蔡齊宗，王佳蕊，陳慶富，李洪有,2

(1.貴州師范大學蕎麥產業(yè)技術研究中心，貴州 貴陽,550001；2.貴州大學山地植物資源保護與種質創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州 貴陽，550025)

苦蕎(Fagopyrmtataricum(L.) Gaertn.)屬于蓼科蕎麥屬1 a生藥食同源小雜糧作物，起源于中國西南部，具有耐貧瘠、抗旱、耐冷涼、適應性強、生育期短等特點[1-3]。苦蕎作為一種重要的藥食同源小雜糧作物，不僅含有豐富的營養(yǎng)物質(蛋白質、氨基酸、脂肪、膳食纖維、維生素、各類礦質元素等)，還富含生物活性黃酮類化合物，具有消炎、抗氧化、抗動脈硬化、降“三高”、防糖尿病、防癌抗癌等多種醫(yī)藥保健功能，享有“五谷雜糧之王”和“三降”食品的美譽[3-7]。目前，苦蕎因其優(yōu)異的保健作用，備受人們青睞。

中國作為苦蕎的起源地和栽培歷史最為悠久的國家，已有4 000多年的栽培歷史，具有極其豐富的苦蕎種質資源[3-6,8-9]。因此，基于分子標記開展苦蕎種質資源遺傳多樣性、重要農藝性狀控制基因的遺傳定位、遺傳圖譜構建等研究，對苦蕎新品種選育、產業(yè)發(fā)展具有重要意義。

SSR(simple sequence repeats，簡單重復序列)，也稱微衛(wèi)星DNA(microsatellites DNA)，是一類由1～6個核苷酸為基本重復單元并在基因組中多次串聯(lián)重復的一段DNA序列[10-13]。由于SSR分子標記具有數(shù)量多、多態(tài)性高、共顯性、使用成本低及操作簡便等特點，已廣泛應用于植物遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、基因定位與克隆、數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus，QTL)定位等方面，是目前最為常用的分子標記之一[10-16]。目前，在苦蕎中已有SSR位點鑒定及分子標記開發(fā)的相關報道。黎瑞源等[12]基于苦蕎種子轉錄組數(shù)據(jù)共鑒定到2 700個SSR位點，設計合成150對SSR引物，并發(fā)現(xiàn)其中30對引物在40份苦蕎種質中具有多態(tài)性。賀潤麗等[13]從苦蕎種皮轉錄組數(shù)據(jù)中共鑒定到9 094個SSR位點，并設計了53對SSR引物，發(fā)現(xiàn)21對引物在苦蕎種質中具有多態(tài)性。杜偉等[11]從苦蕎全長轉錄組數(shù)據(jù)中共鑒定到1 107個SSR位點，并設計了132對SSR引物，其中11對具有較好的多態(tài)性且能將123份苦蕎種質劃分為2個亞群。此外，隨著苦蕎全基因組測序完成，基于苦蕎全基因組序列的SSR位點鑒定及分子標記開發(fā)也被開展起來。馬名川等[10]在苦蕎基因組中共檢測到1 640個SSR 位點，并設計出479對SSR引物，在選擇的200對引物中有56對在苦蕎和甜蕎種質中擴增出多態(tài)性。FANG等[14]在苦蕎基因組中鑒定到37 572個SSR位點，SSR位點出現(xiàn)頻率為12.32個·kb-1。此外，F(xiàn)ANG等[14]還設計出26 549對SSR引物，平均每17 kb有1個SSR標記。雖然目前已有大量的SSR標記在苦蕎中被鑒定，但考慮到在其他多種植物的基因組中SSR位點發(fā)生頻率為2～5個·kb-1[16-24]，因此推測目前苦蕎基因組中鑒定的SSR位點并未達到飽和。因此，本研究在已有的苦蕎全基因組序列的基礎上，對苦蕎基因組中的SSR位點進行系統(tǒng)鑒定并分析SSR特征，得到數(shù)目眾多的SSR位點，據(jù)此開發(fā)出大量SSR標記并進行多態(tài)性驗證，為苦蕎遺傳多樣性分析、高密度遺傳圖譜構建、重要基因定位與克隆、種質資源保護及遺傳改良等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取10份種子表型具有明顯差異的苦蕎種質作為SSR引物多態(tài)性鑒定的材料(表1)。所有研究材料由貴州師范大學蕎麥產業(yè)技術研究中心提供。

