夏雄飛 潘俊良 韓長(zhǎng)志

摘要：CRISPR/Cas9是在細(xì)菌、古細(xì)菌基因組中含有的一種成簇有規(guī)律的間隔短回文重復(fù)序列，該結(jié)構(gòu)被其用于抵御外來(lái)微生物基因入侵。通過(guò)對(duì)上述結(jié)構(gòu)進(jìn)行改裝從而形成一種基因編輯方法，與傳統(tǒng)的鋅指核酶和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酶基因編輯方法相比，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)具有更高效的優(yōu)勢(shì)。本文以CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成、作用機(jī)制和運(yùn)用原理為切入點(diǎn)，系統(tǒng)總結(jié)了該技術(shù)在植物病原真菌（稻瘟病菌、橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌、玉米黑粉病菌等）中的致病相關(guān)基因組定點(diǎn)編輯應(yīng)用情況，明確了當(dāng)前在植物病原真菌中應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率整體較低，不同sgRNA設(shè)計(jì)工具、目的等對(duì)編輯效率、靶向特異性的潛在影響，以及宏觀突變檢驗(yàn)方式的偏差問(wèn)題等局限性，并提出了該系統(tǒng)應(yīng)用范圍的擴(kuò)大、編輯效率的提高以及新型編輯方式的挖掘等建議與展望。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9;植物病原真菌;基因編輯;研究綜述

中圖分類(lèi)號(hào)： S432.4+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）12-0022-06

收稿日期：2021-09-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31960314）;云南省“興滇英才支持計(jì)劃”青年人才專項(xiàng)（編號(hào)：YNWR-QNBJ-2020-188）;云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號(hào)：2018FG001-028）。

作者簡(jiǎn)介：夏雄飛（1996—），男，安徽合肥人，碩士研究生，主要從事資源利用與植物保護(hù)研究，E-mail：616385792@qq.com;共同第一作者：潘俊良（1988—），男，上海人，碩士研究生，主要從事資源利用與植物保護(hù)研究，E-mail：panjunliang@sh.chinamobile.com。

通信作者：韓長(zhǎng)志，博士，教授，主要從事經(jīng)濟(jì)林木病害生物防治與真菌分子生物學(xué)研究。E-mail：hanchangzhi2010@163.com。

目前，CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9）基因編輯技術(shù)在實(shí)現(xiàn)對(duì)植物、動(dòng)物以及微生物等特定基因條件性敲除、敲入、替換、修復(fù)等方面具有較為廣泛的應(yīng)用，彌補(bǔ)了鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFNs）和類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）等傳統(tǒng)編輯技術(shù)的劣勢(shì)[1]。該技術(shù)具有設(shè)計(jì)過(guò)程簡(jiǎn)單、同時(shí)多位點(diǎn)編輯等優(yōu)點(diǎn)[2]，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及工業(yè)等領(lǐng)域，目前在構(gòu)建動(dòng)物、細(xì)胞系模型以及癌癥治療[3]、良種育種[4]以及工業(yè)微生物改造[5]等方面已經(jīng)得到了實(shí)踐驗(yàn)證。2020年10月，法國(guó)科學(xué)家?，敿~埃爾·沙爾龐捷和美國(guó)科學(xué)家珍妮弗·杜德納以CRISPR/Cas9技術(shù)開(kāi)發(fā)者身份獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[6-7]。植物病原真菌對(duì)農(nóng)林業(yè)造成重要危害，對(duì)社會(huì)、經(jīng)濟(jì)等各方面產(chǎn)生重大影響。前人對(duì)于病原真菌的基因研究，多采用單基因敲除的方式以挖掘新的致病基因，由于某些真菌發(fā)生同源重組效率較低，缺乏啟動(dòng)子和有效的轉(zhuǎn)化子篩選標(biāo)記以及相對(duì)復(fù)雜的遺傳性，嚴(yán)重影響致病機(jī)制的解析[8]。當(dāng)前學(xué)術(shù)界對(duì)于真菌基因編輯的綜合分析多集中于工業(yè)絲狀真菌以及食藥用大型真菌等，然而尚未見(jiàn)對(duì)該技術(shù)在植物病原真菌中的應(yīng)用進(jìn)行對(duì)比分析，本文以稻瘟菌、橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌、玉米黑粉菌、鏈格孢霉、小球腔菌、鐮刀菌等6種病原真菌為例，對(duì)前人所開(kāi)展的CRISPR技術(shù)相關(guān)應(yīng)用展開(kāi)綜述，并對(duì)其研究思路、方法、內(nèi)容、結(jié)果以及對(duì)后續(xù)相關(guān)研究的影響等展開(kāi)解析，以期為進(jìn)一步開(kāi)展該領(lǐng)域的科學(xué)研究提供重要的理論指導(dǎo)。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)基本原理

