劉興梅，沈燕，班曉霞，何玉，李紅梅，何曉蘭，張華*

1貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴陽(yáng) 550002；2貴州省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴陽(yáng) 550002；3貴州省人民醫(yī)院病理科，貴陽(yáng)550002

據(jù)估計(jì)，全世界糖尿病的患病人數(shù)到2045年將高達(dá)7億[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是致死性最嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥，也是導(dǎo)致腎功能不全的主要原因[2-3]，隨著病情進(jìn)展可發(fā)生腎小管間質(zhì)纖維化。同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog，PTEN)可通過(guò)激活脂質(zhì)磷酸酶使磷脂酰肌醇三磷酸去磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)榱字＜〈级姿岫Щ?，?fù)性調(diào)控PI3K/Akt通路，同時(shí)可激活蛋白磷酸酶活性，負(fù)性調(diào)控黏著斑激酶/P130信號(hào)來(lái)抑制細(xì)胞的存活、增殖，從而延緩腫瘤生長(zhǎng)[4]，涉及血管[5]、心臟[6]、肺[7]和腎臟纖維化[8]等領(lǐng)域。已有研究發(fā)現(xiàn)，PTEN可通過(guò)不同信號(hào)通路影響腎臟纖維化的進(jìn)程[9-13]。自噬為溶酶體降解途徑，可參與細(xì)胞質(zhì)成分降解，以維持細(xì)胞功能和代謝的平衡[14-15]。微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3(LC3)和P62分別是自噬起始和完成的標(biāo)志物，且LC3 Ⅱ與LC3 Ⅰ的比值常用于監(jiān)測(cè)自噬的激活[16]。激活轉(zhuǎn)錄因子4或嘌呤能受體可通過(guò)抑制自噬促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化[17-18]?？梢?jiàn)，PTEN、自噬均在DN的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。然而，PTEN與自噬及腎間質(zhì)纖維化三者間的相互作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在觀察PTEN在高糖環(huán)境下對(duì)大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞的作用，并探討體外干預(yù)PTEN表達(dá)對(duì)自噬及腎間質(zhì)纖維化的影響機(jī)制，以期為DN的臨床治療尋找新的有效靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E)購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。ClarityTMWestern ECL substrate購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，雷帕霉素購(gòu)自美國(guó)MedChem Express公司，鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自中國(guó)普美生物科技公司，兔抗PTEN和兔抗P62單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，兔抗LC3A/B單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，兔抗Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司，過(guò)表達(dá)PTEN質(zhì)粒(CKP04-PTEN)購(gòu)自中國(guó)普美生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞N R K 5 2 E 用含1 0%胎牛血清及D M E M 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。吸掉原培養(yǎng)液，PBS清洗，吸干PBS后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1:4傳代。