表1 供試苦蕎材料及其種子農藝性狀Table 1 Tartary buckwheat accessions used in this study and their seed traits

1.2 DNA樣品制備

將10份苦蕎種質各取15粒成熟種子，放置于已用酒精消毒過的墊有發(fā)芽紙的發(fā)芽盒中，均勻擺放，用小型噴壺將紙面打濕且盒內處于無積水狀態(tài)，蓋上發(fā)芽盒盒蓋，將其置于光照培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽培育。培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照和黑暗各12 h。每天定時補水1次。待種子長出2片子葉后，采集樣品3株，隨后利用研磨機磨樣，采用CTAB法提取DNA[25]，采用質量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳法初步檢查DNA的大小和質量，用微量紫外濃度檢測儀檢測DNA的質量濃度，根據(jù)A260和A280處吸光度的比值檢測DNA質量，于-20 ℃保存。

1.3 苦蕎基因組序列下載及SSR搜索方法

苦蕎“品苦1號”基因組序列下載自MBKbase數(shù)據(jù)庫(http://www.mbkbase.org/Pinku1/)，其基因組大小為451.36 Mb。利用MISA1.0 對苦蕎全基因組序列進行SSR位點搜索。SSR位點篩選標準為：(1)1、2、3、4、5、6 個堿基的最低重復次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5；(2)2 個SSR 位點之間的最小距離為100 bp。

1.4 SSR引物設計及多態(tài)性檢測

根據(jù)鑒定的苦蕎全基因組SSR 位點側翼的保守序列，利用Primer 3.0(Linux版)進行引物批量設計。設計的引物長度為18～23 bp，退火溫度為50～65 ℃，GC含量(DNA的4種堿基中，鳥嘌呤G和胞嘧啶C占全部堿基的比例)為45%～60%，擴增產物長度為100～300 bp。

隨機選取50對設計的引物送上海生物工程股份有限公司進行引物合成，以提取的10份苦蕎種質DNA為模板進行 PCR 擴增。PCR 反應體系：共10 μL，包括1μL(0.05 g·L-1)基因組DNA，6 μL 2×PCR Mix(vazyme)，1 μL(2 μmol·L-1)上游引物、1μL(2 μmol·L-1)上下游引物和1 μL ddH2O。PCR 擴增反應程序：94 ℃預變性 5min；94 ℃變性 40 s，53～57 ℃退火40 s，72 ℃延伸 40 s，33個循環(huán)；最后72 ℃延伸 5 min，反應結束后將PCR管置于沸水中變性5 min，最后產物中加入6 μL loading buffer進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：采用質量分數(shù)為 6%的非變性聚丙烯酰胺進行凝膠電泳。電泳條件是：0.5×TBE緩沖液，300～500 V電壓，約100 mA電流，電泳時間為0.5～1.5 h，直到Marker及目的條帶擴散開且未跑出，取出凝膠后用銀染法染色，最后將其置于凝膠成像儀上拍照。

1.5 統(tǒng)計方法

使用EXCEL 2016對獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖。根據(jù)10份苦蕎種質做聚丙烯酰胺凝膠電泳得到的電泳圖譜，將有顯著清晰的條帶記為1，將無差異條帶或無法明顯分辨的弱帶記為0，同時，缺失條帶記為999，最后構建數(shù)據(jù)矩陣，并根據(jù)類平均法( UPG-MA，unweighted pair group method arithmetic averages) ，使用 NTSYS-pc 2.20軟件對10份苦蕎種質做聚類分析[26]。

