李 鵬， 熊 雪， 張貴合， 陶文廣， 向 準(zhǔn)， 王 晶， 劉忠玄， 黃 靜

(1.貴州省生物研究所， 貴陽 550009； 2.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院， 貴陽 551400)

冬小包腳菇(VolvariellabrumalisHe sp. nav.)是一種貴州特有野生可食用大型真菌，最早由貴州省生物研究所何紹昌先生于1987年正式命名并發(fā)表[1]，俗稱谷樁菌、低溫草菇。該菌隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，蘑菇綱(Agaricomycetes)，蘑菇目(Agaricales)，光柄菇科(Pluteaceae)，包腳菇屬(Volvariella)[1-2]。冬小包腳菇營養(yǎng)成分豐富，口感上佳，富含多種氨基酸及無機(jī)元素[3]，其口感及外觀和同屬著名品種草菇(Volariellavolvacea)較為相似，但該菇子實(shí)體形成溫度為4～14 ℃，與喜高溫高濕環(huán)境的草菇有明顯區(qū)別。草菇是包腳菇屬最著名的食用菌，廣受人們喜愛[4]，其味道鮮美，富含粗纖維、氨基酸、維生素和特異性蛋白等[5-6]，素有“中國蘑菇”之稱，在食用菌市場上占有較為優(yōu)勢的地位。但草菇喜高溫且子實(shí)體不耐低溫儲(chǔ)存的特性嚴(yán)重限制了其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[7-11]。而冬小包腳菇的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了該屬可食用種類均為中高溫型的缺陷，對其種群理論、生物遺傳學(xué)理論研究等方面具有重要的科學(xué)意義，且對彌補(bǔ)草菇冬季市場具有重要意義。但分離和培養(yǎng)難度大等原因，雖有許多學(xué)者對其開展研究，但目前冬小包腳菇除營養(yǎng)成分[3]、野外生境[12-13]、形態(tài)特征[14]等方面外，在其他基礎(chǔ)研究、品種選育等方面仍處于空白狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)按照基礎(chǔ)生物學(xué)的方法對分離得到的冬小包腳菇菌株開展?fàn)I養(yǎng)條件研究，旨在摸索菌絲生長規(guī)律，為冬小包腳菇優(yōu)質(zhì)母種的產(chǎn)業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，助推貴州特色冬小包腳菇產(chǎn)業(yè)規(guī)?；l(fā)展，填補(bǔ)我國草菇的冬季市場。

圖1 野生冬小包腳菇子實(shí)體Fig.1 Wild Volvariella brumalis fruiting bodies

1 材料與方法

1.1 材 料

2019年12月于貴州省龍里縣[1]采集而得的冬小包腳菇野生子實(shí)體，經(jīng)組織分離培養(yǎng)后得到供試菌株，現(xiàn)保存于貴州省生物研究所。

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，稻草40 g(剪成2～3 cm段，沸水煮30 min)，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，蛋白胨2 g，維生素B110 mg，瓊脂粉20 g，去離子水1 000 mL，pH自然。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化

制備冬小包腳菇活化培養(yǎng)基平板20個(gè)，無菌環(huán)境下將試管母種接種到冬小包腳菇加富PDA培養(yǎng)基上(接種至平板的中心位置)，15 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d(待菌落生長至平板直徑的1/2～2/3之間)。

1.2.2ITS序列分析

采取購買的生工生物工程(上海)股份有限公司Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離純化真菌基因組DNA，提取之后的DNA選用真菌通用引物(ITS 1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS 4：TCCTCCGCTTATTGATATGC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用25 μL的PCR反應(yīng)體系：Template(基因組20～50 ng/μL)0.5 μL；10×Buffer(和Mg2+)；dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL；Taq0.2 μL；F(10 μmol/L)0.5 μL；R(10 μmol/L)0.5 μL；加雙蒸水至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性15 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸1 min)，72 ℃延伸5 min，4 ℃終止反應(yīng)保存。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序并完成序列拼接后登陸GenBank上傳所測序列，得到GenBank接收號，并通過BLAST對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，下載最相近菌株的ITS rDNA序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3溫度篩選試驗(yàn)

將菌絲長至平板2/3的活化平板，用5 mm的打孔器將菌落打成圓片，然后接種于活化培養(yǎng)基上，將接種好的平板分別放置在10 ℃、15 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃、25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復(fù)5次，觀察菌絲生長情況，同時(shí)記錄菌絲萌發(fā)時(shí)間。菌絲生長速度測定采用“十”字交叉法，從菌絲萌發(fā)開始，每3天測量一次。菌絲鋪滿平板時(shí)，觀察記錄菌落的菌絲形態(tài)、色澤、菌落形狀、菌絲長勢和邊緣特征等，用“+”“-”表菌絲的長勢，“+”越多表菌絲生長得越好、越健壯、均勻，“-”表菌絲不生長。