1.2.2 Western blotting檢測(cè)PTEN、LC3、P62、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NRK52E細(xì)胞隨機(jī)分為3組：正常糖(NC，5.5 mmol/L葡萄糖)組、高糖(HG，30 mmol/L葡萄糖)組、高滲(MA，5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)組。培養(yǎng)48 h后，吸棄各組細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗3次，吸干后加入細(xì)胞裂解液1 ml (含RIPA裂解液980 μl/ml，PMSF 10 μl/ml，磷酸酶抑制劑10 μl/ml)，充分裂解，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，將蛋白質(zhì)上清轉(zhuǎn)至另一無(wú)菌1.5 ml EP管。BCA法進(jìn)行蛋白樣品定量，根據(jù)測(cè)得的蛋白濃度，加入2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液使各樣品濃度為3 μg/μl，充分混勻，沸水煮開(kāi)10 min，進(jìn)行蛋白樣品變性。然后依次進(jìn)行制膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜，分別加入一抗PTEN(1:1000)、LC3(1:1000)、P62(1:1000)、Ⅰ型膠原蛋白(1:1000)、Ⅲ型膠原蛋白(1:800)和抗β-actin(1:4000)，4 ℃冰箱搖床孵育過(guò)夜，洗膜，然后加入二抗(1:4000)孵育，洗膜，ECL液浸泡顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)自動(dòng)掃描膠片，檢測(cè)PVDF膜上的目的蛋白，ImageJ軟件分析條帶強(qiáng)度。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察自噬流 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NRK52E細(xì)胞隨機(jī)分為3組：正常糖對(duì)照(NG)組、高糖對(duì)照(HG)組和高糖過(guò)表達(dá)PTEN(HG+pPTEN)組，然后各組轉(zhuǎn)染自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒16 h，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，換成含10% FBS的DMEN培養(yǎng)基，在HG+pPTEN組細(xì)胞中使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染PTEN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)每組細(xì)胞加入100 nmol/L的自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素，以提高整體自噬水平，便于觀察各組間自噬的差異，共培養(yǎng)48 h，以復(fù)溫的PBS(37 ℃)清洗2次，每孔加入200 μl 4%多聚甲醛，室溫固定30 min后冷PBS洗3次，DAPI染核，室溫10 min，冷PBS洗2次，留少許PBS，加入蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡觀察自噬變化。采用自噬溶酶體(mRFP)標(biāo)記及追蹤LC3，mRFP呈紅色斑點(diǎn)，紅綠熒光(RFP+GFP)合并后呈黃色斑點(diǎn)即自噬體，通過(guò)不同顏色斑點(diǎn)計(jì)數(shù)可清楚觀察自噬流。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)的變化

細(xì)胞分組同1.2.3。HG組細(xì)胞采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染PTEN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，6 h后去掉細(xì)胞培養(yǎng)基，換成含10% FBS的DMEN培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，以復(fù)溫的PBS(37 ℃)洗2次，每孔加入200 μl 4%多聚甲醛，室溫固定30 min后，用冷0.2%聚乙二醇辛基醚洗3次，3% BSA封閉1 h，冷PBS清洗3次，加入最佳稀釋比例PTEN抗體(1:200)、Ⅰ型膠原蛋白抗體(1:200)和Ⅲ型膠原蛋白抗體(1:200)，4 ℃孵育過(guò)夜，冷PBS清洗，加入二抗(Cy3標(biāo)記羊抗兔，稀釋比例1:150)室溫孵育3 h，冷PBS清洗，DAPI染核，室溫10 min，冷PBS清洗，留少許PBS，加入蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察膠原的染色變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，且通過(guò)方差齊性檢驗(yàn)，均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高糖培養(yǎng)NRK52E細(xì)胞中P TEN的表達(dá)Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組PTEN表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，而MA組PTEN表達(dá)水平無(wú)明顯變化，因而排除了滲透壓對(duì)PTEN表達(dá)的影響(圖1)。

圖1 各組NRK52E細(xì)胞PTEN蛋白的表達(dá)水平(Western blotting，n=3)Fig.1 Protein expression levels of PTEN in NRK52E cells of each group (Western blotting)(n=3)

2.2 高糖培養(yǎng)NRK52E細(xì)胞中LC3、P62、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá) Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組LC3表達(dá)降低(P<0.05)，P 6 2、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，而MA組LC3、P62、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 各組NRK52E細(xì)胞中LC3、P62、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)水平(Western blotting, n=3)Fig.2 Protein expression levels of LC3, P62, collagen-Ⅰ and collagen-Ⅲ in NRK52E cells (Western blotting, n=3)

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察自噬流變化 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組紅色斑點(diǎn)和黃色斑點(diǎn)數(shù)減少，HG+pPTEN組紅色斑點(diǎn)變化不大，黃色斑點(diǎn)數(shù)有所增加。與HG組比較，HG+pPTEN組紅色斑點(diǎn)和黃色斑點(diǎn)數(shù)明顯增加(圖3)。

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTEN后NRK52E細(xì)胞中自噬流變化Fig.3 Changes of autophagic flow in NRK52E cells analyzed by laser confocal microscopy, using pPTEN plasmid over-expressed PTEN

