王曉龍， 楊 曌， 李 紅， 米福貴， 來永才， 鐘 鵬， 徐艷霞， 柴 華，李莎莎， 吳 玥， 張 楊， 宋敏超， 王 銳， 高海娟， 周景明

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院博士后科研工作站， 哈爾濱 150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院， 黑龍江 齊齊哈爾 161005；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院， 呼和浩特 010011)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)為多年生豆科飼草，因其具有適應范圍廣、營養(yǎng)價值高、固氮能力強、適口性好等特性，享有“牧草之王”的美譽[1]。目前，苜蓿已成為種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整及草牧業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展的重要飼料作物，是被廣泛種植利用的優(yōu)質(zhì)飼草之一[2]；但由于不同苜蓿品種對低溫的抵抗能力不一致，因此深入了解苜蓿低溫萌發(fā)特性，擴大苜蓿人工草地建設和改善環(huán)境，提高苜蓿在不同地域適應性十分重要[3-4]。

種子是作物生長的基礎材料，種子萌發(fā)是植物生長發(fā)育的最初始階段，也是最敏感階段，種子萌發(fā)對溫度的需求體現(xiàn)了其對環(huán)境適應的生態(tài)機制[5]。溫度低于種子萌發(fā)適宜溫度時，萌發(fā)速率減緩，到一定限度時僅有少量種子發(fā)芽[6]，且種子萌發(fā)質(zhì)量及活力都會受到不同程度的影響。通常種子萌發(fā)條件有恒溫萌發(fā)和變溫萌發(fā)兩種，變溫條件下種子的萌發(fā)更貼近于自然界中的晝夜溫差變化。恒溫和變溫對不同休眠類型的物種影響較大，變溫幅度的增加可有效促進或抑制某些物種種子萌發(fā)[4]。近年來，國內(nèi)外學者已進行大量關于苜蓿種子對溫度脅迫響應的研究[7-9]，而本研究通過測定不同變溫處理下苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、簡化活力指數(shù)等萌發(fā)指標，并對不同苜蓿萌發(fā)期耐低溫性進行比較，探究苜蓿種子萌發(fā)對溫度的響應，為我國北方地區(qū)苜蓿優(yōu)良耐寒品種選育及適時播種提供參考。

1 材料及方法

1.1 試驗材料及試驗設計

試驗收集國內(nèi)外苜蓿材料7份，其中草原3號由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學提供；公農(nóng)2號和敖漢苜蓿由中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所提供；龍牧801由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院提供；皇后苜蓿、420苜蓿、賽迪苜蓿由百綠(天津)國際草業(yè)有限公司提供。選取大小適中、飽滿的苜蓿種子，分別置于4 ℃、4 ℃/18 ℃、18 ℃/25 ℃條件下萌發(fā)，以最適宜發(fā)芽溫度25 ℃為對照(ck)。將培養(yǎng)皿洗凈，放入雙層濾紙，在智能人工培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)，變溫處理每隔12 h切換一次溫度。每個培養(yǎng)皿中整齊擺放100粒苜蓿種子，4次重復。每日觀察并記錄萌發(fā)種子數(shù)，并統(tǒng)計發(fā)芽率[3]。

1.2 測定指標

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子個數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt，式中Gt為t天的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應的天數(shù)。

用游標卡尺測量每株苗的根長，求平均值。

簡化活力指數(shù)=發(fā)芽率×生物量；

生物量=芽干物質(zhì)量+根干物質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理，用Sigma Plot 12.5軟件作圖，SAS 9.0軟件進行方差分析和主成分分析。

應用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法[10-11]綜合評價所測指標，求各指標隸屬函數(shù)值。

若所測指標與苜蓿耐寒性呈正相關，則：

Fij=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)

若所測指標與苜蓿耐寒性呈負相關，則：

Fij=1-(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)

式中：Fij為i苜蓿j指標值；Xij為鑒定i苜蓿j指標隸屬值；Ximax為所鑒定i苜蓿j指標最大值；Ximin為所鑒定i苜蓿j指標最小值。將i苜蓿各項指標的函數(shù)值進行累加，求平均隸屬函數(shù)值，均值越大則該苜蓿的耐寒性越強。最后對7個苜蓿品種耐寒性進行比較，得出各品種抗寒性強弱順序。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽動態(tài)變化