2 結果與分析

2.1 苦蕎全基因組SSR鑒定及其在染色體的分布

利用MISA1.0 軟件在苦蕎全基因組序列中共鑒定到148 830個SSR位點，平均每3.04 kb就有一個SSR位點。鑒定的SSR位點分布在苦蕎所有8條染色體上，各染色體上的SSR位點個數(shù)從高到低依次為1號染色體(22 521個)、2號染色體(19 763個)、3號染色體(19 479個)、4號染色體(18 374個)、5號染色體(17 549個)、6號染色體(17 171個)、7號染色體(17 161個)、8號染色體(16 812個)。各條染色體上SSR分布頻數(shù)密度從高到低依次為3號染色體(0.338個·kb-1)、8號染色體(0.336個·kb-1)、7號染色體(0.333個·kb-1)、1號染色體(0.331個·kb-1)、6號染色體(0.328個·kb-1)、5號染色體(0.326個·kb-1)、4號染色(0.324個·kb-1)、2號染色體(0.323個·kb-1)。單核苷酸至六核苷酸SSR重復類型均存在于苦蕎基因組中(表2)，但各類型SSR出現(xiàn)頻率差異較大。各類型SSR出現(xiàn)的頻率從高到低依次為單核苷酸重復(55.13%)、二核苷酸重復(34.97%)、三核苷酸重復(7.86%)、四核苷酸重復(1.52%)、五核苷酸重復(0.37%)、六核苷酸重復(0.15%)。在6種SSR重復類型中，單核苷酸重復和雙核苷酸重復占總數(shù)目的90.10%(表3)。

表2 各類型SSR在苦蕎染色體上的分布情況Table 2 Distribution of various types of SSR markers on tartary buckwheat chromosomes

2.2 苦蕎不同類型SSR的重復頻率及分布特征

SSR分子標記重復類型共96種。表3顯示了從單核苷酸重復頻率到六核苷酸重復頻率的分布狀況和數(shù)量特征。在每種重復基序類型中，重復頻率越少其數(shù)量越多，5～11次重復的基因序列共有100 547個，所占比例為67.56%。單核苷酸基序中，重復10次的最多(40 001，占48.75%)；二核苷酸中，6次重復的最多(11 734個，占22.55%)；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸基序中，5次重復的最多。在96種重復頻率中，單核苷酸重復類型中重復頻率為10次的是所有重復類型中最多的。

表3 苦蕎各SSR重復類型的重復頻率Table 3 The repetition frequency and distribution of SSR loci

2.3 苦蕎SSR重復基因序列類型及分布特征

SSR基序重復類型(不考慮序列互補)共發(fā)現(xiàn)510種?？紤]序列互補時，SSR基序重復類型共有171種。在序列互補類型中，由表4可知，A/T類型最豐富，約占總SSR標記的53.143%；其次是AT/AT類型，約占總標記的30.038%，這兩種類型標記占總標記的83.181%；在其余剩下的序列互補的SSR基序類型中，AAT/ATT約占總SSR的3.193%，AG/CT 約占3.083%，AAG/CTT約占2.086%，C/G占比約1.984%，AC/GT約占比1.827%，其他各類型SSR占比均不足1%。

表4 苦蕎SSR基序重復類型及發(fā)生頻率Table 4 SSR motif repeat typesand their frequency on tartary buckwheat

2.4 苦蕎全基因組SSR引物設計及多態(tài)性評價

根據(jù)檢測到的148 830個SSR位點，利用Primer 3.0進行引物設計，共批量設計出128 706對引物。

為了驗證設計的引物是否有效，隨機選取50對引物對10份具有不同性狀的苦蕎種質進行多態(tài)性檢測。在50對引物中，41對引物(82.00%)有明顯的擴增條帶，其中15對引物的擴增條帶表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性，多態(tài)率為30.00%,18號引物具有多態(tài)性，但不明顯(圖1)，有效引物序列信息見表5。

根據(jù)15對引物擴增多態(tài)性結果，利用種質間的遺傳相似性系數(shù)對10份苦蕎進行聚類分析，結果表明,當遺傳相似相系數(shù)為0.63時，10份苦蕎可聚類為4個類群，其中類群Ⅰ僅含T5，種子性狀為黑色圓粒厚殼；類群Ⅱ包含T3、T6、T7、T9，T3、T6、T9都是厚殼；T3、T6、T7種皮均為黑色；類群Ⅲ包含T8、T10，種子均是錐形；類群Ⅳ包含T1、T2、T4，種子都較短(圖2)。

