胡淑慧 李長(zhǎng)貴 路杰

(山東省代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市痛風(fēng)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，山東 青島 266003)

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是由于尿酸生成過(guò)多和(或)排泄不足引起的代謝異常綜合征。近年來(lái)，我國(guó)HUA的發(fā)病人群呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)[1-2]，總體患病率約達(dá)13.3%[3]。國(guó)內(nèi)外大量的研究資料顯示，HUA是慢性腎臟病發(fā)生和發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4-6]，血尿酸濃度長(zhǎng)期呈過(guò)飽和狀態(tài)，會(huì)加重腎臟負(fù)擔(dān)，使尿酸結(jié)晶沉積于腎臟，導(dǎo)致不同程度的腎損害，稱為尿酸性腎病(或痛風(fēng)性腎病)[7-8]。隨著病情的進(jìn)展，尿酸性腎病最終可發(fā)展為腎衰竭，尿酸性腎病儼然成為威脅人類(lèi)生命健康的重要疾病之一。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)尿酸性腎病動(dòng)物模型的開(kāi)發(fā)仍處于早期階段，主要通過(guò)增加尿酸攝入和(或)減少尿酸排泄兩方面來(lái)實(shí)現(xiàn)，缺乏可靠的尿酸性腎病特征表型，這極大地阻礙了對(duì)其后續(xù)致病機(jī)制和新藥開(kāi)發(fā)的研究。本研究旨在探討尿酸氧化酶(Uox)基因敲除小鼠的腎臟表型，明確其作為尿酸性腎病模型小鼠的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取Uox基因敲除小鼠(以C57BL/6J為遺傳背景[9])16只，設(shè)為A組；同窩野生型小鼠16只，設(shè)為B組。兩組小鼠均為雄性，8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.1.2試劑和儀器 CD3抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)，CD68抗體(美國(guó)BioLegend公司)，非布司他(江蘇恒瑞制藥公司)。低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，TBA-40FR型全自動(dòng)血液生化儀(日本TOSHIBA公司)，自動(dòng)脫水機(jī)(日本Sakura公司)，RM2235切片機(jī)購(gòu)自于德國(guó)Leica公司，SMZ800解剖鏡以及偏正光顯微鏡購(gòu)自于日本Nikon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1生化指標(biāo)檢測(cè) A、B兩組小鼠各16只禁食過(guò)夜，次日8：00用異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行氣體麻醉，經(jīng)內(nèi)眥靜脈采集500 μL靜脈血至離心管中，室溫下靜置1 h，然后4 ℃下3 500 r/min離心20 min，分離出160 μL血清至潔凈生化杯中。應(yīng)用全自動(dòng)血液生化儀測(cè)定兩組小鼠血尿酸、血肌酐水平，每組測(cè)2次，計(jì)算平均值。

1.2.2腎臟病理標(biāo)本制作 隨機(jī)取A、B兩組小鼠各4只。腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉小鼠，待小鼠無(wú)結(jié)膜反應(yīng)及觸痛反應(yīng)后，開(kāi)腹取出雙側(cè)腎臟。將取出的一側(cè)腎臟迅速置于40 g/L多聚甲醛中，固定24 h后，用PBS沖洗3次，置于自動(dòng)脫水機(jī)中進(jìn)行脫水，石蠟包埋及切片。通過(guò)蘇木精-伊紅染色、Masson染色、抗CD3和抗CD68免疫組化染色，對(duì)比兩組小鼠腎臟病理改變、纖維化程度及炎癥狀態(tài)。將取出的另一側(cè)腎臟迅速置于無(wú)水乙醇中，固定24 h后石蠟包埋及切片，在偏振光顯微鏡下觀察尿酸鹽晶體沉積情況。

1.2.3降尿酸治療 隨機(jī)取A組小鼠6只，生理鹽水溶解非布司他(0.8 g/L)后灌胃給藥(8 mg/kg)；隨機(jī)取B組小鼠6只及剩余A組小鼠6只，用生理鹽水灌胃(10 mL/kg)作為對(duì)照。維持小鼠正常飼養(yǎng)，每日灌胃1次，連續(xù)灌胃4周后，比較不同處理的兩組小鼠灌胃前后血尿酸、血肌酐的差值，每組測(cè)2次，計(jì)算平均值。觀察非布司他給藥后A組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積情況的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

A、B兩組小鼠的血尿酸水平分別為(507.44±38.43)、(166.13±15.98)μmol/L，A組小鼠血尿酸水平顯著高于B組(t=32.80，P<0.01)。A、B組小鼠血肌酐水平分別為(39.56±5.67)、(13.88±2.00)μmol/L，A組小鼠血肌酐水平顯著高于B組(t=17.10，P<0.01)。