CRISPR/Cas9基因序列主要由Cas9、前導(dǎo)序列、間隔序列、前間隔序列臨近基序（PAM）以及重復(fù)序列組成。單鏈向?qū)В╯gRNA）源自于間隔序列的轉(zhuǎn)錄加工，由于sgRNA的部分母DNA來(lái)自外源基因，所以其能夠與目標(biāo)外源基因上源間隔序列特異性互補(bǔ)配對(duì)。sgRNA通過(guò)識(shí)別PAM并引導(dǎo)Cas9復(fù)合體與目標(biāo)基因特異性結(jié)合并剪切[9]?；诖嗽?，人工設(shè)計(jì)出一種可識(shí)別并靶向設(shè)計(jì)者意向基因的sgRNA，同時(shí)將sgRNA和Cas9進(jìn)行定向優(yōu)化，諸如添加核定位序列（NLS）、核酶序列等以提高編輯效率[10-11]，sgRNA將引導(dǎo)Cas9準(zhǔn)確剪切目標(biāo)基因，基因的刪除激發(fā)了細(xì)胞內(nèi)DNA的同源修復(fù)（HDR）或非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)。對(duì)于HDR途徑，能夠較準(zhǔn)確地替換部分目標(biāo)基因，但外源序列要與目標(biāo)序列具有高同源性才能實(shí)行HDR;對(duì)于NHEJ途徑，其雙鏈斷裂的位置則會(huì)發(fā)生隨機(jī)的插入或刪除（圖1）。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物病原真菌中的應(yīng)用

2.1 稻瘟菌

稻瘟菌引起的稻瘟病是水稻種植最主要的威脅，在我國(guó)發(fā)病水稻面積每年高達(dá)380萬(wàn)hm2，產(chǎn)量損失占到總產(chǎn)量的10%～30%[12]。Arazoe等最先對(duì)稻瘟菌建立了CRISPR系統(tǒng)，成功阻斷了小柱孢酮脫水酶基因（SDH）的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)了利用U6啟動(dòng)子編輯效率相比TrpC啟動(dòng)子更高[13]。盡管總體效率偏低，且突變體DNA無(wú)法穩(wěn)定自我復(fù)制[14]，但為該系統(tǒng)在稻瘟菌中的運(yùn)用奠定了基礎(chǔ)。為了解決上述問(wèn)題，F(xiàn)oster等在前人研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)出了應(yīng)對(duì)稻瘟菌的RNP-CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)，結(jié)果顯示靶向ALB1基因的效率均大于50%，產(chǎn)生70%～80%的轉(zhuǎn)化子。此外，他們還開(kāi)發(fā)了一種“共同編輯”策略，即將2個(gè)獨(dú)立的RNP核糖核蛋白（Cas9-NLS-sgRNA）一起轉(zhuǎn)化至稻瘟菌，一部分細(xì)胞會(huì)同時(shí)占據(jù)2個(gè)RNP并被編輯2處，如果其中一個(gè)基因具有易于觀察的表型，即可用作選擇標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子，然后確定第2個(gè)基因是否也被編輯，該方法在最大程度上避免了脫靶，但效率僅有0.5%～2.0%，在后續(xù)研究中可以嘗試通過(guò)轉(zhuǎn)化方式替換或調(diào)整RNP與供體DNA比例進(jìn)行優(yōu)化（表1）[15]。2019年，Yamato等開(kāi)發(fā)了單交叉介導(dǎo)的同源重組編輯策略，即轉(zhuǎn)化載體中包含1個(gè)在CRISPR/Cas9切割位點(diǎn)的單同源臂，高效實(shí)現(xiàn)了稻瘟菌中SDH的替換與GFP基因的敲入，并且利用該策略驗(yàn)證了Spo11基因的功能和表達(dá)[16]。