對苜蓿種子在變溫條件下的萌發(fā)動態(tài)規(guī)律進行觀測發(fā)現(xiàn)，變溫處理下各苜蓿材料的萌發(fā)高峰期呈延遲趨勢。與ck相比，變溫(4 ℃/18 ℃)處理下各苜蓿材料種子萌發(fā)高峰期延遲1～2 d。變溫4 ℃/18 ℃時，第2天種子開始萌發(fā)，第3～4天達到峰值，而對照組的品種第2天種子萌發(fā)已達到峰值，第3～4天種子萌發(fā)基本結(jié)束(圖1)。盡管變溫(4 ℃/18 ℃)處理較ck萌發(fā)峰值有所延后，但與恒溫(4 ℃)處理相比，萌發(fā)峰值卻提前3～4 d。

圖1 不同溫度下苜蓿種子每日的發(fā)芽率Fig.1 Germination rate of alfalfa seeds at different temperatures per day

2.2 發(fā)芽率

由圖2可知，苜蓿種子在變溫條件下的發(fā)芽率均較高，變溫處理(18 ℃/25 ℃和4 ℃/18 ℃)下，發(fā)芽率分別為89%～98%和86%～93%。變溫4 ℃/18 ℃處理時的種子發(fā)芽率顯著低于ck，其中草原3號、公農(nóng)2號、敖漢苜蓿、420苜蓿的發(fā)芽率較高，顯著高于其他品種(p<0.05)。與恒溫(4 ℃)相比，變溫處理下的苜蓿種子發(fā)芽率明顯增高，表明交替變溫可促進種子發(fā)芽率，提高種子萌發(fā)率，縮短萌發(fā)時間。

注：不同小寫字母表差異達顯著水平(p>0.05)。下同。圖2 不同溫度下苜蓿種子發(fā)芽率的變化Fig.2 Changes in germination rate of alfalfa seeds at different temperatures

2.3 發(fā)芽指數(shù)

由圖3可知，供試苜蓿ck組(25 ℃)的發(fā)芽指數(shù)在44.39～49.22之間。與ck相比，變溫(18 ℃/25 ℃和4 ℃/18 ℃)處理的發(fā)芽指數(shù)分別下降35.06%～37.08%和58.65%～63.75%。同一變溫(4 ℃/18 ℃)下，品種賽迪、420、公農(nóng)2號和敖漢的發(fā)芽指數(shù)顯著高于其他品種(p<0.05)。與恒溫(4 ℃)相比，變溫處理下的苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)呈顯著增高。

圖3 不同溫度下苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)的變化Fig.3 Changes of germination index of seeds of alfalfa at different temperatures

2.4 簡化活力指數(shù)

各品種在4 ℃/18 ℃和18 ℃/25 ℃變溫處理下的簡化活力指數(shù)分別在14.27～17.70和17.54～19.74之間，與ck相比，種子在變溫下的簡化活力指數(shù)有所升高，說明變溫處理具有促進種子活力，增強發(fā)芽能力的作用。同一變溫4 ℃/18 ℃下，品種間簡化活力指數(shù)差異較大，草原3號和420苜蓿的簡化活力指數(shù)較高，顯著高于其他品種(p<0.05)。與恒溫(4 ℃)相比，變溫處理下的苜蓿種子簡化活力指數(shù)呈顯著增高(圖4)。

圖4 不同溫度下苜蓿種子簡化活力指數(shù)的變化Fig.4 Changes of simplified vigor index of alfalfa seeds at different temperatures

2.5 根 長

由圖5可知，與ck相比，變溫(18 ℃/25 ℃)處理下的根長有所增加，說明變溫對苜蓿種子胚根生長具有促進作用。4 ℃/18 ℃處理時根長在0.81～1.89 cm之間，其中420苜蓿的根長最長，而草原3號和龍牧801的根長較短，同一變溫下，秋眠性強的苜蓿胚根生長緩慢，這可能與品種自身的遺傳特性有關。

圖5 不同溫度下苜蓿種子根長的變化Fig.5 Changes in root length of alfalfa seeds at different temperatures

