江利亞，張玉想，張志華，王佳興，毛漢丁

1河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北張家口 075000；2解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100091；3河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北張家口 075000；4解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100853

熱射病(heat stroke，HS)是中暑最嚴(yán)重的一種疾病狀態(tài)，根據(jù)致熱因素不同可分為經(jīng)典型(非勞力性)及勞力性兩種[1]，其中勞力性熱射病(exertional heat stroke，EHS)是一種致死性疾病，主要為高溫環(huán)境下運動或勞作產(chǎn)生的內(nèi)源性熱所致[2]。EHS導(dǎo)致機體產(chǎn)熱-散熱失衡，引起體溫迅速升高，甚至超過40 ℃。EHS是一種伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常(主要為意識障礙)的多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)致死性疾病，好發(fā)于夏季劇烈運動的青年人或在高溫環(huán)境中工作的建筑工人等[3]。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)及急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是EHS的常見并發(fā)癥[4-5]，但目前EHS相關(guān)肺損傷的發(fā)病機制仍不明確。

自噬是指在細(xì)胞代謝過程中依賴溶酶體途徑將受損細(xì)胞器及異常蛋白質(zhì)降解的過程，它受多種信號分子及信號通路的調(diào)節(jié)，是機體一種重要的自我防御及保護機制[6-7]。研究證實，自噬參與了膿毒癥肺損傷的發(fā)生，而上調(diào)自噬則能減輕膿毒癥小鼠的肺損傷[8-10]。在HS中，自噬與HS的心肌損傷及腦損傷有密切關(guān)系，適度上調(diào)自噬有助于減輕HS的心肌損傷及腦損傷[11-12]。但自噬改變是否參與了EHS肺損傷的發(fā)生目前鮮見報道。本研究通過建立EHS大鼠模型，探討了自噬在EHS肺損傷中的作用，以期為EHS相關(guān)ALI的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 六道小動物跑臺(XR-PT-10A，上海欣軟信息科技有限公司)放置于透明模擬高溫高濕環(huán)境實驗艙中[13]，該艙能精準(zhǔn)控制艙內(nèi)溫度及濕度并維持恒定。巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1，Baf A1)、伊文思藍(Evans blue，EB)均購自美國MCE公司；雷帕霉素(rapamycin，RAPA)購自美國APExBIO公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3)抗體購自美國CST公司；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphatedehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體及兔單克隆抗體p62均購自英國Abcam公司；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)試劑盒購自瑞士Roche公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；甲酰胺購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 實驗動物 健康清潔級成年Wistar雄性大鼠60只，體重300～350 g，購自斯貝福(北京)生物科技有限公司，許可證編號：SCXK(京)2019-0010。動物飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心動物實驗室(SPF級)，溫度25～26 ℃，相對濕度為50%～60%。實驗動物相關(guān)方案通過解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 研究方法

1.3.1 大鼠適應(yīng)性跑步訓(xùn)練 在進行熱打擊之前，實驗大鼠均在室溫(25～26 ℃)下采用階梯鍛煉法進行為期1周的適應(yīng)性訓(xùn)練。前3 d按以下程序進行：大鼠從飼養(yǎng)籠轉(zhuǎn)移至實驗艙后，以初始速度5 m/min開始跑步(坡度為0)，每2 min增速1 m/min，20 min增速至15 m/min后維持勻速跑，直至出現(xiàn)疲勞狀態(tài)(經(jīng)輕推、噪聲等無痛刺激驅(qū)趕后仍不能堅持跑步持續(xù)5 s以上)，跑步時間不超過30 min。第4、5天，增速方案如前，但跑步時間延長至60 min。第6、7天為休息日，大鼠僅進行艙內(nèi)環(huán)境適應(yīng)，不進行跑步訓(xùn)練。訓(xùn)練期間大鼠自由進食、飲水。

1.3.2 EHS大鼠模型的建立 大鼠熱應(yīng)激實驗前禁食12 h，飲水不限。在開始建模前30 min稱重并禁止飲水。當(dāng)實驗艙溫度達到(39.5±0.3) ℃、相對濕度為(55%±5%)時，將大鼠放入跑臺[14-15]，以5 m/min的初始速度開始跑步(坡度為0)，每2 min增速1 m/min，20 min增速至15 m/min后保持恒定速度持續(xù)跑步，直到出現(xiàn)疲勞狀態(tài)(適當(dāng)驅(qū)趕后仍無法繼續(xù)跑步)停止跑步。實驗全程嚴(yán)密觀察大鼠意識、精神變化，在大鼠達到EHS診斷標(biāo)準(zhǔn)后，將其從熱艙中取出，停止熱暴露，繼續(xù)監(jiān)測大鼠精神狀態(tài)至建模后5 h。EHS的診斷標(biāo)準(zhǔn)為大鼠出現(xiàn)HS神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙表現(xiàn)，即無自主活動時間大于5 s(輕度無痛刺激不能驅(qū)趕動物爬行或改變位置)[16-17]。

