賈航航，羅生杰，譚莉萍，王寧，李永樂，張建萍 ,2*

（1塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

炎癥是最常見的疾病之一，與心血管病、腫瘤、阿爾茨海默病等多種疾病的發(fā)生有關(guān)，導(dǎo)致炎癥發(fā)生的主要原因有傷口感染、吸入性感染等。建立小鼠炎癥模型的目的在于模仿炎癥發(fā)生的因素、臨床特征，從而為炎癥的治療提供合理有效的方法。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）進入小鼠機體會影響巨噬細胞，致使小鼠出現(xiàn)炎癥［1-2］。由相關(guān)文獻可知，使用二甲苯建立小鼠模型使用的研究較多［3］，使用LPS建立小鼠炎癥模型的研究不多，而使用苦苣菜處理LPS誘導(dǎo)的炎癥模型尚未見文獻報道。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子的調(diào)節(jié)失控，會使其大量分泌，最終導(dǎo)致機體炎癥的發(fā)作。炎癥產(chǎn)生的機制一般情況下與核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的激活有關(guān)［4］。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1，HMGB1）存在于細胞核內(nèi)，可調(diào)節(jié)炎癥通路，Toll樣受體4（toll-like receptors-4，TLR4）是細胞膜上LPS的受體，參與機體的炎癥調(diào)節(jié)［5］。炎癥發(fā)生時，HMGB1和TLR4可以活化NF-κB信號通路，釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等［6］。當機體接受外界刺激后，機體內(nèi)一氧化氮合酶（iNOS）會促進NO含量升高，進而殺死入侵機體的各種病原體，對于炎癥治療具有重要意義。

相關(guān)文獻報道，苦苣菜（Sonchus oleraceus L.）的成分包括倍半萜、苷類、三萜、甾體類、黃酮類、香豆素類及木脂素類等［7］，有治愈咳嗽、咽喉炎等功效［8］。本試驗以苦苣菜水提物為研究材料，通過LPS誘導(dǎo)建立小鼠炎癥模型，進一步研究苦苣菜水提物的抗炎作用。通過檢測苦苣菜水提物對小鼠血清和腎臟中TNF-α、IL-6及iNOS的含量，以及腎中信號通路HMGB1/TLR4/NF-κB蛋白表達量，進而判斷苦苣菜水提物的抗炎效果，為進一步了解其抗炎機制提供理論依據(jù)和試驗數(shù)據(jù)，也為開發(fā)苦苣菜的藥用價值提供參考，更為治療炎癥藥物的研發(fā)提供了思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實訓(xùn)基地飼養(yǎng)的小鼠（雌雄各半）。飼養(yǎng)溫度為20～26℃，試驗小鼠的飲水、情緒、飲食等表現(xiàn)正常。

1.1.2 試驗試劑

LPS、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、乙二胺四乙酸二鈉、甘氨酸、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、雙蒸水、氨基丁三醇、甲醇、磷酸緩沖鹽溶液、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍、氯化鈉、乙酸、脫脂奶粉、硫酸鎳胺、過氧化氫。

1.1.3 試驗儀器

高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-45L，上海申安醫(yī)療器械廠）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Hei-VAPAdvantage，上海亞榮生化儀器廠）、制冰機（SZB-100，常熟市菱科電器有限公司）、移液槍（DLAB Toppette，生工生物工程上海股份有限公司）、電熱恒溫干燥箱（DHP-9272，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、超低溫冰箱（MDF-U53V，日本）、冰箱（BCD-216TMZL，青島海爾股份有限公司）、純水儀（Milli-Q，烏魯木齊中環(huán)時代科技有限公司）、漩渦震蕩器（QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、冷凍干燥機（LGJ-10C，北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司）、電子分析天平（ML204/02，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、低溫超速離心機（Heraeus Pico 17，Germany）、酶標儀（BIO-RAD，上海卓的儀器有限公司）、電泳儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）、離心管（生工生物工程股份有限公司）、硝酸纖維素膜（生工生物工程股份有限公司）、數(shù)顯分散機（德國IKA T18 digital ULTRA-TURRAX）、刮棒（生工生物工程股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 苦苣菜水提物的制備

