吳文濤，滕 云，田 苗，黃冰鑫，李慧麗，譚劍鋒，李曉紅，周成斌

復(fù)雜先天性心臟病是我國新生兒和嬰幼兒死亡的主要原因之一。一些復(fù)雜先天性心臟病是由相對簡單的原發(fā)病變發(fā)展而來，若能在胎兒期進行手術(shù)干預(yù)，則可阻止其向復(fù)雜畸形轉(zhuǎn)變，心臟也能在宮內(nèi)得到再次發(fā)育的機會。實施胎兒心臟手術(shù)需要安全可靠的體外循環(huán)（extracorporeal circulation，ECC）技術(shù)，既往動物研究也已證實胎兒ECC的可行性［1-3］。然而，胎兒ECC術(shù)后胎盤功能障礙［2］和心功能不全［3］仍是實驗性胎兒心臟手術(shù)的致命缺陷。近年來，隨著組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，代謝組學(xué)已被用于研究ECC術(shù)后缺血再灌注損傷［4］、急性腎損傷［5］和腦缺血保護［6］。本研究構(gòu)建胎羊ECC模型，并對轉(zhuǎn)流后胎羊的心臟和胎盤組織進行基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）的非靶代謝組學(xué)測序，目標(biāo)是闡明胎羊ECC后心臟和胎盤的代謝特征，并討論這些代謝改變是否與胎羊ECC術(shù)后器官功能不全有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動物實驗動物由山東鄆城縣大鵬農(nóng)牧科技有限公司提供。實驗動物倫理由廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：No.GDREC2019516A），動物實驗過程遵守廣東省人民醫(yī)院動物實驗室各項規(guī)章制度。10只懷孕的小尾寒羊（孕90～120 d，總孕期148 d）隨機分為對照組（n=5）和轉(zhuǎn)流組（n=5）。轉(zhuǎn)流組開胸建立ECC，轉(zhuǎn)流1 h；對照組僅行胸骨切開，不進行ECC，觀察1 h。

1.2 動物手術(shù)孕羊肌肉注射速眠新0.1 mg/kg行基礎(chǔ)麻醉，靜脈泵注丙泊酚4～6 mg/（kg·h）維持全身麻醉。然后進行氣管插管和呼吸機輔助通氣，孕羊動脈氧飽和度維持100%，動脈二氧化碳分壓35 mmHg。監(jiān)測孕羊血壓和心率。

超聲探查胎羊數(shù)量及方位，中線剖腹手術(shù)暴露子宮。觸診判斷胎羊頭部和胸部相對位置，在胸骨附近切開孕羊子宮，暴露胎羊一側(cè)上肢，行腋動脈穿刺置管，監(jiān)測動脈血壓和心率。胎羊行正中胸骨切開術(shù)，打開心包暴露心臟。插管前靜脈注射肝素鈉3～5 mg（根據(jù)胎羊大小估計）。以7-0 Prolene（愛惜康）在主肺動脈縫制荷包，插入動脈插管（美敦力6 Fr動脈插管），右心耳以7-0 prolene線縫制帶心包扣的荷包，而后插入靜脈插管（美敦力12 Fr直頭引流管）。ECC采用離心泵（Revolution 5；索林）作為動力系統(tǒng)，人工膜肺（HIITE 800LT；米道斯）和胎盤共同作為氧合器，預(yù)充液由150 ml羊血、50 ml乳酸林格液和10 mg肝素組成。轉(zhuǎn)流過程中維持胎羊ECC流量在150 ml/（kg·min）以上，轉(zhuǎn)流時間為1 h。