2.2 橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌

橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌可侵染橡膠樹(shù)苗期、幼樹(shù)直至成熟階段，嚴(yán)重影響膠乳產(chǎn)量[17]。在廣東紅五月農(nóng)場(chǎng)、海南瓊海和瓊山橡膠林等地曾大面積暴發(fā)[18]。郭燕華等對(duì)該菌建立了的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過(guò)ChopChop[19]軟件預(yù)測(cè)靶標(biāo)基因URA5中的sgRNA切割點(diǎn)，再將體外表達(dá)出含Cas9的RNP與sgRNA融合成復(fù)合體轉(zhuǎn)化至該菌中，結(jié)果在HDR與NHEJ條件下均成功獲得了敲除突變株ΔURA5，表現(xiàn)為尿嘧啶缺陷[20]，其中HDR相比NHEJ能夠在基因編輯過(guò)程中實(shí)現(xiàn)雙突變[21]，應(yīng)用場(chǎng)景更廣闊。2019年，Nakamura等首次利用3種CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)炭疽菌的SCD1進(jìn)行了基因替換，首先利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方式，效率高達(dá)97.1%;其次利用Cas9/sgRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)化，效率達(dá)到82.1%;最后同時(shí)利用Cas9和sgRNA表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雜交轉(zhuǎn)化，效率為89.2%，此外還用該方式對(duì)NIS1、Cel5A、g9136、MC96基因進(jìn)行了編輯，除MC96效率僅有50%外，其余均達(dá)到理想效率，并且驗(yàn)證了該雜交轉(zhuǎn)化體系可減少脫靶與DNA損傷反應(yīng)現(xiàn)象[22]。

2.3 玉米黑粉菌

玉米黑粉菌引起谷物黑穗病，在我國(guó)黃淮海周邊、東北地區(qū)發(fā)病現(xiàn)象普遍[23]。Schuster等利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向了該菌中的bE1和bW2基因，在Cas9中添加了2個(gè)NLS和HA標(biāo)簽以組成NLS-Cas9-HA-NLS復(fù)合物，并將其置于具有萎銹靈抗性的質(zhì)粒pMS7中，在不添加DNA供體的情況下將pMS7轉(zhuǎn)化至該菌，通過(guò)菌株的Fuz表型（是否為菌絲體）評(píng)估，結(jié)果獲得的突變株在單個(gè)轉(zhuǎn)化子的子代中高達(dá)70%～100%，2個(gè)目標(biāo)基因的編輯效率差異較大。最后在缺乏萎銹靈的培養(yǎng)基中篩選，具萎銹靈抗性的轉(zhuǎn)化子可以將pMS7丟棄，解決了單個(gè)突變體后代多異質(zhì)的問(wèn)題[24]。2019年，Huck等成功構(gòu)建了靶向稗黑粉菌malA基因（編碼蘋(píng)果酸酶）的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，利用短DNA修復(fù)模板在Cas9剪切靶標(biāo)序列后誘導(dǎo)HDR的基礎(chǔ)上對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行特殊的修飾，該方法為后續(xù)構(gòu)建基于NHEJ且無(wú)標(biāo)記的高效突變體系奠定了基礎(chǔ)[25]。2021年，Wege等基于CRISPR/Cas9技術(shù)并利用高濃縮的短雙鏈寡核苷酸誘導(dǎo)HDR成功靶向了玉米黑粉菌中編碼細(xì)胞分裂所需的don3基因，包括敲除、替換、基因組位點(diǎn)異源互補(bǔ)以及內(nèi)源性熒光蛋白標(biāo)記等試驗(yàn)，彌補(bǔ)了玉米黑粉菌需要長(zhǎng)同源序列才能產(chǎn)生基因缺失的局限性[26]。

