孫康哲 曾建國(guó)

血管性癡呆（vascular dementia,VD）是一種以組織學(xué)損傷和進(jìn)行性智力減退為特征的腦損傷，常由缺血缺氧性或出血性腦血管病變引發(fā)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有3600萬VD患者，并在將來相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)極可能呈顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)[2]。血管性因素逐漸成為老齡化人口中引發(fā)癡呆病變的高發(fā)因素，VD 逐漸成為繼阿爾茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）后的第二種常見老年癡呆癥[3-4]。VD 是一種可治療的老年性癡呆，只要早期預(yù)防和干預(yù)可以就大大降低殘障的發(fā)生率，因此針對(duì)VD的研究具有重要的意義。

中藥膠囊及顆粒劑具有服用簡(jiǎn)單、吸收好、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，被臨床廣泛使用。目前，常用于治療VD的中成藥有腦心通膠囊、養(yǎng)血清腦顆粒、銀杏葉片、腦復(fù)康膠囊、通心絡(luò)膠囊等[5]。腦心通膠囊組方源于清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)·卷下·癱痿論》的補(bǔ)陽還五湯，在此基礎(chǔ)加蟲類藥和活血化瘀藥共16 味中藥組成[6]。大量臨床數(shù)據(jù)證實(shí)，腦心通膠囊對(duì)VD 等疾病具有良好的治療作用[7]。本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)缺血-再灌注(2VO)方法建立VD 大鼠模型，用腦心通膠囊干預(yù)治療，探討其對(duì)VD 大鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用以及對(duì)膽堿能神經(jīng)環(huán)路的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康SPF 級(jí)雄性SD 大鼠48只（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXKG2017-0002；質(zhì)量合格證號(hào)：0017985），由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重范圍250～300 g，飼養(yǎng)條件為室溫(25±1)℃，濕度(50±10)%，明暗周期12 h，自由飲水和攝食。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)化分組法（計(jì)算機(jī)產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字）分為假手術(shù)(Sham)組、VD模型組、腦心通膠囊治療組、多奈哌齊陽性對(duì)照組，每組12 只。Y 迷宮實(shí)驗(yàn)每組使用6 只，病理切片觀察每組使用3只，免疫組化每組使用3只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器腦心通膠囊（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025001，批號(hào)：170520）；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)一抗(上海雅吉生物科技發(fā)展公司，批號(hào)：170430)；多奈哌齊(衛(wèi)材中國(guó)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H 20050978，批號(hào)：1702080)；水合氯醛（陜西圣瑞醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：170325）；Y 迷宮由廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院自制；INTELSINT TP 300封閉式組織脫水機(jī)；Thermo Scientific HistoStar 組織包埋機(jī)；SLEE CUT 4062手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)；上海精密儀器有限公司TEC 2500 病理組織漂烘儀；Leica TCSSP 8共聚焦顯微鏡等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模與給藥 VD 大鼠模型采用改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)缺血-再灌注(2VO)法[6]。主要方法如下:取健康雄性SD大鼠48只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，術(shù)前禁食禁水8 h，根據(jù)體重（350 mg/kg）使用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉。除Sham 組外，其余各組采取2.5 mg/kg硝普鈉腹腔注射，隨即使用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉10 min后松開10 min，反復(fù)操作5次，取出動(dòng)脈夾及絲線，消毒皮膚，保溫飼養(yǎng)。為防止低溫對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)，整個(gè)造模過程中維持動(dòng)物肛溫在37 °C左右。

各組大鼠造模后次日灌胃給藥，根據(jù)各組大鼠體重按劑量給藥，腦心通膠囊治療組（350 mg/kg）灌胃1次/d，多奈哌齊對(duì)照組（5 mg/kg）灌胃1 次/d，Sham 組和VD模型組用等容量生理鹽水灌胃，持續(xù)27 d。

