如馬南木·尼合買提， 聶必林， 熱依漢古麗·夏迪， 巫利梅， 呂海英

(1.旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830054；3.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 烏魯木齊 830054)

種子休眠是植物具有的一種復(fù)雜的機(jī)制，是種子萌發(fā)和植物生長發(fā)育的重要保障[1-3]。種子休眠不僅在高等植物個(gè)體發(fā)育中起重要作用，也和種群的生存及發(fā)展息息相關(guān)[4-5]。對于植物而言，種子休眠是一種有利的生態(tài)適應(yīng)特征，它會推遲種子的發(fā)芽，直到季節(jié)和生長條件對幼苗的生長有利時(shí)才會打破休眠[6-8]。但是對種子生產(chǎn)、人工擴(kuò)散和栽培帶來許多不便，影響該植物種群的更新速度[9-11]。內(nèi)源抑制物質(zhì)是種子休眠的主要原因之一[12]，種子的不同部位可能存在不同的內(nèi)源抑制物質(zhì)，這些抑制物通過不同途徑阻礙種子生理活動或某個(gè)代謝環(huán)節(jié)，從而降低種子的發(fā)芽率[13-15]。種子通過分解這些化學(xué)物質(zhì)來解除抑制作用進(jìn)而萌發(fā)[16-17]。隨著國內(nèi)外對內(nèi)源抑制物研究的深入，各式各樣的植物內(nèi)源抑制物不斷被發(fā)現(xiàn)。朱銘瑋等[18]對油用牡丹‘鳳丹’種子內(nèi)源抑制物研究發(fā)現(xiàn)，‘鳳丹’種皮和種胚中含有抑制作用較強(qiáng)的內(nèi)源抑制物，不同部位不同提取相對白菜種子發(fā)芽的影響不同。鄒雨婷等[19]對綠山楂內(nèi)源抑制物質(zhì)成分的分析表明，綠山楂種子浸提液中的乙醚相和甲醇相對白菜種子發(fā)芽的抑制作用最強(qiáng)，其內(nèi)源抑制物以酚類、酯類、有機(jī)酸類等為主。由此可見，不同種類植物，抑制物質(zhì)在種子內(nèi)的存在部位以及所含抑制物類型不同，其解除方法也不同[20-21]。因此，通過研究植物種子中內(nèi)源抑制物質(zhì)的類型、功能、活性和作用機(jī)理，打破種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)，不僅是解決植物人工繁殖和擴(kuò)大資源問題的關(guān)鍵技術(shù)[22]，而且在農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)中也具有重要意義[23]。

準(zhǔn)噶爾山楂(Crataegussongarica)為薔薇科山楂屬光核組唯一一種植物，也是分布于新疆伊犁部分山區(qū)的野山楂資源之一[24]，具有很強(qiáng)的抗旱和抗寒特性，可作為觀賞樹種以及栽培山楂的砧木及育種材料，利用價(jià)值高[25]。同時(shí)準(zhǔn)噶爾山楂也是珍稀的天然花色苷類色素資源之一[26]，而且作為天山野果林的組成樹種之一，是天山水源涵養(yǎng)林的一部分[27]，對防止水土流失、改善生態(tài)環(huán)境、維持其原生性具有重要現(xiàn)實(shí)意義[28]。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在自然環(huán)境中準(zhǔn)噶爾山楂幼苗數(shù)量稀少，海拔在1 100～1 600 m范圍內(nèi)，實(shí)生苗僅為0.001 9株/m2。張俠等[29]研究表明，準(zhǔn)噶爾山楂種子具有深度休眠特性，導(dǎo)致出苗率低。此外，近年來由于環(huán)境變化和人為因素的影響，已導(dǎo)致準(zhǔn)噶爾山楂種群的棲息地自然資源萎縮、病害嚴(yán)重、群落退化和嚴(yán)重破壞[30]。因此，在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究以準(zhǔn)噶爾山楂種子為材料，通過系統(tǒng)溶劑法分析準(zhǔn)噶爾山楂種子不同部位的浸提液對白菜種子的化感作用，明確其內(nèi)源抑制物的活性及分布，旨在為準(zhǔn)噶爾山楂種子休眠破除技術(shù)及休眠機(jī)理的深入研究提供參考，為該類群植物的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的準(zhǔn)噶爾山楂采自新疆霍城縣大西溝，剝?nèi)ス猓磧?，陰干?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)所用白菜品種為四季小白菜，種子純度95%，凈度98%，發(fā)芽率85%，含水量8%。

1.2 研究方法

1.2.1千粒重測定

隨機(jī)抽取100粒山楂籽，用千分之一電子天平稱量并記錄，重復(fù)8次，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差和千粒重。