1.3.3 實驗動物分組 將60只健康清潔級雄性Wistar大鼠按照隨機數(shù)字表法分為4組：正常對照組、EHS組、EHS+Baf A1組、EHS+RAPA組，每組15只。其中29只大鼠用于EB實驗(正常對照組、EHS組和EHS+Baf A1組，每組7只)，EHS+RAPA組為8只；剩余31只大鼠用于其余實驗。正常對照組不做任何處理，EHS組建模成功后立即從熱艙中取出，于室溫(22～24 ℃)下放置自然降溫，嚴(yán)密觀察大鼠精神、意識變化。RAPA(規(guī)格：25 mg)、Baf A1(規(guī)格：1 mg)溶解于100% DMSO溶液中，配制濃度為2 g/L的原液，兩種藥物分別在大鼠建模前于每日同一時間點以1 mg/kg劑量連續(xù)腹腔注射4 d。各組大鼠均于建模后5 h處死，取肺等器官組織進行后續(xù)實驗。

1.3.4 大鼠肺組織大體形態(tài)學(xué)觀察 采用腹主動脈放血法處死大鼠，取大鼠雙肺組織，肉眼觀察雙側(cè)肺部的顏色、光澤、彈性、淤血及腫脹程度。

1.3.5 大鼠動脈血氣分析 建模后5 h，大鼠經(jīng)腹腔麻醉后開腹，分離附著于腹主動脈上的結(jié)締組織，用肝素抗凝的1 ml動脈血氣針經(jīng)腹主動脈采集0.5 ml血液，使用PREMIER 4000動脈血氣分析儀測定動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)。

1.3.6 大鼠肺系數(shù)測定 采用腹主動脈放血法處死大鼠后取雙肺組織，PBS液反復(fù)漂洗，用濾紙吸干肺組織表面水分，稱量全重，計算肺系數(shù)(lung weight/body weight，LW/BW)。LW/BW=肺濕重(mg)/大鼠體重(g)。

1.3.7 大鼠肺血管通透性測定 采用EB染色檢測大鼠肺組織通透性[18]。將EB染料溶于生理鹽水配制為2%的溶液，以2 ml/kg劑量從大鼠尾靜脈注入，觀察到大鼠眼睛、耳朵變藍即可確認(rèn)染料已被吸收并分布于大鼠體內(nèi)。EB在體內(nèi)循環(huán)2 h后，經(jīng)腹腔麻醉開胸，剪開右心耳，經(jīng)左心室注入10 ml PBS液，沖出循環(huán)系統(tǒng)中殘留的EB，直至右心房流出的液體呈無色清亮狀。取全肺組織，將肺組織及甲酰胺按照0.1 g∶1 ml的比例浸泡萃取，然后放置于60 ℃溫箱中孵育16 h，待組織中色素全部浸出，取出組織，1 500 r/min離心10 min后取上清液，用分光光度計在620 nm波長處進行比色，測量吸光度值(A)，并計算肺組織中的EB含量。

1.3.8 大鼠肺組織病理學(xué)觀察 剪取各組大鼠右肺下葉組織小塊，置于4%甲醛溶液固定，經(jīng)過乙醇梯度脫水、常規(guī)石蠟包埋后切片(厚度4 μm)，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。根據(jù)Hong等[19]的標(biāo)準(zhǔn)進行肺組織病理學(xué)損傷評分，在倒置顯微鏡(200倍)下隨機選取10個視野，觀察肺組織病理學(xué)變化并進行評分。評分項目包括肺泡腔充血、中性粒細(xì)胞浸潤、纖維蛋白滲出、肺泡間隔增寬，每項按損傷程度評為0、1、2、3分，分別為無損傷及輕度、中度、重度損傷，計算平均得分。