1.2.4酸堿度篩選試驗(yàn)

以1 mol/L HCl和1 mol/L的NaOH，按不同比例配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別設(shè)pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共10個(gè)處理。將菌絲長至平板2/3的活化平板，用5 mm的打孔器將菌落打成圓片，然后接種于不同pH值平板的中心位置，每處理重復(fù)5次，置15 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察菌絲生長情況。選擇菌落最大的條件作為最適pH值。

1.2.5碳源優(yōu)化試驗(yàn)

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照(ck)，分別以等量蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、甘露醇、可溶性淀粉、糊精及麥芽提取物代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，作為不同碳源培養(yǎng)基，將菌絲長至平板2/3的活化平板，用5 mm的打孔器將菌落打成圓片，然后接種于不同碳源培養(yǎng)基上，每處理重復(fù)5次，置15 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察菌絲生長情況。

1.2.6氮源優(yōu)化試驗(yàn)

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照(ck)，分別以等量的硝酸鉀、硫酸銨、尿素、牛肉膏、豆粕粉、硝酸銨、酵母浸粉、酵母膏和麥麩分別代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源蛋白胨，后續(xù)操作同1.2.5。

1.2.7不同碳氮比試驗(yàn)

在固定溫度15 ℃和pH自然的培養(yǎng)基中調(diào)整碳氮比進(jìn)行試驗(yàn)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源濃度為2%，添加不同重量蛋白胨(蛋白胨含碳量忽略不計(jì))，配成碳氮比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1和100∶1的培養(yǎng)基，觀察不同碳氮比對冬小包腳菇菌絲生長的影響。每個(gè)處理5次重復(fù)，置于15 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.8最佳碳氮源濃度組合

選擇最優(yōu)的培養(yǎng)溫度和pH值，選取的2個(gè)適宜碳源、氮源作為試驗(yàn)的四因素，采用 L9(34) 正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，以不含碳源、氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，組合成供試培養(yǎng)基(表1)。每組5個(gè)重復(fù)，后續(xù)操作同1.2.5。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Table of factor level by orthogonal test

1.2.9最佳碳氮源濃度組合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)碳氮源正交試驗(yàn)得到該水平最優(yōu)組合培養(yǎng)基，若組合不在實(shí)驗(yàn)處理中，則進(jìn)行驗(yàn)證培養(yǎng)，操作同1.2.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取及ITS序列分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測定，結(jié)果顯，供試冬小包腳菇菌株rDNA ITS區(qū)段長度為640 bp，上傳GenBank得到登錄號為OM 108495，經(jīng)Blast搜索，擊中結(jié)果均為Volvopluteusgloiocephalus和Volvariellagloiocephala，下載相似序列20條，并結(jié)合Volvopluteus、Volvariella及光柄菇科下光柄菇屬(Pluteus)常見種序列，共同構(gòu)建冬小包腳菇系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。由圖2可知，該系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系若分為兩大類群，則Volvopluteus、Volvariella在同一類群，Pluteus單獨(dú)為一個(gè)類群。若分為三大類群，則Volvopluteus、Volvariella和Pluteus各為一個(gè)類群，且冬小包腳菇屬于Volvopluteus類群，同Volvopluteusgloiocephalu親緣性近；同著名草菇栽培種(Volvariellavolvacea)親緣性較遠(yuǎn)，存在本源差異。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的冬小包腳菇系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.2 Phylogenetic tree of Volvariella brumalis constructed based on ITS sequence.