苦苣菜采摘于塔里木大學(xué)校園內(nèi)81°30′E，40°55′N。將采摘的苦苣菜洗干凈后陰干，取苦苣菜陰干物用磨粉機磨碎后過80目篩，將苦苣菜陰干粉與蒸餾水按固液比為1∶10置于三角瓶中，在臺式數(shù)控超聲機中超聲粉碎30 min，用真空抽濾機過濾，棄殘渣取過濾液，于-80℃冰箱過夜，第2 d取出后敲碎成黃豆般大小的顆粒狀，放入冷凍干燥機中直到樣品變成粉末。將制得的凍干粉，收集并貼好標簽，置于-80℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LPS誘導(dǎo)小鼠炎癥模型的建立

將小鼠隨機分為6組：空白組、模型組、陽性對照組及苦苣菜水提物處理組（低、中、高濃度）。低、中、高濃度組小鼠依次各使用0.3mL100mg/mL、200mg/mL、400 mg/mL的苦苣菜水提物，一天給藥兩次，每次間隔12 h，持續(xù)一周。在第7 d正常處理0.5 h后，給空白組小鼠腹腔注射生理鹽水，模型組、陽性對照組、苦苣菜水提物處理組注射30 mg/kg的LPS，6 h后拍照并記錄小鼠的狀態(tài)［9］。在小鼠眼球取血，將獲得的血清低溫離心20 min，取上清液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ谛∈舐樽砗蠼馄?，將組織置于生理鹽水中清洗，然后放進凍存管，液氮速凍，于-80℃的冰箱保存?zhèn)溆茫?0］。

1.2.3 勻漿介質(zhì)的配制

稱取 Tris-HCl（0.01 mol/L）0.157 g，LEDTA-2Na 0.003 g，蔗糖（0.01 mol/L）3.422 g，量取0.8%氯化鈉溶液50 mL，PH為7.4。將整個腎臟器官置于冰上，剪碎，面積大約為1 mm2，之后使用勻漿機勻漿30 s，直至離心管中無明顯顆粒后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，低溫3 000 r/min，離心20 min，棄沉淀，取上清液，將其轉(zhuǎn)入新的離心管，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 小鼠腎臟濕/干重（W/D）比值測定

將小鼠麻醉后立即放置在冰上解剖，獲得小鼠腎臟，剪去多余的組織，用生理鹽水多次浸泡去除血跡，吸水紙除去腎臟表面水分后稱重，70℃烘72 h，再次稱重，對比稱重前后的數(shù)據(jù)獲得小鼠W/D的比值。

1.2.5 ELISA檢測小鼠血清和腎臟中TNF-α、IL-6、iNOS含量

用ELISA試劑盒進行操作，酶標儀檢測吸光度值（OD值），建立標準曲線，獲得小鼠血清和腎臟中的TNF-α、IL-6、iNOS濃度。

1.2.6 Western blot檢測小鼠腎臟中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平

稱取80～100 mg腎臟組織，剪碎至面積大約為1 mm2，加入1 mL RIPA蛋白裂解液，利用組織勻漿機勻漿（30 s），置于冰上低溫裂解30 min后離心，棄沉淀取上清液于新離心管中。使用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，上樣前將樣品加熱變性，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗 NF-κB（稀釋比為1:1 000）、TLR4（稀釋比為1:500）、HMGB1（稀釋比為1:15 000），4℃下孵育過夜，用TBST洗膜數(shù)次。加入二抗（稀釋比為1:5 000）室溫孵育1 h；用TBST洗膜數(shù)次。加入ECL顯色后，使用凝膠成像系統(tǒng)對其進行成像，最后使用Alpha Ease FC 4.0軟件分析圖像［4］。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS誘導(dǎo)建立小鼠炎癥模型