注：圖中M1和M2表示marker;上方1～10表示10份苦蕎種質;下方數(shù)字表示引物序號。Note:M1 and M2 in the figure represent markers;The number inthe top markered as 1-10 represent 10 tartary buckwheat germplasms;The bottom numbers represent primer numbers.圖1 引物 (下方)在10個苦蕎種質(上方)中的擴增產物多態(tài)性Fig.1 The polymorphism of SSR primers (Bottom) among 10 tartary buckwheat germplasms (Top)

圖2 10份苦蕎種質聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 10 tartary buckwheat accessions

3 結論與討論

目前已有一些關于苦蕎SSR開發(fā)的報道，這些報道中發(fā)現(xiàn)的SSR位點數(shù)的范圍為7 147～37 572[10-14,27-30]，SSR標記遠未達到飽和。本研究以苦蕎全基因組序列(總長度451 363 871 bp)為基礎，利用MISA1.0軟件共鑒定到148 830個SSR位點，它們在8條染色體上均有分布。本研究鑒定的SSR位點的發(fā)生頻率為3.04個·kb-1，其數(shù)目是目前苦蕎中鑒定到的最多SSR位點數(shù)目(37 572個)的近4倍[10,14]。因此，本研究所得到的SSR位點更加全面和豐富，其原因可能與本研究中SSR篩選時設置標準更精細有關。此外，在許多植物全基因組序列中，SSR位點發(fā)生的頻率主要集中在2～5個·kb-1[16-24]。因此，推測本研究在苦蕎全基因組上鑒定的SSR位點基本達到了飽和。

本研究鑒定的苦蕎SSR可分為單核苷酸重復至六核苷酸重復6種類型，其中單核苷酸重復和二核苷酸重復是主要的SSR類型，二者所占比例分別高達55.13%和34.97%。這些研究結果與其他已報道[10-14,27-30]的結果間存在一定的差異。同轉錄組序列來源的SSR類型相比[11-13]，優(yōu)勢類型一致，均為單核苷酸重復，但轉錄組數(shù)據(jù)中的第二大SSR類型為三核苷酸重復；同基因組序列來源的SSR類型相比，優(yōu)勢類型不一致，本研究鑒定的優(yōu)勢SSR類型為單核苷酸重復和二核苷酸重復，而FANG等[14]鑒定的SSR優(yōu)勢類型為二核苷酸重復和三核苷酸重復，馬名川等[10]鑒定的優(yōu)勢類型為三核苷酸重復和二核苷酸重復。這些差異可能是由于前人用于SSR位點查詢的核酸序列大小或者鑒定方法與本研究不一致導致其SSR位點鑒定不夠全面所致；與轉錄組測序所得到的SSR位點相比，全基因組分析更加全面。本研究中，從SSR位點重復基序類型來看，A/T重復類型最豐富，約占總SSR標記的53.143%，其次是AT/AT重復類型，約占總標記的30.038%。這些結果與前人[10,15,27-30]的在苦蕎中鑒定的優(yōu)勢基序類型基本一致，表明苦蕎中的SSR位點的優(yōu)勢基序類型是A/T和AT/AT重復類型。

在苦蕎SSR引物多態(tài)性研究方面，F(xiàn)ANG等[14]對440對SSR引物進行PCR擴增，其中313對(79.44%)具有多態(tài)性；馬名川等[10]研究從200對引物中獲得了17對具有多態(tài)性(0.85%)的引物；賀潤麗等[13]研究中使用53對引物進行PCR擴增，其中21對擴增出了多態(tài)性(51.22%)；SHI等[30]研究中，150對引物中有36對引物具有多態(tài)性(24%)。本研究使用Primer 3.0共設計出128 706對SSR引物，驗證結果顯示多態(tài)率為30.00%，因此，設計的SSR引物是可靠的，可用于苦蕎分類、遺傳定位等研究。

綜上所述，本研究從451.36 Mb的苦蕎全基因組序列中鑒定出148 830個SSR位點，平均每隔3.04 kb就有一個SSR位點。單核苷酸重復和二核苷酸重復類型最為豐富。在獲得的SSR序列中，共鑒定出171種堿基重復類型，表明苦蕎基因組SSR序列類型較為豐富。此外，本研究共設計出128 706對SSR引物，并對其中50對SSR引物的多態(tài)性進行驗證，獲得15對多態(tài)性好的SSR引物，平均多態(tài)性為30%，表明這些設計的引物可以用于苦蕎相關研究。