張健峰 張鵬飛 牛海濤

(青島大學附屬醫(yī)院泌尿外科，山東 青島 266003)

全球范圍內(nèi)男性膀胱癌的發(fā)病率和死亡率均較高[1]，同時膀胱癌也是我國最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤[2]，具有易轉(zhuǎn)移、易復發(fā)的特點[3]，目前常用的化療、免疫治療等療效也不理想，相關(guān)治療藥物存在特異性低、毒副作用大和半衰期短的問題[4-5]。納米材料因其對腫瘤組織穿透性強[6]、免疫原性低[7]和在血液中循環(huán)時間長[8]等特性，逐漸在腫瘤治療中得以應用，也是目前研究的新方向之一。FeSe2是一類重要的過渡金屬二鹵代物，具有優(yōu)異的磁性和近紅外區(qū)的高吸收率的特點，是目前腫瘤光熱治療領(lǐng)域的研究熱點[9-11]。本研究擬設(shè)計合成一種能夠降解谷胱甘肽(GSH)、選擇性抑制腫瘤細胞的FeSe2納米粒子，并比較該粒子對膀胱癌細胞和正常膀胱上皮細胞的抑制作用，為膀胱癌臨床治療提供新的可能的方式。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

人膀胱移行細胞癌細胞T24細胞株、人膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1細胞株均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞所。硒粉購于天津光復精細化工研究所，氯化亞鐵、乙醇胺、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)購于上海麥克林生化科技有限公司，活性氧(ROS)檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，GSH購于國藥集團化學試劑有限公司，DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

將T24細胞和SV-HUC-1細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)0.10胎牛血清和含10 g/L青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、含有體積分數(shù)0.05 CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。

1.3 FeSe2納米粒子的制備

取1 mmol硒粉和1 mmol氯化亞鐵分別溶解于15 mL乙醇胺中，均劇烈磁力攪拌1 h后，將兩者混合，混合物再劇烈磁力攪拌12 h后置于100 mL聚四氟乙烯的反應釜中，烘箱中180 ℃反應12 h，后自然冷卻至室溫。將混合物以8 000 r/min離心10 min，收集沉淀物并分別用無水乙醇和雙蒸水各洗滌3次，冷凍干燥后得到FeSe2納米粒子粉末[12],取1 mg FeSe2納米粒子溶于1 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，制備成濃度為1 g/L的FeSe2母液用于后續(xù)實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1FeSe2納米粒子表征觀察 采用JEM-2100F型透射電子顯微鏡(TEM)觀察FeSe2的形貌表征，放大倍數(shù)200 000。采用D8 Advance型X射線衍射儀檢測FeSe2的晶體結(jié)構(gòu)表征，掃描范圍為20°～80°，速率為1°/min，步長為0.02°。

1.4.2噻唑藍(MTT)法檢測FeSe2對T24細胞和SV-HUC-1細胞活性的影響 取處于對數(shù)生長期的T24細胞和SV-HUC-1細胞，胰酶消化后接種于96孔板中，每孔約8 000個細胞，待細胞完全貼壁后，分別加入FeSe2母液使其終濃度為0、10、25、50、75、100、200 mg/L。培養(yǎng)箱孵育24 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 g/L)，再放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸掉上清液后每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩混勻后置于酶標儀上測定490 nm波長處各孔的吸光度值。計算FeSe2對細胞活性的抑制率。

1.4.3DTNB法檢測FeSe2與GSH共孵育后GSH含量的變化 在1.5 mL EP管當中加入300 μL的GSH(1 mmol/L)，再分別加入0、10、20、30、40、50、60、80 μL的FeSe2母液(1 g/L)，然后使用PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)補至1 mL，使FeSe2終濃度分別為0、10、20、30、40、50、60和80 mg/L，于37 ℃共孵育4 h；同樣，在1.5 mL EP管當中加入300 μL的GSH(1 mmol/L)，再加入50 μL的FeSe2母液，用PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)補至1 mL，使FeSe2終濃度50 mg/L，于37 ℃共孵育不同時間(0、2、4、6 h)。孵育完成后在體系中加入10 μL的DTNB乙醇溶液(1.0 g/L)，震蕩混勻室溫下孵育5 min，采用Lambda 950型紫外分光光度計測定412 nm波長處的紫外吸光度值。

1.4.44′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)與2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)雙染檢測T24細胞內(nèi)ROS水平 取處于對數(shù)生長期的T24細胞，胰酶消化后接種于12孔板中，每孔約1×106個細胞，待細胞完全貼壁后，每孔加入終濃度5 mg/L的DAPI染料，分別進行如下兩組實驗：①每孔分別加入0、25、50和100 mg/L的FeSe2孵育4 h；②每孔分別加入50 mg/L的FeSe2孵育0、2、4、6 h。孵育結(jié)束后棄掉上清液，每孔再分別加入1 mL無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA熒光探針(10 μmol/L)，置于培養(yǎng)箱中孵育20 min，用無血清DMEM洗滌后，再加入1 mL無血清DMEM，最后置于倒置熒光顯微鏡下，觀察各組T24細胞的熒光強度。