2.2 不同溫度對冬小包腳菇菌絲生長的影響

如表2所，在所選溫度范圍內(nèi)，冬小包腳菇菌絲萌發(fā)、生長速度和菌落長勢均隨溫度變化差異明顯。在低溫(5 ℃)、高溫(30 ℃)條件下冬小包腳菇菌絲均不能正常萌發(fā)生長，10 ℃培養(yǎng)下菌絲萌發(fā)需耗時(shí)16 d，其余溫度條件下僅需2 d，說明溫度過高或過低均會(huì)對冬小包腳菇菌絲萌發(fā)產(chǎn)生明顯抑制作用。在10～15 ℃條件下，冬小包腳菇菌落均呈絨毛狀白色圓形菌落，有氣生菌絲，發(fā)達(dá)程度不一，隨溫度升高菌落長勢整體呈現(xiàn)“弱—旺—弱”的趨勢，其中15 ℃條件下培養(yǎng)菌落長勢最好，18 ℃和20 ℃培養(yǎng)下次之。菌絲日均生長速度也隨溫度升高先增后減，18 ℃培養(yǎng)條件下菌絲日均生長速度最快，達(dá)1.03 mm/d，15 ℃和20 ℃培養(yǎng)條件下次之，分別為0.95 mm/d和0.90 mm/d。綜上說明冬小包腳菇菌絲生長適宜溫度條件范圍在15～20 ℃之間，最佳適宜溫度為15 ℃。

表2 不同溫度對冬小包腳菇菌絲生長的影響Table 2 Effects of different temperatures on Volvariella brumalis mycelium

2.3 不同酸堿度對冬小包腳菇菌絲生長的影響

如表3所，冬小包腳菇菌絲萌發(fā)和生長受培養(yǎng)基酸堿度影響明顯，該菌在過酸和過堿條件下均不能正常萌發(fā)和生長。pH<5或pH>10時(shí)，冬小包腳菇菌絲均不能萌發(fā)生長，其菌絲萌發(fā)適宜生長酸堿度范圍在6～9之間，且菌絲萌發(fā)后隨著酸堿度的增加，菌絲日均生長速度呈先增后減的拋物線型變化。在pH=8條件下菌絲生長最快，日均生長速度達(dá)3.75 mm/d，其次為pH=9和pH=7條件，日均生長速度分別為2.74 mm/d和2.26 mm/d，其菌落長勢表現(xiàn)同生長速度趨勢一致。綜上可知，冬小包腳菇菌絲對酸堿度變化反應(yīng)敏感，過酸過堿均會(huì)抑制其萌發(fā)和生長，其菌絲生長喜弱堿性環(huán)境，適宜酸堿度范圍為7～9，其中8為最佳。

表3 不同酸堿度對冬小包腳菇菌絲生長的影響Table 3 Effects of different pH conditions on Volvariella brumalis mycelium

2.4 不同碳源培養(yǎng)基對冬小包腳菇菌絲生長的影響

如表4所，在9種供試碳源培養(yǎng)基條件下，冬小包腳菇菌絲萌發(fā)時(shí)間均為2 d，且均呈現(xiàn)出絨毛狀灰白色圓形菌落，有氣生菌絲著生，但表現(xiàn)差異較大，菌落長勢差異明顯。其中在蔗糖培養(yǎng)基中長勢最佳，乳糖、糊精和麥芽提取物培養(yǎng)下菌落長勢最差。各種培養(yǎng)基條件下的冬小包腳菇菌絲日均生長速度在p<0.05水平上有差異。其中碳源為甘露醇培養(yǎng)條件下菌絲顯著快于其他培養(yǎng)基，日均生長速度為2.59 mm/d。其次為蔗糖和葡萄糖，日均生長速度分別為2.27 mm/d和2.06 mm/d。結(jié)合菌落長勢可知，冬小包腳菇最適碳源為蔗糖，其次為甘露醇和葡萄糖。

表4 不同碳源培養(yǎng)基對冬小包腳菇菌絲生長的影響Table 4 Effects of different carbon source media on the growth of Volvariella brumalis mycelium

2.5 不同氮源培養(yǎng)基對冬小包腳菇菌絲生長的影響

由表5可知，冬小包腳菇在10種供試氮源培養(yǎng)基上均能萌發(fā)生長，且表現(xiàn)為著生有一定量氣生菌絲的絨毛狀灰白色圓形菌落，但各處理下菌落長勢和日均生長速度差異明顯。其中氮源為尿素、牛肉膏和麥麩培養(yǎng)下長勢較佳，酵母膏和酵母浸粉次之，氮源為硫酸銨和硝酸銨培養(yǎng)時(shí)，菌絲長勢最差，說明有機(jī)氮較無機(jī)氮更有利于冬小包腳菇菌絲生長。冬小包腳菇在麥麩培養(yǎng)基上菌絲生長速度顯著快于其他培養(yǎng)基(p<0.05)，日均生長速度達(dá)2.65 mm/d。其次為牛肉膏、硝酸銨和尿素，其日均生長速度分別為2.24 mm/d、2.20 mm/d和2.01 mm/d。因此，結(jié)合菌落長勢可知，冬小包腳菇菌絲生長最佳氮源為麥麩，其次為牛肉膏和尿素。