1.3.2 空間記憶能力測(cè)試 采用Y迷宮實(shí)驗(yàn)法在術(shù)后27 d 進(jìn)行。每組取6 只大鼠從A 臂置入，使其在ABC 三個(gè)臂中自由活動(dòng)8 min，記下大鼠在ABC 三個(gè)臂的穿梭次數(shù)（經(jīng)過中心臂后且進(jìn)入不同于上一次進(jìn)入的臂，如ABC、ACB或CAB）。用選擇性穿梭的次數(shù)與總穿梭次數(shù)的比值（即自發(fā)交替率）來評(píng)估大鼠的空間記憶能力，比值越大，表明大鼠的空間記憶能力越好[9]。

1.3.3 病理切片觀察 每組取3 只大鼠使用蘇木精-伊紅（HE）染色法制作大鼠腦組織的病理切片[10]。連續(xù)給藥27 d 后，大鼠經(jīng)麻醉后固定于自制的手術(shù)木板上，置于解剖盤中，開胸暴露并游離出心臟，切開右心房，經(jīng)左心室插入灌流針并固定，分別用25 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）和4%多聚甲醛灌流心臟。取腦后用4%多聚甲醛固定，1 d后用自動(dòng)脫水機(jī)脫水，采用石蠟包埋后切片，選出海馬部位用HE法染色，置于光鏡下觀察CA1區(qū)形態(tài)學(xué)變化。

1.3.4 免疫組化法 每組取3 只大鼠根據(jù)體重（350 mg/kg）用水合氯醛腹腔注射麻醉，在心臟部位插入管道方向?yàn)樽笮氖蚁蛏鲃?dòng)脈，先用150 mL 0.9%生理鹽水沖洗，隨后灌入300 mL 4%多聚甲醛在30 min內(nèi)完成；取腦并將腦組織固定在4%多聚甲醛中10 h,隨后用30%的蔗糖-PBS 溶液和20%的蔗糖-多聚甲醛溶液處理直至下沉。選取視交叉后緣處腦組織，進(jìn)行包埋、切片處理，然后用免疫組化法染色。在電鏡下觀測(cè)各組大鼠海馬CAl區(qū)ChAT蛋白的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空間記憶功能測(cè)試結(jié)果結(jié)果表明，VD模型組大鼠空間記憶能力顯著低于Sham 組（P＜0.05）。多奈哌齊陽性對(duì)照組、腦心通膠囊治療組空間記憶能力顯著高于VD模型組（P＜0.05）。各分組間大鼠在迷宮總進(jìn)臂數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明各組大鼠常規(guī)移動(dòng)不受手術(shù)和口服藥物的影響。見表1。

表1 各組大鼠空間記憶能力情況

2.2 HE 染色的一般形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，Sham組海馬CA1區(qū)呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)清晰、分布均勻的多層排列的錐體細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞外形為圓形或橢圓形，顏色較淡，染色均勻?yàn)榈{(lán)色或藍(lán)色；VD 模型組海馬CA1 區(qū)顯示排列稀疏、紊亂的錐體細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較少，呈固縮狀或顯示為極淡藍(lán)色或藍(lán)色消失，細(xì)胞間質(zhì)成分呈顆粒狀分布，細(xì)胞內(nèi)有空腔，細(xì)胞間隙增大；和VD模型組相比，多奈哌齊陽性對(duì)照組、腦心通膠囊治療組呈規(guī)則外形形態(tài)，細(xì)胞間隙比VD模型組小，空腔現(xiàn)象比VD模型組少。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色情況（×100）

大鼠海馬CA1 區(qū)HE 染色中段細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，與Sham 組對(duì)比，VD 模型組明顯下降(P＜0.05)，而腦心通膠囊治療組及多奈哌齊陽性對(duì)照組較VD模型組增多(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色中段細(xì)胞數(shù)（）

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色中段細(xì)胞數(shù)（）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與VD模型組相比，#P＜0.05

2.3 免疫組化結(jié)果結(jié)果表明，與Sham 組對(duì)比，VD模型組ChAT陽性細(xì)胞數(shù)明顯下降(P＜0.01)，而腦心通膠囊治療組及多奈哌齊陽性對(duì)照組大鼠海馬CAl 區(qū)ChAT 陽性細(xì)胞數(shù)較VD 模型組增多(P＜0.05)。見圖2、表3。