1.3 超聲評估和血液檢測在轉(zhuǎn)流開始前（T0）、轉(zhuǎn)流30 min（T1）和轉(zhuǎn)流結(jié)束時（T2）對胎羊進行超聲心動圖檢查。記錄超聲心動圖參數(shù)，包括左室（left ventricle，LV）-等容收縮時間（isovolemic contraction time，IVCT）、LV-等容舒張時間（isovolemic relaxation time，IVRT）、右室（right ventricle，RV）-IVCT、RV-IVRT、主動脈瓣內(nèi)徑（aortic valve diameter，AVD）、左室流出道（LV outflow tract，LVOT）-速度時間積分（velocity time integral，VTI）、肺動脈瓣內(nèi)徑（pulmonary valve diameter，PVD）、RVOT-VTI、臍動脈搏動指數(shù)（Umbilical artery pulsatility index，Ua-PI）、臍動脈阻力指數(shù)（Ua resistance index，Ua-RI）。采用公式［Tei指數(shù)=（IVCT-IVRT）/IVRT］計算左、右心室Tei指數(shù)。左室每搏輸出量（stroke volume-LV，SV-LV）由公式［SV-LV=LVOT-VTI×π×（AVD/2）2］得出，SV-RV由公式［SV-RV=RVOTVTI×π×（PVD/2）2］得出。

于T0、T1、T2采集靜脈血，進行心肌酶檢測，包括肌紅蛋白（myoglobin，Myo）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CKMB）等；血氣分析，包括pH、氧分壓、二氧化碳分壓、乳酸等。心肌酶檢測使用m16磁敏免疫分析儀（深圳理邦）進行，血氣分析使用i15血氣生化分析儀（深圳理邦）進行。

1.4 組織收集轉(zhuǎn)流結(jié)束后，對胎羊?qū)嵤┌矘匪溃杆倭羧√パ蛐呐K和胎盤的組織標(biāo)本，液氮速凍后儲存在-80℃冰箱直至代謝物提取。實驗結(jié)束后，將母羊復(fù)蘇并送回農(nóng)場。

1.5 代謝物提取和UHPLC-MS/MS分析對凍存的組織樣本進行代謝物提取和UHPLC-MS/MS分析，具體操作流程按文獻中描述的方法進行［7-8］。

1.6 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理與分析UHPLC-MS/MS生成的原始數(shù)據(jù)文件使用Compound Discoverer 3.1（CD3.1，賽默飛）進行峰對齊、峰提取和代謝物定量。之后，將峰強度歸一化為總光譜強度，用歸一化后的數(shù)據(jù)進行分子式預(yù)測。然后用mzCloud（https://www.mzcloud.org/）、mzVault和MassList數(shù)據(jù)庫對峰進行匹配，得到定性和相對定量結(jié)果。使用統(tǒng)計軟件R（R version R-3.4.3）、Python（Python 2.7.6 version）和CentOS（CentOS release 6.6）進行統(tǒng)計分析，當(dāng)數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布時，使用面積歸一化方法進行正態(tài)轉(zhuǎn)換。使用京都基因與基因組百科全書（KEGG數(shù) 據(jù) 庫）（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）、人類代謝（HMDB）數(shù)據(jù)庫（https://hmdb.ca/metabolite）和脂質(zhì)圖結(jié)構(gòu)（LMSD）數(shù)據(jù)庫（http://www.lipidmaps.org/）對鑒定到的代謝物進行注釋。多元統(tǒng)計分析部分，使用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件metaX將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA），進而得每個代謝物的變量投影重要度（Variable importantce in projection，VIP）值。單變量分析部分，基于t檢驗來計算各代謝物在兩組間統(tǒng)計學(xué)顯著性（P值），并計算代謝物在兩組間的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）值?；鹕綀D用R包ggplot2繪制。差異代謝物篩選的默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)為VIP＞1，P值＜0.05且FC≥1.5或FC≤0.667。篩選完成后，采用MBRole 2.0（http://csbg.cnb.csic.es/mbrole2/）［9］對鑒定到的差異代謝物進行富集分析，以尋求顯著變化的代謝通路，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析所有分析均采用IBM SPSS Statistics 26.0進行，正態(tài)分布資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，非正態(tài)資料用中位數(shù)和四分位數(shù)描述。組間比較采用重復(fù)測量方差分析，組內(nèi)不同時間點的比較采用配對t檢驗，非正態(tài)分布資料的比較采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 動物實驗結(jié)果轉(zhuǎn)流組和對照組的胎羊體重?zé)o明顯差異［（2.10±0.59）kg vs.（1.49±0.86）kg，P=0.232］，胎齡無明顯差異［（97.00±9.75）d vs.（98.00±13.04）d，P=0.894］。與對照組相比，轉(zhuǎn)流組左右心室的Tei指數(shù)明顯增加（P＜0.05），并且轉(zhuǎn)流結(jié)束時Tei指數(shù)明顯高于轉(zhuǎn)流前（P＜0.05），提示胎羊心功能受損。轉(zhuǎn)流組SV-RV在轉(zhuǎn)流過程中逐漸下降，與對照組有顯著差異（P=0.004）。轉(zhuǎn)流組心率逐漸減慢，與對照組差別明顯（P=0.005），轉(zhuǎn)流30 min的心率明顯慢于轉(zhuǎn)流前（P=0.027）。轉(zhuǎn)流組在T1和T2的pH值明顯高于T0（P＜0.05），與對照組無明顯差異（表1）。對照組在T2的PCO2顯著高于T0（P=0.013），轉(zhuǎn)流組在T1和T2的PCO2顯著低于T0，兩組的PCO2變化有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.0004）（表1）。轉(zhuǎn)流組乳酸值在轉(zhuǎn)流過程中明顯增加，與對照組比較有顯著差異（P=0.004）。轉(zhuǎn)流組的Ua-PI、Ua-RI和心肌酶無明顯改變，與對照組比較無明顯差異（表2）。