2.4 PTEN對(duì)膠原表達(dá)的影響 細(xì)胞熒光染色結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組PTEN紅色熒光減弱，膠原熒光染色增強(qiáng)，HG+pPTEN組PTEN染色有所恢復(fù)，膠原染色無(wú)明顯變化。與HG組比較，HG+pPTEN組PTEN紅色熒光增強(qiáng)，膠原熒光染色減弱(圖4)。

圖4 NRK52E細(xì)胞PTEN及Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白免疫熒光染色Fig.4 PTEN, collagen-Ⅰ and collagen-Ⅲ protein in NRK52E cells(Immunofluorescence staining)

3 討 論

隨著病程進(jìn)展，DN將發(fā)展為慢性腎臟病，是終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因[19]。DN的特征之一為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白如腎小球和基底膜的系膜和腎小管間質(zhì)中的膠原、層黏蛋白和纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的沉積；ECM表達(dá)增加可使腎小球和腎小管基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[20]。在DN中，腎小管間質(zhì)病變和間質(zhì)纖維化一直備受關(guān)注[21]。高糖、蛋白尿和晚期糖基化終末產(chǎn)物具有固有的腎小管毒性，均可能觸發(fā)間質(zhì)性炎癥并引起纖維化反應(yīng)，從而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，PTEN去磷酸化并激活肌動(dòng)蛋白解聚因子cofilin-1，導(dǎo)致F-肌動(dòng)蛋白形成，促進(jìn)肥胖相關(guān)的腎小球足細(xì)胞損傷引起腎小球病變[23]。通過(guò)抑制TGF-β和Notch信號(hào)通路，進(jìn)而維持PTEN的表達(dá)，可有效減緩UUO模型中的腎臟纖維化[24]。顯而易見(jiàn)，PTEN在腎臟纖維化過(guò)程中扮演著重要角色。本研究觀察到高糖刺激NRK52E細(xì)胞后，膠原的表達(dá)增加并伴隨PTEN的表達(dá)降低。以甘露醇作為高糖的滲透控制劑，結(jié)果顯示MA組PTEN蛋白表達(dá)水平與NG組比較無(wú)變化，排除了高滲的影響，提示PTEN與腎小管間質(zhì)纖維化存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠存在明顯的PTEN蛋白下調(diào)，蛋白尿以及FN、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和Ⅰ型膠原等纖維化因子增加，腎臟間質(zhì)纖維化加重；利用芒果苷治療可預(yù)防腎間質(zhì)纖維化，表現(xiàn)為FN、Ⅰ型膠原和α-SMA陽(yáng)性表達(dá)減少，同時(shí)上調(diào)PTEN，并降低PI3K和Akt的磷酸化，提示芒果苷可能通過(guò)上調(diào)PTEN，并降低PI3K和Akt的磷酸化途徑抑制Ⅰ型膠原、FN和α-SMA的升高，從而減輕DN中的炎癥和氧化應(yīng)激，最終抑制腎間質(zhì)的纖維化[25]。然而，PTEN在糖尿病腎間質(zhì)纖維化病理機(jī)制中如何發(fā)揮作用仍然不完全清楚。