2.2 兩組小鼠腎臟病理檢測(cè)結(jié)果

肉眼下A組小鼠腎臟體積膨大，呈灰白色，被膜下散布乳白色顆粒，表面不平并見(jiàn)多個(gè)囊腔，皮髓質(zhì)充血水腫，交界清晰；B組小鼠腎臟表面光滑，呈淺褐色，皮髓質(zhì)交界清晰。

光鏡下，蘇木精-伊紅染色顯示，A組小鼠腎臟腎盂明顯積水，腎臟結(jié)構(gòu)異常，呈空洞狀，腎皮質(zhì)變薄，伴腎臟部分萎縮；B組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常。高倍鏡下顯示，A組小鼠腎單位結(jié)構(gòu)異常，腎小球聚集伴輕度萎縮，鮑曼氏囊擴(kuò)張，腎小管空泡變性伴刷狀緣脫落，部分腎小管呈不同程度擴(kuò)張，腎間質(zhì)輕度水腫；B組小鼠腎單位結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯病理改變。Masson以及抗CD3、抗CD68免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，A組小鼠腎臟間質(zhì)大量藍(lán)綠色膠原纖維沉積，纖維化損傷嚴(yán)重，并且伴有包括CD3+中性粒細(xì)胞、CD68+巨噬細(xì)胞在內(nèi)的大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；B組小鼠腎臟間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，沒(méi)有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組小鼠腎臟病理學(xué)檢查結(jié)果(200倍)Fig.1 Renal pathological results of the two groups (×200)

2.3 各組降尿酸治療效果

經(jīng)非布司他灌胃后的A組小鼠與生理鹽水灌胃的A組、B組小鼠相比，治療前后血尿酸水平差值和血肌酐水平差值均有顯著性差異(F=195.54、42.20，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 不同處理的兩組小鼠血尿酸、血肌酐水平的變化Tab.1 Changes in the levels of serum uric acid and serum creatinine in two groups after different treatments

同時(shí)，非布司他治療前A組小鼠腎臟可見(jiàn)明顯的尿酸鹽晶體(棕色晶體)沉積(圖2A)，B組小鼠腎臟無(wú)明顯的尿酸鹽晶體沉積(圖2B)；但經(jīng)非布司他治療4周后，A組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積明顯減少(圖2C)。

A：非布司他治療前A組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積情況，B：非布司他治療前B組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積情況，C：非布司他治療后A組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積情況圖2 兩組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積情況(400倍)Fig.2 Deposition of urate crystals in the kidney of the two groups (×400)

3 討 論

腎臟是尿酸最常損害的靶器官之一，高水平的尿酸通過(guò)直接或間接作用導(dǎo)致腎臟損傷，引發(fā)尿酸性腎病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在79%～99%的痛風(fēng)患者尸檢中可觀察到尿酸性腎病典型的病理改變，即腎間質(zhì)和腎小管內(nèi)大量雙折光的針狀尿酸鹽結(jié)晶沉積，周?chē)橛醒仔约?xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞壞死，腎小管萎縮，間質(zhì)纖維化，嚴(yán)重者腎單位毀損[10]。

Uox是參與嘌呤代謝的重要酶，在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，能夠?qū)⒛蛩嵫趸癁楦子谌芙獾哪蚰宜?，并排出體外[11]。然而，由于Uox基因在人類(lèi)和類(lèi)人猿進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了沉默突變，人體缺乏功能性尿酸氧化酶，尿酸成為人體內(nèi)嘌呤的代謝終末產(chǎn)物，導(dǎo)致人類(lèi)尿酸水平是嚙齒動(dòng)物的5～10倍[12]。在尿酸生成過(guò)多和(或)排泄不足的情況下，血清尿酸濃度將會(huì)升高，隨著病情的發(fā)展，最終引起尿酸性腎病。