1.4.5Ferrostatin-1與FeSe2共處理對T24細胞活性的影響 取處于對數(shù)生長期的T24細胞，胰酶消化后接種于96孔板中，每孔大約8 000個細胞，待細胞完全貼壁以后，將細胞分為5組，分別為細胞對照組(A組)、FeSe2組(B組)、FeSe2+Ferrostatin-1100 nmol/L組(C組)、FeSe2+Ferrostatin-1 200 nmol/L組(D組)、FeSe2+Ferrostatin-1 400 nmol/L(E組)。培養(yǎng)箱孵育24 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 g/L)，再放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸掉上清液后每孔加入150 μL DMSO，震蕩混勻后置于酶標儀上測定490 nm波長處各孔的吸光度，計算C、D、E組細胞活性對比B組細胞活性的相對逆轉(zhuǎn)率。相對逆轉(zhuǎn)率=(C、D、E組吸光度值-B組吸光度值)/ B組吸光度值×100%。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 合成的FeSe2納米粒子的表征

TEM觀察顯示合成的FeSe2納米粒子直徑為10～20 nm(圖1A)，X射線衍射譜圖(XRD)顯示，F(xiàn)eSe2結(jié)晶度高，在θ為34.9°、36.3°和48.2°處有明顯的特征衍射峰(圖1B)。

A：TEM觀察結(jié)果，B：XRD顯示結(jié)果

2.2 FeSe2對T24細胞和SV-HUC-1細胞的抑制作用

兩因素析因設(shè)計的方差分析顯示，F(xiàn)eSe2的濃度、細胞類型和FeSe2濃度與細胞類型的交互作用對T24細胞活性均具有顯著影響(F濃度=111.30，F(xiàn)細胞=868.60，F(xiàn)濃度*細胞=41.47，P<0.05)。單獨效應分析顯示，F(xiàn)eSe2對T24細胞的抑制作用強于對SV-HUC-1細胞的抑制作用(F=35.09～294.71，P<0.05)，F(xiàn)eSe2對T24細胞與SV-HUC-1細胞的抑制作用則均隨著FeSe2濃度的增高而增強(F=142.74、10.04，P<0.05)。詳見表1。

表1 FeSe2對T24細胞和SV-HUC-1細胞的抑制率(χ/%)Tab.1 Inhibitory rate of FeSe2 on T24 cells and SV-HUC-1 cells (χ/%)

2.3 FeSe2對GSH的降解作用

DTNB法檢測結(jié)果顯示，將50 mg/L FeSe2與GSH共孵育0、2、4、6 h后，吸光度值分別為0.558±0.017、0.410±0.036、0.167±0.008、0.052±0.011，隨著孵育時間延長，GSH含量逐漸減少，差異具有顯著性(F=240.50，P<0.05)。0、10、20、30、40、50、60和80 mg/L濃度的FeSe2與GSH共孵育4 h后，吸光度值分別為0.616±0.036、0.485±0.024、0.448±0.021、0.414±0.018、0.359±0.011、0.185±0.013、0.151±0.016、0.130±0.011，并隨著FeSe2濃度的增大，GSH含量逐漸減少，差異均具有顯著意義(F=153.60，P<0.05)。

2.4 FeSe2對T24細胞內(nèi)ROS水平的影響

DAPI與DCFH-DA雙染結(jié)果顯示，DAPI進入細胞后定位于細胞核內(nèi)，使用405 nm激光激發(fā)后發(fā)出藍色熒光，DCFH-DA進入細胞后與ROS反應生成2′,7′-二氯熒光素(DCF)，使用488 nm激光激發(fā)后發(fā)出綠色熒光(圖2)。圖中顯示，不同時間和不同濃度處理的T24細胞內(nèi)均可見藍色熒光和綠色熒光，且隨著FeSe2濃度增高或作用時間延長，藍色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強。

DAPI與DCFH-DA雙染，40倍，標尺=50 μm圖2 不同濃度和不同時間FeSe2對T24細胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.2 Effect of FeSe2 with different concentrations and treatment times on ROS level in T24 cells

2.5 Ferrostatin-1與FeSe2共處理對T24細胞活性的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，A、B、C、D、E組吸光度值分別為0.470±0.027、0.184±0.008、0.215±0.013、0.247±0.014、0.274±0.011，各組細胞的吸光度值比較差異具有顯著性(F=194.80,P<0.05)。其中A組與B組比較、B組與C、D、E組間比較，差異均有顯著性(P<0.05)。FeSe2和Ferrostatin-1共處理的C、D、E組細胞活性對比B組細胞活性的相對逆轉(zhuǎn)率分別為22.28%、34.24%、48.91%，隨著Ferrostatin-1濃度的升高，對FeSe2作用于T24細胞抑制作用的逆轉(zhuǎn)率也越高(F=43.81,P<0.05)。