1.3.9 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況 取肺組織石蠟切片，梯度乙醇脫蠟，自來水沖洗，滴入蛋白酶工作液，于37 ℃孵育20 min，PBS洗滌；滴加TUNEL溶液，于37 ℃孵育1 h，PBS洗滌；再滴加TUNEL溶液，室溫孵育20 min，PBS沖洗后進行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，透明、封片，光鏡下觀察。陽性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞呈棕黃色，正常細(xì)胞呈藍色。采用Image J圖像分析軟件對各組TUNEL染色切片圖像進行分析，每張切片顯微鏡下隨機選取5個視野(200倍)，計算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。AI=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.10 Western blotting檢測大鼠肺組織中LC3及p62蛋白表達量 將肺組織按比例加入預(yù)冷的組織裂解液中裂解，BCA法測定蛋白濃度，行12% SDSPAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入一抗兔抗大鼠LC3抗體(1∶1000)及兔抗大鼠單克隆抗體p62(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBS-T洗滌，分別加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG，1∶2000)，化學(xué)發(fā)光法顯色。以GADPH作為內(nèi)參照，采用IPP軟件對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析，并計算蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織大體形態(tài)學(xué)觀察 正常對照組大鼠肺組織肉眼觀呈粉紅色，表面光滑，色澤光亮；EHS組大鼠肺組織腫脹明顯，色澤暗淡，呈暗紅色，且液體滲出較多。與EHS組比較，EHS+Baf A1組大鼠肺組織腫脹明顯加重，整肺發(fā)生嚴(yán)重水腫，肺組織間隙聚積過多液體，由于重力影響使肺部不能保持正常形狀，表面伴多處出血點，而EHS+RAPA組大鼠肺組織腫脹情況明顯減輕，表面顏色近似粉紅色，且滲出減少(圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織標(biāo)本肉眼觀Fig. 1 Macroscopic view of lung tissue specimens of rats in each group

2.2 各組大鼠PaO2、PaCO2比較 與正常對照組比較，EHS組大鼠PaO2降低，PaCO2升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與EHS組比較，EHS+Baf A1組PaO2下降，PaCO2升高，EHS+RAPA組PaO2升高，PaCO2降低，接近正常范圍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠PaO2、PaCO2比較(mmHg,±s, n=15)Tab.1 Comparison of PaO2 and PaCO2 of rats in each group(mmHg, ±s, n=15)

表1 各組大鼠PaO2、PaCO2比較(mmHg,±s, n=15)Tab.1 Comparison of PaO2 and PaCO2 of rats in each group(mmHg, ±s, n=15)

EHS. 勞力性熱射??；Baf A1. 巴弗洛霉素A1；RAPA. 雷帕霉素；PaO2. 動脈血氧分壓；PaCO2. 動脈血二氧化碳分壓；與正常對照組比較，(1)P<0.05；與EHS組比較，(2)P<0.05

組別 PaO2 PaCO2正常對照組 248.0±15.5 25.6±4.4 EHS組 135.4±15.6(1) 47.8±4.1(1)EHS+BafA1組 104.2±7.2(2) 61.3±7.5(2)EHS+RAPA組 192.0±17.3(2) 34.0±2.6(2)F 87.350 47.470 P<0.001 <0.001

2.3 各組大鼠肺系數(shù)變化 與正常對照組比較，EHS組大鼠的肺系數(shù)增高[(4.5±0.3) mg/gvs.(3.6±0.2) mg/g]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與EHS組比較，EHS+Baf A1組大鼠肺系數(shù)[(5.3±0.7) mg/g]增高，而EHS+RAPA組肺系數(shù)[(3.7±0.1) mg/g]降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2A)。

2.4 各組大鼠肺血管通透性的變化 與正常對照組比較，EHS組大鼠肺血管通透性明顯增加，EB滲出量增多[(72.0±5.4) μg/gvs. (18.4±1.6) μg/g]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與EHS組比較，EHS+Baf A1組大鼠的血管通透性進一步增加，EB滲出量進一步增多[(80.0±4.9) μg/g]；而EHS+RAPA組大鼠肺血管通透性則明顯下降，EB滲出量減少[(53.9±6.9) μg/g]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。

圖2 各組大鼠肺系數(shù)(A)及EB滲出量(B)比較Fig.2 Comparison of pulmonary index (A) and EB content (B) of rats in each group

2.5 各組大鼠肺組織的病理損傷 HE染色結(jié)果(圖3)顯示，在無熱打擊情況下，正常對照組大鼠肺組織肺泡壁光滑，結(jié)構(gòu)正常無破壞，且肺泡腔無液體滲出；與正常對照組比較，EHS組大鼠肺泡間隔及

