仵菲，買(mǎi)里得爾·葉拉里，白紅進(jìn),*

（1新疆兵團(tuán)南疆化工資源利用工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

新疆庫(kù)爾勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yü)屬于白梨系統(tǒng)，是薔薇科（Rosaceae）梨屬（Pyrus spp.）植物［1］，在新疆種植面積廣、年產(chǎn)量高，果實(shí)一般呈黃綠色并略帶紅色。香梨中含有多糖、酚類(lèi)化合物、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，具有潤(rùn)肺、消痰、保肝利膽等功效［2］。

多酚類(lèi)化合物是留存于植物中的次生代謝產(chǎn)物，在植物的果實(shí)、莖、葉中儲(chǔ)藏量非常豐富［3-4］，具有顯著的抗病毒、降血脂、清除自由基、保護(hù)心血管等作用，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域［5］。近年來(lái)，不斷有文獻(xiàn)報(bào)道，從紅棗［6］、煙草［7］、百香果［8］等植物中提取到多酚類(lèi)物質(zhì)，但對(duì)于庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同部位多酚提取工藝優(yōu)化的研究較少。多酚類(lèi)化合物的提取方法目前大多是超聲波輔助有機(jī)溶劑提?。?-12］，因?yàn)槌曒o助法可加快有機(jī)溶劑滲透到植物細(xì)胞中，縮短提取時(shí)間、提高提取率［13］。響應(yīng)面法是目前常用的試驗(yàn)優(yōu)化方法，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學(xué)等領(lǐng)域［14-15］，其特點(diǎn)是試驗(yàn)周期短、精密度高、預(yù)測(cè)性能好，并且能研究幾種因素交互作用［16］。目前對(duì)于評(píng)價(jià)植物體外抗氧化活性的方法有很多，其中DPPH自由基清除能力是一種靈敏、簡(jiǎn)單易行的有效檢測(cè)方法［17］。

本試驗(yàn)以新疆庫(kù)爾勒香梨為試材，選用乙醇為有機(jī)溶劑，采用超聲輔助法提取庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同部位中的總多酚，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，通過(guò)DPPH自由基清除率測(cè)定其總多酚的抗氧化性能，掌握庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同部位總酚含量的分布情況，為新疆南疆庫(kù)爾勒香梨資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

供試材料為新疆庫(kù)爾勒香梨，采集于新疆阿拉爾市塔里木大學(xué)校園內(nèi)（81°17′41.61″E，40°32′23.50″N），將采集的香梨洗凈后立即分離果皮、果肉、核外果肉和果核，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

沒(méi)食子酸（AR）購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；福林酚試劑（AR）購(gòu)自Solarbio公司；無(wú)水乙醇（AR）、NaNO2（AR，≥99.8%）、Al(NO3)3（AR，≥99.8%）、NaOH（AR，≥99.8%）、Na2CO3（AR，≥99.0%）等，購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；蘆?。ā?7.0%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；DPPH購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司。

N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海泉杰儀器有限公司；OSB-2100水浴熱鍋，上海泉杰儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；BS124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV1800可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考周麗萍等［18］研究方法，在760 nm處測(cè)定吸光度值，橫坐標(biāo)為沒(méi)食子酸濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值，獲得線性回歸方程：y=12.350x+0.115，相關(guān)系數(shù)r2=0.999。

1.2.2 庫(kù)爾勒香梨多酚的提取工藝

稱取一定量的樣品，加入70%的乙醇，料液比為1:15，50℃下超聲提取40 min，抽濾后取上清液濃縮，按1.2.1的方法重復(fù)測(cè)定3次吸光度值。計(jì)算公式如下：

式（1）中，E為香梨多酚提取量，mg/g；C為總多酚質(zhì)量濃度，mg/g·FW；V為多酚提取液定容的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)，W為庫(kù)爾勒香梨原料質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

在恒定的超聲功率條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素對(duì)庫(kù)爾勒香梨不同果實(shí)部位總多酚提取量的影響。固定其他3個(gè)因素，分別選取乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%、60%、70%、80%，料液比 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，提取時(shí)間 20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，提取溫度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)［19-20］，確定超聲輔助提取庫(kù)爾勒香梨多酚的最適提取工藝參數(shù)。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化工藝

以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化庫(kù)爾勒香梨果實(shí)各部位總多酚的提取工藝參數(shù)。以庫(kù)爾勒香梨果實(shí)總多酚提取量為響應(yīng)值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、時(shí)間（C）確定庫(kù)爾勒香梨各部位總多酚的最佳提取工藝條件［21-22］。