2.4 鏈格孢霉

鏈格孢霉可引起果樹(shù)、蔬菜等植物病害[30]。Wenderoth等通過(guò)改造構(gòu)巢曲霉的CRISPR系統(tǒng)，靶向了鏈格孢霉黑色素合成過(guò)程中聚酮化合物合酶基因pksA和1，3，8-THN還原酶基因brm2，在sgRNA兩端分別安裝了不同的核酶，通過(guò)原生質(zhì)體介導(dǎo)的方式將質(zhì)粒導(dǎo)入該菌，結(jié)果有1/10概率表現(xiàn)出缺乏黑色素的表型，為了產(chǎn)生穩(wěn)定突變株，再以單孢子菌落在不同培養(yǎng)基上多次再生純化，從而使得轉(zhuǎn)化質(zhì)粒丟失，體現(xiàn)出了該方式可連續(xù)誘變靶基因以及在無(wú)選擇壓力情況下自我復(fù)制質(zhì)?？蓙G失的優(yōu)勢(shì)，有利于無(wú)性物種進(jìn)行遺傳育種。此外，首次在該菌的基因編輯中引入綠色熒光蛋白（GFP），將GFP的C端添加NLS以保證其特異性，結(jié)果顯示14個(gè)尿嘧啶轉(zhuǎn)化子中有9個(gè)表型發(fā)光，證實(shí)了GFP利用的可行性[27，31]。2019年，他們?cè)俅卫肅RISPR技術(shù)致使該菌中多個(gè)合成基因失活，并在米曲霉中外源表達(dá)來(lái)自鏈格孢霉的聚酮化合物（AOH）及其衍生物單甲醚（AME）基因，鑒定了AOH與AME的合成基因簇pksl，并進(jìn)一步通過(guò)pksl基因簇的缺失突變體毒力降低現(xiàn)象驗(yàn)證了AOH與AME是鏈格孢霉的毒力因子之一[32]。

2.5 小球腔菌

小球腔菌可使十字花科植物患上黑脛病，造成產(chǎn)量、品質(zhì)下降[33]。Idnurm等針對(duì)小球腔菌設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了2次嘗試。第1次成功靶向了hos1基因（編碼組氨酸激酶），先后轉(zhuǎn)化sgRNA、Cas9至該菌，最后利用KpnⅠ限制酶測(cè)序，結(jié)果顯示小球腔菌在hos1基因區(qū)域均有突變，但通過(guò)接種發(fā)現(xiàn)其致病性依然存在。第2次成功靶向了AvrLm1無(wú)毒基因，將一個(gè)HDV核酶綁定于sgRNA，另一個(gè)錘頭狀核酶與sgRNA的折疊區(qū)域被合成為含有101個(gè)核苷酸的寡核苷酸，減小了構(gòu)建體大小以便轉(zhuǎn)化，結(jié)果除了目標(biāo)位點(diǎn)的突變外，其等位基因還發(fā)生額外的堿基對(duì)缺失[28]。2020年，Zou等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)該菌中AvrLm1進(jìn)行突變，在無(wú)抗性選擇標(biāo)記的情況下鑒定其編輯效率在單個(gè)轉(zhuǎn)化子的子代中達(dá)到32%，該基因突變導(dǎo)致H2O2產(chǎn)生不同水平積累，從而對(duì)具有相應(yīng)抗性基因Rlm7的甘藍(lán)型油菜表現(xiàn)出不同毒力效果，進(jìn)一步利用突變株毒性進(jìn)行抗性測(cè)定，將得到的具抗株用以選育或鑒定甘藍(lán)型油菜中新型Rlm7[34]。Darma等首次鑒定出該菌中包含類(lèi)脫落酸合成基因簇pks5，并基于CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行毒性測(cè)定，其中2個(gè)基因與其對(duì)油菜子葉的致病性無(wú)直接關(guān)聯(lián)[35]。