表1 胎羊血流動力學(xué)參數(shù)和轉(zhuǎn)流中的血氣值變化（n=5，±s）

表1 胎羊血流動力學(xué)參數(shù)和轉(zhuǎn)流中的血氣值變化（n=5，±s）

注：Ua-PI：臍動脈壓力指數(shù)；Ua-RI：臍動脈阻力指數(shù)；PO2：氧分壓；PCO2：二氧化碳分壓；Lac：乳酸；*P＜0.05與同組T0相比

對照組轉(zhuǎn)流組項目P值T0 T1 T2 T0 T1 T2左室Tei指數(shù) 0.37±0.09 0.45±0.19 0.52±0.12 0.35±0.06 0.83±0.46 1.68±0.54* 0.049右室Tei指數(shù) 0.32±0.02 0.39±0.06 0.43±0.07 0.56±0.13 0.84±0.37 1.41±0.17* 0.003左室每搏量（ml/min） 2.49±0.65 2.38±0.40 2.44±0.38 2.68±0.57 1.91±0.79 1.34±0.72* 0.344右室每搏量（ml/min） 3.03±0.23 2.93±0.19 2.97±0.40 2.53±0.44 1.64±0.22 0.99±0.47 0.004 Ua-PI 1.35±0.46 1.32±0.38 1.36±0.43 1.07±0.39 1.23±0.22 1.25±0.31 0.598 Ua-RI 0.77±0.18 0.75±0.24 0.79±0.23 0.65±0.14 0.70±0.11 0.72±0.11 0.575心率（次/min） 148.67±15.28 133.67±14.84 134.67±10.02 138.50±21.33 88.00±11.17* 74.25±30.50 0.005 pH 7.24±0.06 7.32±0.10 7.27±0.09 7.20±0.06 7.34±0.07* 7.32±0.06* 0.796 PO2（mmHg） 23.00±3.61 25.33±1.15 20.33±1.15 20.00±2.55 24.60±8.44 32.60±16.16 0.576 PCO2（mmHg） 67.43±3.06 75.50±15.00 86.73±6.92* 75.38±12.95 36.60±10.74* 28.88±10.05* 0.0004 Lac（mmol/L） 1.98±0.61 1.56±0.80 1.89±0.59 2.19±0.76 6.53±1.72* 7.58±3.10* 0.004