1.2.5 DPPH自由基清除率

樣品組：取7支試管分別吸取1.00 mL不同濃度的樣品提取液與2.00 mL0.05 mmol/LDPPH溶液混勻；

對(duì)照組：1.0 mL無(wú)水乙醇與2.00 mL 0.05 mmol/L DPPH溶液混勻；

以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，蘆丁作為陽(yáng)性對(duì)照，于517 nm處測(cè)定吸光度值。

DPPH自由基清除率［23-24］計(jì)算式為：

式（2）中，Y為DPPH自由基清除率；A0為波長(zhǎng)517 nm處空白樣品的吸光度值；A1為波長(zhǎng)517 nm處樣品的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

線性回歸方程：y=12.350x+0.115，r2=0.999，如圖1所示。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖2可知，4個(gè)因素對(duì)庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同部位總多酚提取量的影響趨勢(shì)均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，其中果皮和果核的變化趨勢(shì)較為明顯。由圖2（a）可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同部位的總多酚提取量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%左右總多酚的提取量最高，宋慧等［25］也證明了采用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液提取梨皮多酚效果最好，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%作為進(jìn)一步工藝優(yōu)化試驗(yàn)條件；由圖2（b）可以看出，隨著料液比的增大，總多酚提取量先增加后降低，其中料液比為1:15時(shí)，庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同部位總多酚的提取量最高，故選擇料液比在1:15作為進(jìn)一步工藝優(yōu)化試驗(yàn)范圍；由圖2（c）可以看出，隨著提取時(shí)間不斷延長(zhǎng)多酚提取量先升高，40 min后逐漸下降，因此選擇提取時(shí)間30～50 min作為進(jìn)一步工藝優(yōu)化試驗(yàn)范圍；由圖2（d）可以看出，隨著提取溫度不斷升高，總多酚的提取量呈先增加后減小的趨勢(shì)，在40℃時(shí)達(dá)到最高值，因此選擇30～50℃作為進(jìn)一步工藝優(yōu)化試驗(yàn)范圍。

圖2 不同試驗(yàn)因素對(duì)庫(kù)爾勒香梨果實(shí)各部位多酚提取率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化總多酚提取工藝

利用Design Expert 8.0.6軟件分析得到的香梨果實(shí)各部位總多酚的多元二次回歸模擬方程如下式所示，其中，Y表示庫(kù)爾勒香梨果實(shí)總多酚含量的預(yù)測(cè)值，e為自然常數(shù)。

Y（果皮）=17.02+0.25A+0.021B-0.032C-2.500e-0.03AB-0.030AC-0.065BC-0.47A2-0.27B2-0.12C2

Y（果肉）=0.50+0.019A+3.750e-0.03+0.014C+0.020AB-7.250e-0.03AC-0.026BC-0.13A2-0.095B2-0.045C2

Y（核外果肉）=0.53+0.013A+0.012B+6.375e-0.03C+0.024AB+0.023AC-1.000e-0.03BC-0.15A2-0.13B2-0.10C2

Y（果核）=6.03+0.26A-0.032B+0.030C+0.14AB+0.015AC-0.090BC-1.09A2-0.57B2-0.48C2

庫(kù)爾勒香梨果皮中總多酚的響應(yīng)面回歸模型的方差分析見(jiàn)表1。該模型的相關(guān)系數(shù)r2=0.988 3，P＜0.000 1（差異極顯著）；失擬項(xiàng)P值為0.463 0＞ 0.05（不顯著），表明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值擬合程度較高，因此該模型能夠預(yù)測(cè)庫(kù)爾勒香梨果皮總多酚提取量［26］。通過(guò)F值分析可知，各因素對(duì)總多酚提取量影響的大小順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)（A）＞時(shí)間（C）＞料液比（B）。

表1 庫(kù)爾勒香梨果皮中多酚的回歸方程方差分析

庫(kù)爾勒香梨果肉中總多酚的響應(yīng)面回歸模型的方差分析見(jiàn)表2。該模型的相關(guān)系數(shù)r2=0.849 6，P＜0.041具有顯著性；失擬項(xiàng)P 值0.105 7＞ 0.05（不顯著），說(shuō)明擬合情況良好。通過(guò)F值分析可知，各因素對(duì)總多酚提取量影響的大小順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)（A）＞時(shí)間（C）＞料液比（B）。