采用30 mg/kg的LPS腹腔注射處理小鼠，觀察發(fā)現(xiàn)注射2 h后小鼠的活動明顯減少，4 h后大部分小鼠已不再活動，6 h后解剖小鼠，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠W/D的比值大于空白組，并且模型組與空白組相比，模型組小鼠出現(xiàn)腎臟腫脹、肺部發(fā)生炎癥、腸道出現(xiàn)腸脹氣的癥狀，如圖1所示。試驗結(jié)果表明，模型組血清和腎臟中炎癥因子含量顯著高于空白組，且相關(guān)信號通路的蛋白質(zhì)含量明顯降低，因此成功建立了LPS誘導(dǎo)小鼠炎癥模型。

圖1 空白對照組與模型組小鼠腎臟、肺部、腸道比照圖

2.2 苦苣菜水提物對小鼠血清中炎癥因子含量的影響

如圖2所示，在小鼠血清中，模型組TNF-α（P＜0.001）、IL-6（P＜0.000 1）含量顯著高于空白組，iNOS含量明顯高于空白組。陽性對照組和苦苣菜水提物處理組 TNF-α（P＜0.001）、IL-6（P＜0.000 1）含量顯著低于模型組，iNOS含量明顯低于模型組。結(jié)果表明，與模型組相比，苦苣菜水提物處理組（低、中、高濃度組）血清中TNF-α和IL-6含量顯著下降。

圖2 ELISA檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6、iNOS含量

2.3 苦苣菜水提物對小鼠腎臟中炎癥因子含量的影響

如圖3所示，在小鼠腎臟中，模型組TNF-α、IL-6含量顯著高于空白組（P＜0.01），iNOS含量明顯高于空白組，且苦苣菜水提物處理組TNF-α、IL-6、iNOS含量均低于模型組，說明苦苣菜水提物在腎臟中具有抗炎作用。

圖3 ELISA檢測小鼠腎臟中TNF-α、IL-6、iNOS含量

2.4 苦苣菜水提物對小鼠腎臟中HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達的影響

如圖4所示，模型組小鼠腎臟中HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達含量較高，苦苣菜水提物處理組HMGB1的蛋白表達水平均低于模型組，且隨著苦苣菜水提物濃度的增大而降低；苦苣菜水提物處理組TLR4的蛋白表達水平中濃度組、低濃度組低于模型組，高濃度組高于模型組，且隨著苦苣菜水提物濃度的增大而升高；苦苣菜水提物處理組NF-κB的蛋白表達水平低濃度組高于模型組，中濃度組和高濃度組低于模型組，且隨著苦苣菜水提物的濃度增大而降低。

圖4 Western blot檢測小鼠腎臟中HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達

3 討論

小鼠被廣泛用于建立動物模型［9］，具有很好的研究背景，LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥的機理較為明確［11-12］，使用LPS處理小鼠，不僅使模型適合該類疾病的特性，而且易于控制，重現(xiàn)性好［10］，所以使用LPS建立小鼠炎癥模型是相對簡單有效的方法。與此同時，在模型使用方面，根據(jù)試驗對象為小鼠的不同器官，可以采用不同的處理方法，建立恰當?shù)哪Ｐ?，在建模之后，可以通過定期檢測LPS處理小鼠炎癥相關(guān)蛋白的特異性表達，明晰抗炎藥物的作用周期，也可以在同一時間測量不同通路但具備相互作用的信號通路，獲得機體內(nèi)動態(tài)的調(diào)節(jié)圖。LPS是導(dǎo)致小鼠部分炎癥發(fā)生的原因，當出現(xiàn)離體的LPS時，其有毒部分類脂蛋白A會刺激免疫細胞，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［13］。建立小鼠炎癥模型的目的在于模仿炎癥發(fā)生的因素、臨床特征，從而為炎癥的治療提供合理有效的方法。目前，國內(nèi)外的學(xué)者普遍使用二甲苯建立小鼠的炎癥模型，而使用LPS誘導(dǎo)建立小鼠炎癥模型的比較少。使用二甲苯建立模型，特點是時間短，多用于建立體外腫脹等炎癥狀態(tài)，LPS建立的小鼠炎癥模型符合小鼠受到革蘭氏陰性菌感染發(fā)生的癥狀。因此，本試驗使用LPS建立小鼠炎癥模型具備非常成熟的理論依據(jù)和試驗前提。根據(jù)文獻報道，處理小鼠建立炎癥模型的LPS濃度有5 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg，但是在短時內(nèi)要達到效果，濃度為30 mg/kg最合適［14］。綜上所述，LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥會刺激巨噬細胞產(chǎn)生并促進炎癥細胞因子大量分泌，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，從而通過多種方法刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫活性物質(zhì)，而且不同的方法和手段刺激的通路不同，產(chǎn)生的炎癥因子不同，適合多種情況。