表2 胎羊血液心肌酶的變化（n=5，±s）

表2 胎羊血液心肌酶的變化（n=5，±s）

注：Myo：肌紅蛋白；CKMB：肌酸激酶同工酶

對照組轉(zhuǎn)流組項目P值T0 T1 T2 T0 T1 T2 Myo（μg/L） ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 -CKMB（μg/L） ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 -

2.2 代謝組學(xué)結(jié)果

2.2.1 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)穩(wěn)定性 為確保色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)在實驗過程中的穩(wěn)定性和實驗數(shù)據(jù)的可靠性，在檢測目標(biāo)樣本的同時，隨機注入三個質(zhì)控（quality control，QC）樣本（QC樣本由目標(biāo)樣本混合而來）。QC樣本各色譜峰的響應(yīng)強度和保留時間基本相同，說明色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)在整個實驗過程中穩(wěn)定性良好。然后，利用峰面積計算三個QC樣本之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示（圖1），各QC樣本間相關(guān)系數(shù)均大于0.99，說明各QC樣本高度相關(guān)，代謝組結(jié)果穩(wěn)定且可重復(fù)。

圖1 QC樣本間的Pearson相關(guān)系數(shù)

2.2.2 多元統(tǒng)計分析 多元統(tǒng)計分析采用PCA和PLS-DA。轉(zhuǎn)流組和對照組的心臟代謝譜基本分離，其95%置信區(qū)間僅部分重疊，提示ECC對胎羊的心臟代謝有顯著影響（圖2A）。轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝存在明顯重疊，提示ECC對胎盤代謝的影響較?。▓D2B）。此外，QC樣品集中在目標(biāo)樣品的中間區(qū)域，說明QC樣品具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。 PLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法，可以進一步區(qū)分組間的代謝差異，但存在一定的過擬合風(fēng)險，需要進行排序驗證。轉(zhuǎn)流組和對照組的心臟代謝譜在PLS-DA得分圖中明顯分離（圖3A），模型的評價參數(shù)R2Y和Q2Y均明顯大于0.5，提示模型有良好的穩(wěn)定性和較高的可預(yù)測性，轉(zhuǎn)流組和對照組的心臟代謝有明顯差異，在排序檢驗圖中，R2＞0＞Q2，提示該模型未過擬合。轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝譜在PLS-DA得分圖中同樣明顯分離，但其評價參數(shù)Q2Y均明顯＜0.5，在正極性模式下Q2Y甚至＜0（圖3B），提示模型的可預(yù)測性和穩(wěn)定性較差，且存在一定的過擬合，轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝用PLS-DA也不能明顯區(qū)分，差異較小。

圖2 心臟和胎盤在兩種極性模式下的主成分分析圖

圖3 心臟和胎盤在兩種極性模式下的偏最小二乘法判別分析圖和排序驗證圖

2.2.3 差異代謝物分析 結(jié)合單變量分析和多元統(tǒng)計分析結(jié)果，以VIP＞1，P＜0.05，且FC≥1.5或FC≤0.667作為閾值，進行差異代謝物篩選。轉(zhuǎn)流組心臟相對于對照組，共鑒定出225種差異代謝物，其中負(fù)極性模式下123種（47種上調(diào)，76種下調(diào)），正極性模式下102種（47種上調(diào)，55種下調(diào)）。轉(zhuǎn)流組胎盤相對于對照組，共鑒定出122種差異代謝物，其中負(fù)極性模式下66種（14種上調(diào)，52種下調(diào)），正極性模式下56種（32種上調(diào)，2種下調(diào)）（圖4）。