表3 各組大鼠海馬CA1 區(qū)ChAT陽性細(xì)胞數(shù)（）

表3 各組大鼠海馬CA1 區(qū)ChAT陽性細(xì)胞數(shù)（）

注：與Sham組相比，*P＜0.01；與VD模型組相比，#P＜0.05

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)免疫組化法染色情況（×400）

3 討論

反復(fù)腦缺血-再灌注損傷是導(dǎo)致VD 的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，本次研究制備VD 大鼠模型采用的是經(jīng)改良的雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)缺血-再灌注(2VO)法。術(shù)后大鼠均出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能障礙，HE 染色提示，VD 模型組大鼠海馬CA1區(qū)中段細(xì)胞數(shù)顯著下降，神經(jīng)元受損，同時(shí)免疫組化結(jié)果說明造模大鼠中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路中ChAT蛋白顯著降低。

在對(duì)VD 病理機(jī)制的研究中，乙酰膽堿能系統(tǒng)對(duì)大腦的認(rèn)知學(xué)習(xí)功能起到重要作用。神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)便是在膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）的作用下由乙酰輔酶A 和膽堿合成的乙酰膽堿（Ach），其主要作用是傳遞神經(jīng)沖動(dòng)。乙酰膽堿能環(huán)路主要由Ach、乙酰膽堿酯酶、ChAT三部分組成，其總體狀況直接決定著癡呆的病發(fā)、嚴(yán)重程度和病程[11-12]。相關(guān)研究表明[13]，海馬CA1 區(qū)損傷的嚴(yán)重程度決定著VD 學(xué)習(xí)、記憶等相關(guān)功能的損害。膽堿能神經(jīng)環(huán)路的活性主要由乙酰膽堿酯酶(AChE)、乙酰膽堿受體(AChR)、膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)、囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體(VAChT)等物質(zhì)決定。ChAT 由于穩(wěn)定性高且僅存在于膽堿能神經(jīng)元內(nèi)而被廣泛認(rèn)為是膽堿能神經(jīng)元活性狀態(tài)的最佳標(biāo)志物[14-15]。

腦心通膠囊在臨床上被廣泛用于治療心腦血管疾病，是基于古方補(bǔ)陽還五湯增加了蟲類藥、活血化瘀藥制成的復(fù)方中藥制劑[16]。據(jù)報(bào)道，腦心通膠囊有可增強(qiáng)大腦血氧供應(yīng),保護(hù)腦細(xì)胞,對(duì)VD患者學(xué)習(xí)、認(rèn)知功能、判斷和思維能力起到改善作用[17-20]。從組織病理學(xué)和免疫組化結(jié)果來看，腦心通膠囊治療組大鼠海馬CA1區(qū)的中段細(xì)胞水平和ChAT陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于VD模型組，鑒于ChAT被廣泛認(rèn)為是膽堿能神經(jīng)元活性狀態(tài)的最佳標(biāo)志物，因此判斷腦心通膠囊有上調(diào)膽堿能神經(jīng)環(huán)路的功能。

本研究采用長(zhǎng)效的中樞乙酰膽堿酯酶抑制劑(AchEI)多奈哌齊作為陽性藥。其主要通過選擇性抑制乙酰膽堿的降解，增大神經(jīng)元突觸間隙乙酰膽堿的濃度，使VD癥狀得到改善。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，多奈哌齊可明顯改善VD 患者在認(rèn)知、智能以及日常生活能力的狀態(tài)，且很少產(chǎn)生不良的外周反應(yīng)[21-23]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，腦心通膠囊在改善大鼠空間記憶能力及調(diào)節(jié)大鼠膽堿能神經(jīng)環(huán)路ChAT蛋白的表達(dá)方面效果相當(dāng)。

本研究結(jié)果表明，腦心通膠囊在VD 大鼠膽堿能神經(jīng)環(huán)路ChAT 蛋白的表達(dá)方面有調(diào)控作用，能有效改善其他記憶能力。但是，本次研究仍存在不足之處，如未對(duì)其他膽堿能神經(jīng)蛋白進(jìn)行考察，沒有從基因?qū)用婷鞔_腦心通膠囊對(duì)ChAT基因啟動(dòng)子的調(diào)控作用，可在以后的研究中逐步完善。