圖3 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化Fig.3 Pathological changes of rat lung tissue in each group

肺泡壁明顯增厚不均，部分肺泡塌陷，肺泡腔出現(xiàn)大量紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及血漿樣物質(zhì)滲出，肺組織病理學(xué)評分明顯增加[(7.0±0.1)分vs. (1.5±0.6)分]；與EHS組比較，EHS+Baf A1組大鼠肺組織液滲出、炎癥浸潤程度進一步加重，肺組織病理學(xué)評分明顯增加[(9.2±0.7)分]，而EHS+RAPA組大鼠肺組織液滲出及炎癥浸潤嚴(yán)重程度均不及EHS組，且出血減少，肺泡結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，肺組織病理學(xué)評分明顯降低[(4.3±0.3)分]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況 與正常對照組比較，EHS組大鼠肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)增多，AI明顯升高(50.8%±5.6%vs. 8.0%±1.0%)；與EHS組比較，EHS+Baf A1組大鼠肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)進一步增多，AI明顯升高(84.7%±3.4%)，但EHS+RAPA組大鼠肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)減少，AI明顯降低(33.8%±2.3%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 各組大鼠肺組織凋亡情況比較Fig.4 Comparison of apoptosis of lung tissue of rats in each group

2.7 各組大鼠LC3及p62蛋白表達 與正常對照組比較，EHS組大鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低(0.3±0.1vs. 1.0±0.1)，p62表達水平明顯增高(1.4±0.2vs. 0.8±0.1)。與EHS組比較，EHS+Baf A1組大鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(0.10±0.04)，p62表達水平進一步升高(1.7±0.1)，而EHS+R APA組大鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高(0.5±0.1)，p62表達水平明顯降低(1.1±0.1)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 Western blotting檢測各組大鼠肺組織自噬水平Fig.5 Autophagy levels in lung tissues of rats in each group (Western blotting)

3 討 論

EHS是熱相關(guān)疾病最嚴(yán)重的一種表現(xiàn)，常導(dǎo)致多個臟器發(fā)生損傷，其中肺最易受累[3-4]。EHS引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)會引起肺內(nèi)皮屏障功能障礙，誘導(dǎo)肺毛細(xì)血管通透性增加，最終導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡呈實變狀，肺間質(zhì)彌漫性水腫，肺功能受損[20-21]。上述既往研究結(jié)果與本實驗通過大鼠EHS模型觀察到的EHS組大鼠肺組織肺泡間隔及肺泡壁明顯增厚，肺泡腔出現(xiàn)大量的紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及血漿樣物質(zhì)滲出等ALI病理變化，以及肺系數(shù)、肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)、肺血管通透性、肺水含量增加，PaO2下降的結(jié)果相一致，表明熱打擊可引起肺水腫及肺組織細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致肺損傷，提示EHS損傷模型建立成功。

細(xì)胞凋亡是多種因素如盲腸結(jié)扎穿孔、脂多糖、缺血缺氧等誘發(fā)ALI的病理生理機制之一。研究證實，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致ALI的途徑之一，凋亡細(xì)胞越多，肺損傷越嚴(yán)重[22-23]。本研究結(jié)果顯示，EHS組大鼠肺組織凋亡細(xì)胞增多，AI升高，提示熱應(yīng)激可促進細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡可能是EHS肺損傷的發(fā)生機制之一。