圖4 心臟和胎盤在兩種極性模式下的火山圖

2.2.4 差異代謝通路分析 利用MBroles 2.0對差異代謝物進行富集分析，顯示富集到的差異代謝通路有：糖代謝（三羧酸循環(huán)，磷酸戊糖途徑）、脂肪酸代謝（丁酸代謝、不飽和脂肪酸代謝）和氨基酸代謝（丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝，組氨酸代謝，賴氨酸代謝）是ECC胎羊心臟的主要差異代謝途徑（圖5）。轉(zhuǎn)流組心臟組織中，神經(jīng)酸、二十二碳三烯酸、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等脂肪酸含量減少，?；鈮A增加，產(chǎn)物乙酰輔酶A增加，這表明脂肪酸利用明顯增加。生糖氨基酸（甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸等）的含量減少，糖代謝的能量底物（果糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖等）含量增加，三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物（琥珀酸、α-酮戊二酸、烏頭酸等）增加，表明能量代謝增加，糖異生增多。磷酸戊糖途徑中間產(chǎn)物（5-磷酸木酮糖、6-磷酸葡萄糖酸等）減少，合成代謝受阻。

轉(zhuǎn)流組胎盤的差異代謝通路主要包括不飽和脂肪酸代謝、花生四烯酸（arachidonate，ARA）代謝、谷胱甘肽代謝等（圖5B）。能量代謝方面，胎盤同樣表現(xiàn)為糖代謝底物（6-磷酸葡萄糖、1-磷酸葡萄糖）的增加以及多種生糖氨基酸和不飽和脂肪酸的減少，說明胎盤能量需求增加，募集的葡萄糖增多。ARA代謝和谷胱甘肽代謝則分別與炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)。

圖5 心臟和胎盤的通路富集氣泡圖

3 討 論

3.1 心功能和胎盤功能本研究選用孕90～120 d的羊構(gòu)建胎羊ECC模型，平均孕97.5 d，相當(dāng)于人孕25周，能夠較好地模擬人胎兒ECC手術(shù)的真實情況。既往動物研究表明，胎兒ECC可導(dǎo)致心功能不全［3］。在本研究中，發(fā)現(xiàn)胎羊ECC導(dǎo)致左右心室的Tei指數(shù)明顯增加，SV和心率顯著下降。Tei指數(shù)是心室等容時間（包括IVCT和IVRT）與射血時間的比值，在胎兒心功能檢測方面不受心室?guī)缀涡螒B(tài)、心率和胎齡的影響，具有良好的可靠性和重復(fù)性［10］。心功能低下時Tei指數(shù)顯著增高。胎兒心肌收縮成分少，心肌舒張依賴細(xì)胞膜上的鈉鈣交換，因而胎兒心肌收縮和舒張功能比成熟心肌低下。胎兒心肌細(xì)胞處于最長肌節(jié)狀態(tài)，根據(jù)Frank-Starling定律，增加心臟容量，胎兒心臟每搏量的增加非常有限。因此，胎兒通過增加心率和雙心室做功來保持高循環(huán)動力狀態(tài)。在本研究中，轉(zhuǎn)流組胎羊的心率和SV均明顯下降，心輸出量顯著減少。Myo和CKMB是心肌損傷的標(biāo)志物之一，Myo通常在心肌損傷后1～4 h內(nèi)升高，在6～9 h達(dá)到峰值，CKMB在心肌損傷3～8 h開始升高，在12～24 h達(dá)到峰值。由于本研究觀察時間僅1 h，因此未觀察到Myo和CKMB的顯著變化。

胎盤功能障礙是胎兒ECC最常見的術(shù)后并發(fā)癥，具體表現(xiàn)為胎盤血管阻力升高、高碳酸血癥和不可逆酸中毒。在本研究中，Ua-PI和Ua-RI無明顯改變，并且PCO2逐漸降低，pH明顯改善。這可能是因為人工膜肺和胎盤共同作為氧合器，在轉(zhuǎn)流過程中提高了氣體交換能力，減輕了胎盤負(fù)荷。此外，胎羊ECC導(dǎo)致的胎盤功能惡化通常發(fā)生在術(shù)后數(shù)小時，本研究為獲取組織標(biāo)本，觀察時間較短，所以胎盤功能未見明顯惡化，但顯示血乳酸值在轉(zhuǎn)流過程中顯著增加，這表明胎兒的內(nèi)環(huán)境紊亂正在發(fā)生。