試驗結(jié)果表明，苦苣菜水提物能夠顯著降低血清中TNF-α和IL-6的含量，明顯降低iNOS的含量，具備顯著的抗炎效果。血清中的TNF-α和iNOS的含量隨著苦苣菜水提物濃度的增大而升高，說明低濃度的苦苣菜水提物在血清中抗炎效果較好，但是IL-6的含量在苦苣菜水提物高濃度組出現(xiàn)降低，說明高濃度的苦苣菜水提物會影響其他因素導(dǎo)致IL-6含量發(fā)生變化，具體的機制推測可能與TLR4含量升高有關(guān)。在腎臟中，苦苣菜水提物能夠降低TNF-α、IL-6、iNOS含量?？嘬牟怂嵛锾幚斫M（低、中、高濃度）與模型組相比，炎癥因子濃度低，表明苦苣菜具備治療腎炎的作用，同時苦苣菜水提物也能夠降低腎臟中HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達水平。NF-κB可以被HMGB1和TLR4聯(lián)結(jié)激活，促成炎癥因子的釋放［15-16］。苦苣菜水提物促使HMGB1/TLR4蛋白表達水平下降，且下調(diào)HMGB1和TLR4蛋白，從而下調(diào)NF-κB 的蛋白，導(dǎo)致 TNF-α、IL-6的分泌量降低。TLR4與苦苣菜水提物濃度成正相關(guān)，與其他研究人員結(jié)果不同。TLR4是LPS的受體，同時也是HMGB1激活NF-κB的輔助因子［17］，推斷30 mg/mL LPS處理小鼠，會導(dǎo)致TLR4大量分泌，同時由于LPS導(dǎo)致的炎癥會使HMGB蛋白大量表達，其表達水平是TLR4的3～4倍，當機體受到外界LPS刺激時HMGB1接收信號被激活，同時NF-κB被激活會結(jié)合并消耗體內(nèi)產(chǎn)生的LPS受體TLR4，從而導(dǎo)致，隨著HMGB1蛋白表達水平的降低導(dǎo)致TLR4蛋白表達水平升高（如圖5）。

圖5 HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路

本試驗中使用30 mg/mL的LPS建立小鼠炎癥模型，具有顯著的致炎效果。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)明顯的腸道脹氣，因此推測小鼠腸道炎癥比較嚴重，但是未能探究苦苣菜水提物對腸炎的治療效果。該結(jié)果有待進一步研究，對比席世兵等［18］研究成果，發(fā)現(xiàn)LPS建立的小腸和盲腸炎癥模型較好［19］，查閱文獻發(fā)現(xiàn)，研究人員大多采用吸入法處理導(dǎo)致小鼠肺發(fā)炎，從而探究相關(guān)藥物的治療效果。炎癥模型的處理方法是建立在前人研究的基礎(chǔ)之上，并使用其最適濃度，如果需進行后續(xù)研究，可以設(shè)置LPS濃度梯度，建立適合于新疆氣候條件下飼養(yǎng)小鼠的最佳炎癥誘發(fā)模型并探究針對不同器官的最適致炎方法。

4 結(jié)論

綜上所述，LPS誘導(dǎo)建立的小鼠炎癥模型，具備較好的致炎效果，使用不同濃度的LPS處理方式，會導(dǎo)致不同的器官產(chǎn)生不同水平的炎癥。本研究通過試驗發(fā)現(xiàn)，苦苣菜水提物能夠抑制HNGB1/TLR4/NF-κB信號通路蛋白的生成進而降低炎癥因子的表達，因此表明苦苣菜具備明顯的抗炎效果。