自噬是真核細(xì)胞周期中一個(gè)高度保守的過(guò)程，通過(guò)降解細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和大分子以及降解產(chǎn)物的循環(huán)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和維持細(xì)胞環(huán)境的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用[26]。自噬功能失調(diào)可能參與DN的發(fā)生發(fā)展[27]。腎臟細(xì)胞中基本水平的自噬對(duì)維持腎臟內(nèi)環(huán)境平衡必不可少，但在外界壓力下自噬將發(fā)生改變，一旦自噬失調(diào)，可誘導(dǎo)急性及慢性腎病的發(fā)生。足細(xì)胞自噬、近端腎小管上皮細(xì)胞中線粒體自噬的改變將導(dǎo)致腎功能變化[28]。UUO模型中特異性敲除遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞Atg7基因后，自噬受到明顯抑制，可進(jìn)一步加重細(xì)胞凋亡與腎小管細(xì)胞纖維化[29]。用STZ誘導(dǎo)DN的動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，敲除IL-17A可影響自噬形成過(guò)程，使細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖刺激近端腎小管上皮細(xì)胞后自噬被抑制，腎間質(zhì)纖維化加重，提示在高糖環(huán)境下，PTEN介導(dǎo)的腎臟間質(zhì)纖維化過(guò)程中自噬水平明顯降低。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬在DN的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[31-32]，但目前尚不清楚PTEN、自噬與腎間質(zhì)纖維化間的關(guān)系。Sun等[33]證實(shí)，抑制DN模型中的miR-217可靶向調(diào)控PTEN表達(dá)，進(jìn)一步恢復(fù)足細(xì)胞自噬，從而拮抗足細(xì)胞損傷及胰島素抵抗。Guo等[34]發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素在治療DN時(shí)，可通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR通路增強(qiáng)自噬水平，調(diào)節(jié)miR-155-5p/PTEN表達(dá)，從而緩解腎間質(zhì)纖維化。Chen等[35]在齊墩果酸治療DN的研究中也發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸可通過(guò)抑制miR-142-5p促進(jìn)PTEN表達(dá)和細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制HG誘導(dǎo)的NRK52E細(xì)胞纖維化?？梢?jiàn)，體外通過(guò)藥物靶向提高PTEN和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)是治療DN的關(guān)鍵點(diǎn)。本研究在高糖培養(yǎng)的近端腎小管上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PTEN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，使用RFP-GFP-LC3雙標(biāo)腺相關(guān)病毒感染NRK52E細(xì)胞，并在各處理組加入100 nmol/L的自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素以提高整體自噬水平，便于更好地觀察各組自噬流的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NG組比較，HG組紅色斑點(diǎn)和黃色斑點(diǎn)數(shù)減少，HG+pPTEN組紅色斑點(diǎn)變化不大，黃色斑點(diǎn)數(shù)有所增加，而與HG組比較，HG+pPTEN組紅色斑點(diǎn)和黃色斑點(diǎn)數(shù)明顯增加，提示高糖刺激使自噬受到抑制，而高糖刺激后過(guò)表達(dá)PTEN可恢復(fù)自噬水平。

PTEN是一種腫瘤抑制基因，可負(fù)性調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素(mTOR)途徑[36]。mTOR信號(hào)傳導(dǎo)圖譜表明，mTOR能通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程(包括蛋白質(zhì)合成和自噬)來(lái)控制生物能量積累和代謝，而mTOR蛋白復(fù)合體1可影響自噬激活激酶1和ATG13，抑制細(xì)胞成分的自噬分解[37]。在DN腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中，PTEN可能通過(guò)PI3K/Akt/mTOR通路，靶向調(diào)控自噬的發(fā)生、發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，與NG組比較，HG組PTEN紅色熒光減弱，膠原熒光染色增強(qiáng)，HG+pPTEN組PTEN染色有所恢復(fù)，膠原染色無(wú)明顯變化，與HG組比較，HG+pPTEN組PTEN紅色熒光增強(qiáng)，膠原熒光染色減弱，提示高糖使細(xì)胞PTEN表達(dá)降低、膠原表達(dá)增加，而過(guò)表達(dá)PTEN可使高糖刺激下的自噬抑制被解除，并降低膠原的表達(dá)，因此，高糖培養(yǎng)近端腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染PTEN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，可通過(guò)改變自噬水平緩解DN的纖維化進(jìn)程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，PTEN可通過(guò)恢復(fù)自噬緩解腎臟纖維化。然而，在高糖環(huán)境下過(guò)表達(dá)PTEN的干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們沒(méi)有進(jìn)一步檢測(cè)具體的PTEN蛋白、自噬相關(guān)蛋白、膠原的定量表達(dá)，并探討更深層次的分子機(jī)制，因而存在一定的局限性。PTEN的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，今后需要有更多研究去揭示PTEN在DN中的調(diào)控作用，為PTEN用于DN的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。