2.6 萌發(fā)期抗寒性綜合評價

主成分分析是將多項萌發(fā)指標轉(zhuǎn)化成幾個綜合指標，以彌補單一指標對抗寒性評價的不足。根據(jù)特征值>1，累積貢獻率≥85%的原則，本研究提取2個主成分，其中第一主成分(F1)特征值為2.105，貢獻率為52.6%，特征向量中數(shù)值較大的指標為根長；第二主成分(F2)特征值為1.405，貢獻率35.1%，對應的特征向量主要表現(xiàn)在發(fā)芽率。對應數(shù)值較大的指標是簡化活力指數(shù)。以上2個主成分累計貢獻率達87.7%。由主成分分析將4個單一指標轉(zhuǎn)化為2個綜合指標(F1、F2)，并且基本包含了所測指標的絕大部分信息(表1)。通過隸屬函數(shù)法對不同品種的簡化活力指數(shù)、根長和發(fā)芽率進行綜合評價(表2)，最終評價得出各品種的抗寒強弱順序依次為：龍牧801、草原3號、公農(nóng)2號、皇后、敖漢、420、賽迪。

表1 主成分分析Table 1 Principal component analysis

表2 不同苜蓿萌發(fā)測試指標隸屬函數(shù)值及綜合評價Table 2 The subordinate function value and comprehensive evaluation of different alfalfa germination indexes

3 討 論

苜蓿種子在萌發(fā)過程中會受到種子內(nèi)因(種子自身生理活動)和外因(水分、氧氣、溫度)制約，其中溫度條件適宜是植物種子萌發(fā)及生長發(fā)育的主要限制因子之一[12]，原因在于適宜的溫度可有效提高種子吸脹速率，加快種子新陳代謝，溫度過低不利于種子萌發(fā)。交替變溫環(huán)境也會影響苜蓿種子萌發(fā)節(jié)律，與恒溫(4 ℃)處理相比，變溫4 ℃/18 ℃處理第2天種子開始萌發(fā)，第3～4天達到高峰期，整體提前3～4 d，這可能與變溫引起種皮脹縮(促進吸水及氣體交換)增強呼吸作用有關，故冷交替變溫條件較持續(xù)低溫更有利于種子萌發(fā)[13]。發(fā)芽率可直觀表現(xiàn)苜蓿種子的發(fā)芽情況，發(fā)芽指數(shù)是種子的活力指標，即發(fā)芽指數(shù)越高，種子活力越高。相關研究表明，不同苜蓿品種的種子萌發(fā)溫度也存在顯著差異[14]。本研究中，4 ℃時僅龍牧801的發(fā)芽率大于50%，其他品種均低于50%，至于龍牧801苜蓿在低溫條件下種子萌發(fā)能力較強的原因，可能與品種自身的遺傳特性有關，有些品種較耐低溫[15]。苜蓿種子發(fā)芽質(zhì)量和活力有時也可用簡化活力指數(shù)衡量，簡化活力指數(shù)隨溫度降低整體呈下降趨勢。與18 ℃/25 ℃變溫相比，4 ℃/18 ℃變溫條件下苜蓿種子發(fā)芽率和簡化活力指數(shù)均明顯降低，這與Mcelgunn[16]和彭運翔等[17]的研究結(jié)果趨于一致，說明冷交替變溫會使苜蓿種子萌發(fā)率和活力下降，發(fā)芽能力減弱。

有效篩選耐寒種質(zhì)材料，需選擇適宜的指標對品種的耐低溫萌發(fā)能力進行評價。郭郁頻等[18]運用隸屬函數(shù)法對5種三葉草耐低溫萌發(fā)能力進行綜合評價，篩選得出荷蘭白、VNS和瑞文德三葉草種子表現(xiàn)出較強的耐低溫萌發(fā)能力。而侯龍魚等[19]則利用主成分分析法對6個苜蓿品種耐低溫萌發(fā)能力進行評價，篩選出的中苜1號和中科2號品種耐低溫萌發(fā)能力較強。本研究則主要通過隸屬函數(shù)評價苜蓿種子萌發(fā)期耐寒性，初步判定龍牧801、草原3號、公農(nóng)2號苜蓿的耐寒能力強于其他品種。

4 結(jié) 論

低溫下，所有苜蓿材料種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、簡化活力指數(shù)和根長均呈下降趨勢，萌發(fā)高峰期隨溫度降低而后延。由主成分確定品種的簡化活力指數(shù)、根長和發(fā)芽率可以作為評價指標鑒定苜蓿萌發(fā)期的抗寒性。各品種的抗寒強弱順序依次為：龍牧801、草原3號、公農(nóng)2號、皇后、敖漢、420、賽迪。