3.2 心臟代謝與心功能心臟是一種“雜食性”器官，具有很強的底物利用和環(huán)境適應(yīng)能力。在胎兒出生前，心臟以乳酸和葡萄糖作為主要的能量底物，在胎兒出生后，則迅速轉(zhuǎn)化為以脂肪酸代謝為主。這種代謝模式的轉(zhuǎn)變主要是由于出生前胎兒宮內(nèi)環(huán)境的相對缺氧和出生后新生兒能量需求的迅速增加［11］。在本研究觀察到轉(zhuǎn)流組胎羊的心臟發(fā)生了類似出生后的代謝模式轉(zhuǎn)換：多種脂肪酸含量減少，脂代謝明顯增加，三羧酸循環(huán)增強。這可能是因為ECC作為一種應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)流組胎羊的能量需求增加，脂代謝激活。與糖酵解相比，脂代謝表現(xiàn)出更高的ATP產(chǎn)量，但生產(chǎn)1分子ATP所消耗的氧氣更多，這意味著轉(zhuǎn)流組胎羊心肌氧耗增加，負(fù)擔(dān)加重。此外，胎兒心肌細(xì)胞的線粒體處于未成熟狀態(tài)［11］，對氧化損傷的防御機制尚未完善，脂肪酸氧化增加會導(dǎo)致活性氧生成增多，線粒體損傷加重。因此，對于胎兒而言，這種能量代謝模式的轉(zhuǎn)變可能是胎羊ECC術(shù)后心功能不全的機制之一。

增加的脂代謝不僅會導(dǎo)致能量代謝紊亂，還會導(dǎo)致生長發(fā)育受阻。變化的脂質(zhì)代謝物多為長鏈多不飽和脂肪酸（long chain polyunsaturated fatty acid，LCPUFA），包括：DHA、二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，DPA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等。Kajimoto等［12］用新生仔豬模型研究體外膜氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）對未成熟心臟代謝的影響，發(fā)現(xiàn)ECMO促進未成熟心臟的長鏈脂肪酸氧化。在本研究中也觀察到胎羊ECC促進LCPUFAs的氧化。多不飽和脂肪酸對于胎兒的生長發(fā)育是必不可少的。它們不僅是細(xì)胞膜的關(guān)鍵組成部分，還是一些代謝物的前體，對炎癥和神經(jīng)元生長有重要作用［13-14］。DHA和ARA缺乏會影響神經(jīng)元干細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致胎兒和新生兒神經(jīng)元細(xì)胞的遷移延遲，增加神經(jīng)發(fā)育障礙的風(fēng)險［15］。EPA、DHA和ARA還可被代謝為類二十烷酸或類二十二烷酸（統(tǒng)稱為氧脂素），對維持自穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［16］。本研究中，胎羊ECC導(dǎo)致多不飽和脂肪酸的下降，不僅會降低胎羊維持氧化還原平衡和炎癥穩(wěn)態(tài)的能力，還有可能對胎羊的神經(jīng)發(fā)育造成不良影響。

氨基酸在胎兒體內(nèi)的主要功能是為生長發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)以及參與氧化反應(yīng)，當(dāng)營養(yǎng)缺乏和營養(yǎng)不良時，胎兒體內(nèi)的氨基酸代謝就會相應(yīng)增強。轉(zhuǎn)流組心臟存在氨基酸代謝的顯著改變，主要表現(xiàn)為生糖氨基酸的含量下降，包括天冬氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺等。轉(zhuǎn)流組胎羊能量需求明顯增加，并能較早利用氨基酸進行糖異生，但這種消耗是以合成代謝下降為代價的，長時間應(yīng)激可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解增加和嚴(yán)重的負(fù)氮平衡，對胎羊的生長發(fā)育造成嚴(yán)重不良影響。