自噬是存在于所有真核細(xì)胞中的一種高度保守的細(xì)胞生理學(xué)現(xiàn)象，能將體內(nèi)受損的細(xì)胞器及各種錯誤折疊蛋白通過與溶酶體結(jié)合進行自我吞噬或降解，降解過程中產(chǎn)生的氨基酸及其他小分子物質(zhì)可被機體再利用，維持細(xì)胞能量平衡，是機體在饑餓、創(chuàng)傷等多種應(yīng)激條件下作出的適應(yīng)性反應(yīng)[24]。自噬可分為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬3種類型，通常所說的自噬指巨自噬，也是目前研究最多的類型[25]。自噬與ALI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[26-27]。自噬與凋亡是細(xì)胞生命終點的不同表現(xiàn)形式，兩者之間的功能關(guān)系錯綜復(fù)雜。研究表明，自噬能抑制細(xì)胞凋亡及壞死，從而保護細(xì)胞[28]。機體在應(yīng)對多種刺激時，細(xì)胞將首先啟動自噬機制，降解受損細(xì)胞器(如線粒體)，從而防止觸發(fā)凋亡途徑，避免細(xì)胞凋亡或壞死[29]。EHS引起的病理生理變化類似于膿毒癥[30]，EHS導(dǎo)致的肺損傷也與膿毒癥肺損傷極其相似。研究表明，激活自噬能減輕膿毒癥導(dǎo)致的肺組織細(xì)胞凋亡，緩解膿毒癥肺損傷[26,31]，其激活機制可能與PI3K/Akt/mTOR信號通路及PINK1/Parkin信號通路有關(guān)[6]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Baf A1預(yù)處理后，大鼠肺組織細(xì)胞自噬水平下降，凋亡細(xì)胞數(shù)及AI與EHS組比較進一步增高，而RAPA預(yù)處理后，大鼠肺組織細(xì)胞自噬水平升高，凋亡細(xì)胞數(shù)及AI均明顯降低，表明熱打擊能促進細(xì)胞凋亡，降低大鼠肺組織細(xì)胞的自噬水平，從而加重肺損傷；通過上調(diào)自噬可以減輕此損傷。

此外，自噬還參與調(diào)節(jié)機體的炎癥反應(yīng)，并與慢性阻塞性肺疾病、肺炎、膿毒癥等炎癥性疾病相關(guān)[31-32]。研究表明，上調(diào)自噬能減輕機體的炎癥反應(yīng)，自噬可通過抑制炎癥相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及T細(xì)胞分化、清除炎癥介質(zhì)、抑制炎癥反應(yīng)等減輕炎癥損傷[33-34]。

LC3分為Ⅰ型、Ⅱ型，是酵母自噬相關(guān)基因8(autophagy-related gene 8，Atg8)在哺乳動物中的同源基因。未發(fā)生自噬時，可溶性的LC3-Ⅰ型蛋白分布于細(xì)胞表面；當(dāng)自噬發(fā)生時，位于細(xì)胞表面的LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺耦聯(lián)形成LC3-Ⅱ并附著在自噬體膜上，由于LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地定位于自噬體膜上，直到與溶酶體融合，理論上可以通過計算LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值來評價自噬水平的高低。但有研究指出LC3-Ⅱ在自噬流受阻的情況下也可出現(xiàn)高表達[35]，故單純通過LC3-Ⅱ水平來判斷自噬活性是非常武斷的，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值更能反映自噬的真實強度。p62被認(rèn)為是選擇性的自噬受體蛋白，能同時連接待降解的泛素化底物和LC3蛋白。當(dāng)自噬被激活時，p62結(jié)合泛素化底物蛋白分子進入自噬小體，并與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，隨后被溶酶體中的水解酶降解。p62作為自噬降解底物，其表達量與自噬活性成反比，含量越低意味著自噬下游越通暢[36]。本研究通過Western blotting檢測了EHS相關(guān)ALI時自噬標(biāo)志蛋白LC3及p62的表達情況，結(jié)果顯示EHS組大鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯低于正常對照組，而p62表達增高，提示EHS大鼠肺組織中自噬小體形成發(fā)生障礙，自噬水平降低。

Baf A1可通過抑制H+-ATP酶而阻止自噬體與溶酶體之間的融合，從而實現(xiàn)對自噬過程的抑制，是一種自噬抑制劑。RAPA通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路來實現(xiàn)對自噬過程的激活，是一種自噬增強劑。本研究分別使用Baf A1及RAPA預(yù)處理大鼠，結(jié)果顯示，與EHS組比較，Baf A1組大鼠肺組織損傷程度更嚴(yán)重，伴有肺水腫加重、肺血管通透性增加、肺細(xì)胞凋亡數(shù)增多等，病理學(xué)結(jié)果顯示肺組織中有大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺部出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低，p62蛋白表達增加。相反，給予RAPA預(yù)處理后，大鼠肺部炎癥明顯緩解，肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高，p62蛋白表達水平降低，即抑制自噬會加重EHS大鼠肺損傷，上調(diào)自噬水平可能有利于減輕EHS肺損傷，提示EHS導(dǎo)致的肺損傷可能與自噬成熟障礙有關(guān)。

綜上所述，本研究證實EHS能導(dǎo)致肺損傷，肺組織自噬水平降低是EHS導(dǎo)致肺損傷發(fā)生的機制之一，上調(diào)自噬水平可減輕EHS大鼠的肺損傷，但其機制尚不清楚，未來仍需進一步深入研究。