表2 庫(kù)爾勒香梨果肉中多酚的回歸方程方差分析

庫(kù)爾勒香梨核外果肉中總多酚的響應(yīng)面回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。該模型的相關(guān)系數(shù)r2=0.914 2，P＜0.005 4（差異極顯著）。該模型的純誤差均方和較小為4.480e-0.05，說(shuō)明此模型有效，應(yīng)用響應(yīng)面發(fā)優(yōu)化提取香梨總多酚的提取工藝可行［27］。通過(guò)F值分析可知，各因素對(duì)總多酚提取量影響的大小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞料液比（B）＞時(shí)間（C）。

表3 庫(kù)爾勒香梨核外果肉中多酚的回歸方程方差分析

庫(kù)爾勒香梨果核中總多酚的響應(yīng)面回歸模型的方差分析見(jiàn)表4。該模型決定系數(shù)r2=0.995 3，P＜0.000 1（差異極顯著）；失擬項(xiàng)P值0.394 9＞0.05（不顯著），說(shuō)明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間擬合程度較高。該模型的純誤差均方和較小為5.170e-0.03，說(shuō)明此模型有效，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取香梨總多酚的提取工藝可行［28］。通過(guò)F值分析可知，各因素對(duì)總多酚提取量影響的大小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞料液比（B）＞溫度（C）。

表4 庫(kù)爾勒香梨果核中多酚的回歸方程方差分析

2.4 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

將庫(kù)爾勒香梨果實(shí)總多酚的最佳提取條件調(diào)整為體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，料液比為1:15，溫度40℃下提取40 min，在此工藝條件下得到果皮、果肉、核外果肉和果核中總多酚的提取量分別為(17.060±0.400)mg/g·FW、(0.532±0.053)mg/g·FW、(0.530±0.032)mg/g·FW和(6.100±0.200）mg/g·FW（試驗(yàn)3次取平均值），與預(yù)測(cè)值16.985 mg/g·FW、0.507 mg/g·FW、0.538 mg/g·FW和5.974 mg/g·FW，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間差距不大，說(shuō)明該模型可行有效。

2.5 抗氧化活性的測(cè)定

由圖3可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，庫(kù)爾勒香梨果肉、核外果肉和果核中總多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果低于蘆丁，但隨濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的最大清除率達(dá)50%～70%，果皮對(duì)DPPH自由基的清除效果大于陽(yáng)性對(duì)照（蘆?。┰囼?yàn)為85%，隨著濃度的增加，兩者的清除率趨于接近。由圖4可知，IC50值越小抗氧化活性越強(qiáng)，各部位的抗氧化活性由強(qiáng)到弱的次序?yàn)椋汗ぃ竟耍竞送夤猓竟?。綜上分析，庫(kù)爾勒香梨果皮的多酚對(duì)DPPH自由基有明顯（P＜0.05）的清除效果。

圖3 庫(kù)爾勒香梨果實(shí)各部位多酚對(duì)DPPH自由基的清除率

圖4 庫(kù)爾勒香梨果實(shí)各部位多酚對(duì)DPPH自由基的IC50值

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以庫(kù)爾勒香梨為試材，采用超聲輔助提取法提取其果實(shí)不同部位中的總多酚，通過(guò)單因素和響應(yīng)面工藝優(yōu)化試驗(yàn)確定了影響香梨不同部位中總多酚的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1:15，提取時(shí)間40 min，提取溫度40℃，庫(kù)爾勒香梨果皮、果肉、核外果肉和果核中總多酚的提取量分別為(17.060±0.400)mg/g·FW、(0.532±0.053)mg/g·FW、(0.530±0.032)mg/g·FW、(6.100±0.200)mg/g·FW，蘇艷麗等［29］以100%的甲醇為溶劑，采用超聲輔助提取法測(cè)得的梨果多酚提取量為0.0564 mg/g，相比之下，本研究采用乙醇為溶劑不僅毒性小且多酚提取效果更好。庫(kù)爾勒香梨果皮、果肉、核外果肉和果核中總多酚對(duì)DPPH自由基清除率最高時(shí)分別為85%、60%、67%、72%，且IC50值從低到高次序?yàn)椋汗ぃ竟耍竞送夤猓竟?，故新鮮庫(kù)爾勒香梨果皮中總多酚含量較高且抗氧化能力較強(qiáng)，高于宋慧等［25］研究的梨皮多酚的DPPH自由基清除率。目前隨著對(duì)庫(kù)爾勒香梨果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)的深入研究，對(duì)于香梨不同果實(shí)部位酚類(lèi)物質(zhì)的開(kāi)發(fā)日益上升，但是對(duì)庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同部位多酚提取工藝的研究較少，故本試驗(yàn)可為梨品種總多酚的提取提供技術(shù)參考，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。