3.3 胎盤代謝與胎盤功能既往動物研究表明，胎兒ECC會導(dǎo)致胎盤功能障礙，可能的機制包括：炎性介質(zhì)沉積、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、一氧化氮（nitric oxide，NO）含量下降、氧化應(yīng)激等［2-3，17］。本研究采用人工膜肺和胎盤共同作為氧合器，一定程度上減輕了胎盤負(fù)荷，并且停機后的觀察時間較短，因此未觀察到胎盤功能的明顯下降。同樣，在代謝層面，轉(zhuǎn)流組胎羊的代謝改變不明顯。雖然未能將轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝完全區(qū)分，但轉(zhuǎn)流組胎盤的一些代謝變化可能預(yù)示了即將到來的胎盤損傷。

NO是以精氨酸為底物，以還原型輔酶Ⅱ作為電子供體，由一氧化氮合酶催化生成。精氨酸減少是胎盤功能不良的標(biāo)志［18］。轉(zhuǎn)流組胎盤的精氨酸（P=0.034）和同型精氨酸（P=0.033）明顯減少，NO合成的底物不足，這可能是轉(zhuǎn)流術(shù)后胎盤內(nèi)皮細(xì)胞NO合成障礙的新機制。與心臟相同，轉(zhuǎn)流組胎盤同樣存在脂肪酸氧化的增加，氧負(fù)擔(dān)加重。本研究采用人工膜肺和胎盤共同作為氧合器，在轉(zhuǎn)流期間對胎盤的氣體交換有一定輔助作用，但轉(zhuǎn)流結(jié)束后胎盤將面臨更重的氣體交換負(fù)擔(dān)，這可能是ECC術(shù)后胎盤功能惡化的原因之一。此外，脂肪酸氧化增加還會導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷加重。作為主要的營養(yǎng)運輸通道和調(diào)節(jié)器官，胎盤具有較強的對抗氧化應(yīng)激損傷的能力。棕櫚酸抗壞血酸酯、甜菜堿、還原性谷胱甘肽等具有抗氧化防御能力的代謝物在轉(zhuǎn)流組胎羊的胎盤中均明顯增加［19］，表明轉(zhuǎn)流組胎盤雖然面臨著氧化應(yīng)激損傷，但仍在代償范圍內(nèi)。隨著觀察時間的延長，這種氧化與抗氧化的平衡可能會被打破，嚴(yán)重的氧化應(yīng)激可能會進一步損傷胎盤功能。

3.4 不足與展望本研究也存在一些不足。首先，本研究以胎羊為模型探討胎兒ECC對器官組織代謝的影響，其結(jié)果不完全適用于人類胎兒。其次，本研究的動物數(shù)量較少，觀察時間較短，并且非靶向代謝組學(xué)只能進行相對定量，結(jié)果可能存在一定誤差。應(yīng)進一步擴大樣本量，延長觀察時間，并采用靶向代謝組學(xué)對結(jié)果進行驗證。此外，每個器官內(nèi)部都有不同的細(xì)胞類型和功能區(qū)域。對于特定的代謝改變，器官可能具有區(qū)域特異性。在本研究中，只使用了器官樣本的一小部分，不能完全代表整個器官的代謝。空間代謝組學(xué)整合質(zhì)譜成像和代謝組學(xué)技術(shù)，對動/植物組織和細(xì)胞中內(nèi)/外源性代謝物的種類、含量和差異性空間分布進行精準(zhǔn)測定［20］，其應(yīng)用將更有助于器官代謝的研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究構(gòu)建了胎羊ECC模型1 h，研究顯示胎兒ECC影響心臟和胎盤組織代謝。轉(zhuǎn)流過程中心臟功能明顯下降，代謝改變主要變現(xiàn)為脂肪酸氧化和氨基酸分解增強；胎盤功能暫無明顯下降，代謝改變不顯著，但一些代謝物的變化提示胎盤功能在轉(zhuǎn)流結(jié)束后可能將逐漸惡化。本研究首次從代謝的角度對胎羊ECC術(shù)后心功能不全和胎盤功能障礙的機制進行了初步探討，為胎兒ECC研究提供了新方向。