本研究結(jié)果顯示，Uox基因敲除小鼠血尿酸水平>420 μmol/L，達(dá)到人類(lèi)HUA的診斷標(biāo)準(zhǔn)。Uox基因敲除小鼠血肌酐水平顯著高于同窩野生型小鼠，并且存在明顯的尿酸性腎病的特征，腎間質(zhì)和腎小管有大量尿酸鹽結(jié)晶沉積，腎臟結(jié)構(gòu)異常，存在明顯腎盂積水、鮑曼氏囊和腎小管擴(kuò)張、腎間質(zhì)纖維化和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。未經(jīng)治療的Uox基因敲除小鼠血尿酸持續(xù)處于高水平，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腎功能損害加重；而經(jīng)非布司他治療4周后的Uox基因敲除小鼠，血尿酸、血肌酐水平顯著改善，腎臟尿酸鹽晶體沉積明顯減少，表明降尿酸治療不僅可以有效降低Uox基因敲除小鼠血尿酸水平，并可進(jìn)一步緩解其腎功能損傷，減少腎臟沉積的尿酸鹽晶體。以上結(jié)果支持尿酸性腎病小鼠模型構(gòu)建成功。

目前，國(guó)內(nèi)外尿酸性腎病的造模方式主要有兩種：藥物誘導(dǎo)和基因修飾。傳統(tǒng)的尿酸性腎病模型多采用藥物誘導(dǎo)方式[13]，但藥物誘導(dǎo)的小鼠模型存在藥物劑量不準(zhǔn)確、血尿酸水平波動(dòng)大、腎臟損傷輕重不一、有的藥物本身就具有腎毒性等缺點(diǎn)，不適宜進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)。WU等[14]構(gòu)建了第一個(gè)Uox基因定點(diǎn)突變的小鼠模型，但該突變小鼠血尿酸水平極高，約為野生型小鼠的10倍，腎臟損害嚴(yán)重，嚴(yán)重的HUA和腎病導(dǎo)致半數(shù)以上的小鼠存活期不超過(guò)4周，因此無(wú)法實(shí)施長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)。此外，PREITNER等[15-16]構(gòu)建了肝臟特異性Glut9基因敲除的小鼠模型，但此小鼠血尿酸輕度升高，明顯低于人類(lèi)病理水平，補(bǔ)充肌酐后使血尿酸升高，腎臟表現(xiàn)出尿酸鹽結(jié)晶沉積、炎癥和間質(zhì)纖維化，但額外干預(yù)會(huì)干擾尿酸本身的作用，影響對(duì)其機(jī)制的研究。而本研究應(yīng)用的Uox基因敲除小鼠，不僅與人類(lèi)尿酸性腎病發(fā)病機(jī)制更接近，而且成模時(shí)間短、高尿酸水平穩(wěn)定、尿酸性腎病表型典型，是更為理想的尿酸性腎病模型。

既往普遍認(rèn)為尿酸性腎病的發(fā)病機(jī)制主要是由于尿酸鹽沉積于腎臟的直接作用[17]，但現(xiàn)在越來(lái)越多的臨床前數(shù)據(jù)表明，尿酸還可通過(guò)多種非晶體機(jī)制誘發(fā)尿酸性腎病[18-19]。研究表明，尿酸除了可以直接刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖外，還可以激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)和血管緊張素Ⅱ/環(huán)氧酶2/血栓素A2通路，引起腎小球入球小動(dòng)脈管腔狹窄、腎小球及球后循環(huán)缺血[20-21]。此外，尿酸可通過(guò)降低致密斑一氧化氮合酶的表達(dá)，減少一氧化氮的合成，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常，進(jìn)一步加重尿酸性腎病[22]。長(zhǎng)期的HUA可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞等合成活性氧，進(jìn)而引起DNA的損傷、酶的氧化和失活、炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡[23-25]。另有研究證實(shí)，輕度HUA即可造成腎損害和腎功能障礙，其機(jī)制可能與促炎途徑有關(guān)[26]。腎小管間質(zhì)纖維化是尿酸性腎病的典型特征，尿酸主要通過(guò)激活腫瘤壞死因子-β/Smad3、表皮生長(zhǎng)因子受體和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2通路促進(jìn)腎臟纖維化[27]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也與腎臟纖維化密切相關(guān)[28-29]?？傊蛩峥梢酝ㄟ^(guò)直接和間接作用導(dǎo)致尿酸性腎病，而穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型是其進(jìn)一步研究的前提。

綜上所述，該Uox基因敲除小鼠表型可作為尿酸性腎病的應(yīng)用模型，為日后尿酸性腎病的深入研究奠定基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)QYFYWZLL-25983)。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的條例進(jìn)行。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No.QYFYWZLL25983), and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of The People’s Republic of China on the Administration of Experimental Animals.

作者貢獻(xiàn)：路杰、李長(zhǎng)貴參與了研究設(shè)計(jì)；胡淑慧、路杰參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byLUJieandLIChanggui. The manuscript was drafted and revised byHUShuhuiandLUJie. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.