表5 不同氮源培養(yǎng)基對冬小包腳菇菌絲生長的影響Table 5 Effects of different nitrogen source media on the growth of Volvariella brumalis mycelium

2.6 不同碳氮比培養(yǎng)基對冬小包腳菇菌絲生長的影響

如表6可知，在不同碳氮比實(shí)驗(yàn)中，冬小包腳菇菌絲萌發(fā)情況不受碳氮比的影響，且菌落長勢差距不大，均表現(xiàn)為絨毛狀白色圓形菌落，并著生有一定量氣生菌絲，但在碳氮比為20∶1、30∶1和40∶1的條件下時(shí)，菌落氣生菌絲明顯較其他碳氮比多且發(fā)達(dá)，整體長勢較佳。結(jié)合圖3可知，冬小包腳菇菌絲日均生長速度整體差距不大，其中碳氮比為70∶1時(shí)，生長速度最快，達(dá)1.84 mm/d，碳氮比為50∶1時(shí)，生長速度最慢，為1.35 mm/d。綜合菌落長勢可知，冬小包腳菇日均生長速度適宜碳氮比在20∶1～40∶1之間，最佳碳氮比為30∶1。

圖3 不同碳氮比培養(yǎng)基對冬小包腳菇菌絲生長速度的影響Fig.3 The effect of different C/N ratio media on the growth of Volvariella brumalis mycelium

表6 不同碳氮比培養(yǎng)基對冬小包腳菇菌絲生長的影響Table 6 Effects of different C/N ratio media on the growth of Volvariella brumalis mycelium

2.7 最佳碳氮源濃度組合

以2.4、2.5中所得冬小包腳菇適宜碳源、氮源為依據(jù)，選擇適宜碳源蔗糖、葡萄糖和適宜氮源麥麩、牛肉膏建立 L9(34) 正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)(表7)，各處理培養(yǎng)下冬小包腳菇菌株萌發(fā)時(shí)間無差異，且均為絨毛狀整齊灰白色圓形菌落，并著生大量氣生菌絲，菌絲健壯、發(fā)達(dá)且濃密度高。其中V 2處理下冬小包腳菇菌絲顯著高于其他處理，日均生長速度為4.28 mm/d，其次為V 1和V 3，日均生長速度分別為3.52 mm/d和2.96 mm/d。綜上可知，在所有處理中，冬小包腳菇菌絲生長最佳碳氮源組合為V 2(A1B2C2D2)，日均生長速度達(dá)4.28 mm/d。

表7 不同濃度碳氮源對冬小包腳菇菌絲體生長的影響Table 7 Effects of different concentrations of carbon and nitrogen sources on the growth of Volvariella brumalis mycelium

由表8可知，4個(gè)因素R值從大到小為RA、RC、RD、RB，表明各因素對冬小包腳菇菌絲生長速度的影響為A(蔗糖)>C(麥麩)>D(牛肉膏)>B(葡萄糖)。此外，在4種影響因素中，因素A對菌絲生長速度有極顯著影響，因素C對菌絲生長速度影響顯著(表9)，因素B、D影響不顯著，但因素D影響高于因素B(pDC(麥麩)>D(牛肉膏)>B(葡萄糖)，其結(jié)果同表8一致，且起關(guān)鍵作用的是因素A和因素C。

表8 碳氮源對冬小包腳菇菌絲體生長的正交分析Table 8 Orthogonal analysis of carbon and nitrogen sources on the growth of Volvariella brumalis mycelium

說明碳源蔗糖和氮源麥麩是冬小包腳菇菌絲培養(yǎng)階段的關(guān)鍵因素，其中主要因素為碳源蔗糖，次要因素為氮源麥麩。

按照各因素的優(yōu)水平，得到A1B1C2D2水平組合為本試驗(yàn)的最優(yōu)水平組合，結(jié)合表1可知，該組合為蔗糖10.0 g，葡萄糖5.0 g，麥麩2.0 g，牛肉膏2.0 g。但該組合并不在試驗(yàn)處理中，通過后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證得到冬小包腳菇日均生長速度為4.35 mm/d，比上述正交試驗(yàn)處理所得最佳組合V 2(A1B2C2D2)高0.07 mm/d。

表9 冬小包腳菇正交試驗(yàn)方差分析Table 9 Variance analysis of Volvariella brumalis by orthogonal test

