控［13-14］，這些相關(guān)調(diào)控因子主要包括：激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)肽等，毛囊周期包括三個(gè)階段：生長(zhǎng)期、退化期、靜止期，毛囊在胚胎發(fā)育過(guò)程中形成，出生后毛乳頭變化較少，但是毛乳頭以外的其他成分不斷的循環(huán)變化［15］。

本試驗(yàn)通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)昆明小鼠出生后1～12 d毛囊生長(zhǎng)發(fā)育呈現(xiàn)出周期性變化，且處于同一生長(zhǎng)時(shí)期的毛囊形態(tài)具有高度相似性。新生小鼠毛干及內(nèi)根鞘處于比較活躍的狀態(tài)，小鼠毛囊密度、長(zhǎng)度和深度在出生后一周發(fā)生急劇變化。小鼠毛囊生長(zhǎng)初期，主要是毛囊長(zhǎng)度增長(zhǎng)，生長(zhǎng)活躍，毛乳頭也隨之增長(zhǎng)，深入真皮，毛球部明顯寬于毛根部；毛囊生長(zhǎng)中期，毛囊縮短，毛乳頭致密；毛囊生長(zhǎng)末期，毛囊萎縮，其底部成棒狀，毛干脫落，開(kāi)始進(jìn)入下一個(gè)毛囊周期，逐漸長(zhǎng)出新毛。小鼠毛囊組織結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入的分析研究。

綜上所述，小鼠皮膚及其附屬結(jié)構(gòu)（毛囊）的急劇變化期發(fā)生在小鼠出生后的一周時(shí)間內(nèi)，該時(shí)期具有顯著的表觀形態(tài)學(xué)變化。因此這個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期可以作為毛囊及皮膚研究的最佳時(shí)期。毛囊及皮膚相關(guān)蛋白表達(dá)與發(fā)育成熟后的個(gè)體可能存在巨大的差異，并且毛囊及皮膚相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平與發(fā)育成熟后的個(gè)體可能同樣存在巨大的差異。本試驗(yàn)的研究成果，可以為皮膚及毛囊的進(jìn)一步深入研究提供理論參考。