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第1位，在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌[1]。膀胱癌分為肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)和非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)[13-14]。目前膀胱癌的治療仍以手術(shù)為主，或同時聯(lián)合其他方式的綜合治療[15],但70%～80%的NMIBC患者在術(shù)后5年內(nèi)復發(fā)或進展[16]，10%～20%的患者進展為MIBC或遠處轉(zhuǎn)移性疾病[17]；放療及化療的副作用較大，缺乏選擇性[4-5]；目前新興的二線治療如免疫治療和靶向治療，則因價格昂貴和患者反應率低，而不能被廣泛接受[18-20]。

納米材料因穿透腫瘤組織能力強、免疫原性低和在血液中循環(huán)時間長等特性，成為腫瘤治療的新方向之一。ROS是指在生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的、含氧自由基和易形成自由基的過氧化物的總稱。低濃度的ROS在調(diào)節(jié)信號通路、消除病原體、調(diào)節(jié)炎癥以及促進細胞增殖等方面具有重要作用，然而當ROS濃度較高時則可能破壞核酸、蛋白質(zhì)或細胞膜，從而導致細胞的死亡[21]。GSH是細胞內(nèi)最重要的抗氧化物之一，其能夠保護細胞免受ROS損傷[19-20]。腫瘤細胞的ROS水平往往高于正常細胞，導致體內(nèi)如GSH的抗氧化劑水平適應性升高，使ROS和GSH在高水平保持動態(tài)平衡，且傾向于呈現(xiàn)為氧化應激的狀態(tài)[22-23]。

本研究以乙醇胺為溶劑，用氯化亞鐵和硒粉一步水熱法合成了FeSe2納米粒子，該粒子TEM表征顯示直徑為10～20 nm，符合納米藥物的尺寸要求；XRD表征顯示，在θ為34.9°、36.3°和48.2°處有特征衍射峰，與FeSe2的JCPDS 21-0432數(shù)據(jù)一致，表明成功合成FeSe2晶體。通過MTT法比較FeSe2對T24細胞和SV-HUC-1細胞活性的抑制作用，結(jié)果顯示，F(xiàn)eSe2針對T24細胞活性的抑制作用強于對SV-HUC-1細胞活性的抑制作用。為進一步探究可能的機制，將FeSe2與GSH共孵育，以DTNB檢測GSH含量，結(jié)果顯示FeSe2可降解GSH，且降解量隨著濃度的增加或時間的延長而增加。DAPI與DCFH-DA雙染結(jié)果顯示，隨著FeSe2濃度增高或作用時間延長，藍色熒光逐漸減弱，表明FeSe2可抑制T24細胞活性，與MTT結(jié)果相符；綠色熒光逐漸增強，表明FeSe2能夠誘導T24細胞ROS升高，且ROS水平與FeSe2的濃度和作用時間均呈正相關(guān)。因此FeSe2對膀胱癌T24細胞的抑制作用可能與降解GSH導致細胞內(nèi)ROS的水平升高密切相關(guān)。FeSe2對T24細胞活性的抑制作用明顯強于對SV-HUC-1細胞的抑制作用，則可能是因為腫瘤細胞的ROS濃度明顯高于正常細胞，使用外源性試劑增加氧化應激對腫瘤細胞的破壞性比對正常細胞的破壞性更大。即腫瘤細胞中本身固有的ROS濃度較高，當腫瘤細胞和正常細胞都暴露于相同量的外界ROS時，腫瘤細胞內(nèi)的ROS水平將更容易達到觸發(fā)細胞死亡的閾值；而正常細胞固有的ROS濃度低，因此能夠緩沖一定量的ROS而不至于觸發(fā)細胞死亡[24]。

鐵死亡是鐵依賴性的，由過度脂質(zhì)過氧化引起，是伴隨GSH耗竭和ROS爆發(fā)的一種細胞死亡方式[25]。Fe2+在鐵死亡過程中起著重要推動作用，當它與H2O2混合并發(fā)生反應時，可以產(chǎn)生自然界中氧化性僅次于氟的羥基自由基[26]。本研究中合成的FeSe2含有Fe2+，能夠降解GSH，產(chǎn)生ROS，因此很可能參與了鐵死亡介導細胞死亡的過程。腫瘤細胞的H2O2水平高于正常細胞[27]，因此相同濃度的FeSe2能夠產(chǎn)生更多的羥基自由基，這也可能是導致FeSe2對腫瘤細胞和正常細胞抑制作用不同的原因。進一步的實驗證明，隨著Ferrostatin-1濃度增大，逆轉(zhuǎn)FeSe2對T24細胞抑制作用的效應逐漸增強，提示FeSe2可能是通過觸發(fā)鐵死亡從而導致對T24細胞活性的抑制作用。

綜上所述，F(xiàn)eSe2可以消耗胞外GSH，誘導細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，可能參與鐵死亡的過程，從而抑制T24細胞的活性，有望用于膀胱癌治療。而這還需進一步的動物實驗和前瞻性臨床研究來進行驗證。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻：牛海濤、張鵬飛、張健峰參與了研究設(shè)計；牛海濤、張健峰參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byNIUHaitao,ZHANGPengfei, andZHANGJianfeng. The manuscript was drafted and revised byNIUHaitaoandZHANGJianfeng. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.