3 討 論

冬小包腳菇是一種獨(dú)具特色的珍稀食用菌，在外形、口感上同著名栽培種草菇較為相似，但草菇出菇嗜高溫高濕，子實(shí)體貯存濕度一般不低于15 ℃，且儲(chǔ)存時(shí)間非常短，而冬小包腳菇偏好低溫出菇，子實(shí)體可耐低溫保存，這樣的先天條件決定了冬小包腳菇重要的研究及市場價(jià)值。本研究對分離得到的冬小包腳菇菌絲體進(jìn)行了分子鑒定，初步研究了其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)冬小包腳菇屬于Volvopluteus類群，且同Volvopluteusgloiocephalus、Volvariellagloiocephala親緣性最近；同著名草菇栽培種(Volvariellavolvacea)親緣性較遠(yuǎn)，存在本源差異。這同何紹昌等[1]將冬小包腳菇命名在Volvariella類群下并不沖突，因?yàn)閂olvopluteus是2011年由Justo等從傳統(tǒng)Volvariella類群中分出來的新類群，而冬小包腳菇早在1987年已被命名。而同一分支下Volvopluteusgloiocephalus、Volvariellagloiocephala也被Justo等[15]歸屬在Volvopluteus類群，并統(tǒng)一名稱為Volvopluteusgloiocephalus[17]。冬小包腳菇同Volvopluteusgloiocephalus雖具有較近的親緣關(guān)系，但具體的種間關(guān)系需要進(jìn)一步的研究。

冬小包腳菇菌絲體基礎(chǔ)生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，冬小包腳菇菌絲生長適宜溫度范圍在15～20 ℃之間，最佳生長溫度為15 ℃，且當(dāng)環(huán)境溫度低于5 ℃或高于25 ℃時(shí)無法萌發(fā)，但菌絲體不會(huì)死亡。這同草菇適宜35 ℃環(huán)境，且在低于20 ℃或高于40 ℃環(huán)境下不生長或生長不良的習(xí)性具有較大差異[18]。此外冬小包腳菇菌絲體對環(huán)境酸堿度反應(yīng)敏感，且偏好弱堿性環(huán)境，在pH<5和pH>10的環(huán)境下，菌絲體均無法正常萌發(fā)生長，適宜酸堿度范圍在7～9之間，最適為8。這同草菇對酸堿度的反應(yīng)表現(xiàn)較為一致，但草菇對酸堿度的適應(yīng)能力更強(qiáng)于冬小包腳菇。歷年來對草菇的持續(xù)研究中，均發(fā)現(xiàn)草菇對酸堿度的適宜范圍較廣，在pH=4～11范圍內(nèi)均能生長，更偏愛堿性環(huán)境[18-21]。而在適宜碳氮源選擇上，冬小包腳菇最佳碳源為蔗糖，其次為甘露醇和葡萄糖。最佳氮源為麥麩，其次為牛肉膏和尿素，且對冬小包腳菇進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，影響冬小包腳菇菌絲生長占主要因素的是碳源蔗糖。在荊蓉和郭成金[19]對銀絲草菇培養(yǎng)條件研究中也發(fā)現(xiàn)，銀絲草菇對碳源蔗糖和葡萄糖有較好的吸收能力，而對氮源牛肉膏和麥麩的吸收力度則沒有酵母粉和蛋白胨高。伍國明和李梅[20]對草菇不同菌株研究中發(fā)現(xiàn)，草菇對碳源蔗糖的吸收更強(qiáng)，且氮源表現(xiàn)不一，但整體而言同銀絲草菇一樣，草菇對酵母粉、蛋白胨等復(fù)雜氮源均能較好地吸收[20-22]。這說明盡管冬小包腳菇和草菇菌絲適宜生長溫度范圍差異較大，但相近的酸堿度和碳源選擇，也是冬小包腳菇野生資源開發(fā)的一個(gè)突破口，這對冬小包腳菇栽培基質(zhì)配方的摸索具有指導(dǎo)意義。試驗(yàn)最終得到冬小包腳菇菌絲生長最優(yōu)培養(yǎng)條件為蔗糖10.0 g，葡萄糖5.0 g，麥麩2.0 g，牛肉膏2.0 g，KH2PO41 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，酸堿度調(diào)至8，接種后置于15 ℃條件下培養(yǎng)。但盡管在最適宜的條件下，冬小包腳菇在平板上的平均生長速度僅保持在4.35 mm/d，相對草菇培養(yǎng)生長速度(5.10 cm/d)慢了10倍以上[19]。母種生長緩慢是冬小包腳菇培養(yǎng)及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的難關(guān)，這將是下一步研究的重點(diǎn)之一。