2.6 鐮刀菌

鐮刀菌可引起小麥、玉米、水稻等經(jīng)濟(jì)植物患病，是全球最常見(jiàn)的植物病原真菌之一[36]。Ferrara等基于CRISPR/Cas9工具，對(duì)該菌中FUM1基因進(jìn)行編輯，利用微同源重組的方式，即發(fā)生在目標(biāo)位點(diǎn)相鄰序列的兩側(cè)同源50 bp內(nèi)的HDR，極大地降低了突變鄰近基因的風(fēng)險(xiǎn)并且具有能靶向緊密間隔基因的優(yōu)點(diǎn)，與常規(guī)重組相比，進(jìn)一步增加了靶向精確性，同時(shí)也能降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果獲得了11個(gè)ΔFUM1轉(zhuǎn)化子，并且在表型都沒(méi)有產(chǎn)生明顯變化的前提下，轉(zhuǎn)化子均未檢測(cè)出伏馬菌素。該研究首次使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)刪除了霉菌毒素合成途徑中的pks基因，并證實(shí)該系統(tǒng)可用于靶向其近親物種藤倉(cāng)鐮孢菌等[29]。Wang等針對(duì)尖孢鐮刀菌體于外組裝了包含Cas9、sgRNA的RNP復(fù)合體并轉(zhuǎn)入其原生質(zhì)體，進(jìn)行PEG（細(xì)胞融合劑）介導(dǎo)的基因編輯，成功突變了該菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇中聚酮合酶的BIK1同源基因，雖然效率僅有50%，但證實(shí)了該基因參與紅色素比卡菌素的合成[37]。2019年，該團(tuán)隊(duì)基于獨(dú)立的同源靶向整合（HITI）和非獨(dú)立的同源重組整合（HDRI）開(kāi)發(fā)了由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的內(nèi)源性基因標(biāo)記系統(tǒng)（EGT），分別通過(guò)這2種方式標(biāo)記了尖孢鐮刀菌FoCHS5、FoSSO1基因的C′端以及FoSSO2的N′端，并利用該標(biāo)記系統(tǒng)判斷這3類(lèi)基因在該菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)位置及強(qiáng)弱，以此促進(jìn)調(diào)控因子或毒力因子的研究[38]。

3 存在的問(wèn)題

3.1 基因編輯效率低是影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)一步推廣的重要原因

隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在植物病原真菌中應(yīng)用的進(jìn)一步探究，其局限性也逐步展現(xiàn)出來(lái)。首先便是編輯效率普遍不高，目前主要是利用該方式探索靶標(biāo)基因的功能，從而挖掘其分子層面的致病機(jī)理。效率低下表現(xiàn)為突變個(gè)體較少，并且在遺傳至下一代時(shí)會(huì)出現(xiàn)基因逐漸復(fù)原的現(xiàn)象，這使得無(wú)法短時(shí)間內(nèi)將有益基因廣泛傳播。雖然可以嘗試改善試驗(yàn)方案來(lái)緩解，但是也產(chǎn)生了未知因素，譬如上述應(yīng)用于稻瘟菌的共同編輯策略雖然減少了脫靶，卻也導(dǎo)致突變降低[15]。效率低下還表現(xiàn)為易產(chǎn)生意外突變，這使得編輯的不穩(wěn)定性大大增加，譬如上述應(yīng)用于膠孢炭疽菌和小球腔菌時(shí)多余的序列插入帶來(lái)的兩面性[20，28]，額外突變產(chǎn)生的未知影響還有待考證，其次是否也可以利用該影響設(shè)計(jì)出定向的雙突變還不得知。效率低下還可以表現(xiàn)為脫靶率較高，即sgRNA對(duì)目標(biāo)基因特異識(shí)別能力較弱，譬如上述應(yīng)用于玉米黑粉菌時(shí)由于使用混合的破壁酶制備原生質(zhì)體增加了脫靶[24]。在這些因素有效解決之前很難將該基因編輯方式的應(yīng)用進(jìn)一步擴(kuò)大。

3.2 SgRNA設(shè)計(jì)工具是影響結(jié)果準(zhǔn)確性的原因

SgRNA是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的核心構(gòu)件，它設(shè)計(jì)的質(zhì)量將直接影響編輯效率和靶向特異性。由表1可以看出，sgRNA設(shè)計(jì)工具不盡相同，由于不同工具所基于的數(shù)據(jù)和算法不同，甚至設(shè)計(jì)的側(cè)重點(diǎn)不同，譬如激活、敲除等，這些因素都會(huì)影響sgRNA相對(duì)質(zhì)量。當(dāng)前sgRNA設(shè)計(jì)工具的權(quán)威性也沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，較好的諸如GPP Web Portal[39]、CHOPCHOP[19]、E-CRISP[40]等軟件。雖然這些工具都具有相對(duì)不錯(cuò)的反響，但是歸根結(jié)底都是計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)的結(jié)果，難免會(huì)出現(xiàn)與實(shí)際相違背的情況。目前sgRNA設(shè)計(jì)工具更多的作用是簡(jiǎn)化了試驗(yàn)程序，對(duì)結(jié)果的影響還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 突變檢驗(yàn)方式是影響結(jié)果準(zhǔn)確性的原因

突變檢驗(yàn)是對(duì)編輯結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證的必要環(huán)節(jié)，通過(guò)表1可以看出，不同病原真菌的檢驗(yàn)方式不盡相同。宏觀上可利用表型變化、抗性變化等進(jìn)行篩選，進(jìn)而將不符合預(yù)期表型或抗性的個(gè)體作為非突變體剔除。由于基因在被編輯的過(guò)程中穩(wěn)定性無(wú)法料知，一方面可能發(fā)生sgRNA特異性偏失進(jìn)而造成非目標(biāo)位點(diǎn)意外突變或者細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中由于某些因素造成目標(biāo)突變基因未能正常表達(dá)等;另一方面在已確認(rèn)為正確突變的個(gè)體中可能存在由基因漂移導(dǎo)致的突變，即非基因編輯直接導(dǎo)致的變化等，這些因素都會(huì)造成宏觀檢驗(yàn)上對(duì)編輯效率認(rèn)知的偏差。相比之下，分子水平上的檢驗(yàn)更為嚴(yán)謹(jǐn)，即對(duì)基因測(cè)序驗(yàn)證其結(jié)果。盡管該方式較繁瑣，或許可以利用統(tǒng)計(jì)學(xué)知識(shí)隨機(jī)取樣進(jìn)而估算出效率。

4 展望

4.1 進(jìn)一步擴(kuò)大探索CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于植物病原真菌的范圍是未來(lái)研究的重點(diǎn)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)目前雖然已經(jīng)取得了很多研究成果，但其在應(yīng)用中的用途仍處于初期。當(dāng)前相關(guān)報(bào)道多數(shù)只是為了對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)嘗試能否實(shí)現(xiàn)單一突變，對(duì)病原真菌應(yīng)用的范圍仍有很大的提升空間，諸如細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的激活與抑制、基因組成像等。此外，目前將該系統(tǒng)應(yīng)用于病原真菌的種類(lèi)較少，多數(shù)相關(guān)報(bào)道局限于稻瘟病菌、玉米黑粉菌、鐮刀菌等。在十大植物病原真菌中，灰葡萄菌、小麥條形柄銹菌等目前被CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用的相關(guān)研究報(bào)道較少，未來(lái)還有很大的發(fā)展空間[41-42]。

4.2 進(jìn)一步提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率是未來(lái)研究的熱點(diǎn)

基因編輯效率不高一直是相關(guān)研究的壁壘。目前主要通過(guò)改善試驗(yàn)細(xì)節(jié)來(lái)解決，譬如上述稻瘟菌的共同編輯策略[15]、炭疽菌的雜交轉(zhuǎn)化體系[22]、鐮刀菌的體外組裝RNP直接轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體方式都表現(xiàn)出了相對(duì)較優(yōu)異的抗脫靶性，應(yīng)用于鐮刀菌的微同源重組編輯方式同時(shí)表現(xiàn)出了高效率與抗脫靶性2個(gè)優(yōu)點(diǎn)[29];此外，Matsuura等研究發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，Cas9和sgRNA的濃度與編輯效率成正比[43];也有研究顯示在非靶序列的種子區(qū)域最好要安排不低于3個(gè)連續(xù)錯(cuò)誤配對(duì)組成[44];以sgRNA設(shè)計(jì)邏輯為核心更改其細(xì)節(jié)，例如嵌合sgRNA法，可以進(jìn)一步降低脫靶[45]。盡管這些方案能否廣泛運(yùn)用還有待驗(yàn)證，但都為提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率奠定了基礎(chǔ)。

4.3 進(jìn)一步探索適合真菌特性的新型基因編輯技術(shù)是未來(lái)研究的難點(diǎn)

整體上看，當(dāng)前主要能夠改善基因編輯的方法集中在sgRNA的特異性、啟動(dòng)子的合理選擇、Cas9的修飾以及轉(zhuǎn)化方式的改良等。如何使得該技術(shù)能夠順利對(duì)目標(biāo)基因高效修改并盡可能降低不良影響是目前需要完善和突破的地方。隨著對(duì)植物病原真菌致病基因探究的進(jìn)展，更多潛在的編輯方式會(huì)被發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化，將為植物病原真菌致病功能基因挖掘、定向遺傳育種、RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及對(duì)特定基因組實(shí)施表觀遺傳學(xué)修飾等方面提供重要研究意義。

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