1.2.2準(zhǔn)噶爾山楂種子不同部位甲醇浸提液的制備

對試驗(yàn)的山楂種子進(jìn)行解剖，并將其分為三部分(種殼、種皮和種胚)。每一部分用破碎機(jī)破碎，并在33～35 ℃下干燥至恒重。取準(zhǔn)噶爾山楂不同部位粉末40 g，分別置于250 mL錐形瓶中，加入5倍體積的80%甲醇，混勻，置于4 ℃冰箱中恒溫提取。期間多次取出搖勻，充分提取，24 h后過濾，重復(fù)提取3次，將所得提取液混合，減壓濃縮后定容至250 mL。

1.2.3準(zhǔn)噶爾山楂種子不同部位內(nèi)源抑制物質(zhì)的初步分離

根據(jù)圖1所的過程，通過系統(tǒng)溶劑法[31]分離種子各部分的提取物。分離出的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相提取物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)和濃縮。當(dāng)定容達(dá)到250 mL后，將其置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4準(zhǔn)噶爾山楂種子不同提取相的活性測定

以白菜種子為材料，測定上述提取相的活性：白菜種子在45 ℃水浴中提前浸泡10 min，并在此期間持續(xù)攪拌。在12 cm培養(yǎng)皿中放置一層濾紙，分別加入各相提取液3 mL，取50粒白菜種子均勻放置于濾紙中，濕度保持在85%以上，在(23±2)℃恒溫暗培養(yǎng)，并加入與對照組(ck)相同體積的蒸餾水，每組重復(fù)4次。48 h后，計(jì)算白菜種子的發(fā)芽率(發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為幼根伸長長度大于種子長度)。72 h后，測定幼苗高度和根長、干重和鮮重，并檢驗(yàn)差異顯著性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步計(jì)算種子的發(fā)芽率(GP)、發(fā)芽指數(shù)(GI)、活力指數(shù)(VI)、平均發(fā)芽時(shí)間(AGT)和相對發(fā)芽率(RGP)。各指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

GP(%)=(Ni/N)×100%，Ni為第i天發(fā)芽數(shù)；N為種子總數(shù)；

RGP(%)=(處理發(fā)芽率/對照發(fā)芽率)×100%；

抑制活性=(1-處理組/對照組)×100%；

GI=∑(Gt/Dt)，式中Gt為第t日發(fā)芽種子數(shù)，Dt為對應(yīng)Gt的發(fā)芽天數(shù)；

VI=S×GI，式中S為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)胚根平均鮮重(g)；

AGT=∑(dn)/∑n，式中d表從播種之日起到種子萌發(fā)所用天數(shù)，n表對應(yīng)各日新增發(fā)芽種子數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用Excel 2017軟件進(jìn)行處理和繪圖，并用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析和多重比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表。

圖1 準(zhǔn)噶爾山楂種子內(nèi)源物質(zhì)的初步分離流程Fig.1 Preliminary separation process of endogenous substances in C.songarica seeds

2 結(jié)果與分析

2.1 種子千粒重的測定結(jié)果與分析

種子的千粒重為確定種子的大小和飽滿度提供重要的參考值，種子的質(zhì)量也可以通過千粒重來測試[32]。本試驗(yàn)中，準(zhǔn)噶爾山楂種子的千粒重為112.769 g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.001 85，變異系數(shù)為14.25%。變異系數(shù)較高，這可能是準(zhǔn)噶爾山楂種子采集于不同海拔高度所致。

2.2 甲醇浸提液各提取相對白菜種子發(fā)芽率的影響

由圖2可見，準(zhǔn)噶爾山楂種子不同部位的浸提液對白菜種子發(fā)芽率的抑制效果不同。種殼的乙酸乙酯相對白菜種子發(fā)芽率具有明顯的抑制作用，并與ck以及其他提取相均差異極顯著(p<0.01)，處理后的白菜種子幾乎不能發(fā)芽，發(fā)芽率與ck相比降低了95%，抑制活性達(dá)到了96.94%，且顯著高于種皮和種胚的同相(p<0.01)。種殼的其他提取相以及種皮、種胚的各提取相的發(fā)芽率與ck差異均不顯著(p>0.05)。由此可以看出，影響白菜種子發(fā)芽的抑制物質(zhì)主要存在于種殼的乙酸乙酯相中。

注：不同大寫字母表同一部位提取不同相間差異顯著(p<0.01)；不同小寫字母表同一部位不同提取相間差異顯著(p<0.05)。圖2 甲醇浸提液各提取相對白菜種子發(fā)芽率的影響Fig.2 Effects of methanol extracts on germination rate of cabbage seeds

2.3 甲醇浸提液各提取相對白菜種子GI和VI的影響

種子的GI、VI可以用來衡量該種植物在一定條件下的發(fā)芽能力和活力，能夠很好地反映環(huán)境對種子發(fā)芽的影響程度[33]。由圖3可知，除了種胚的水相和種皮的石油醚相外，準(zhǔn)噶爾山楂種子各部位不同提取相對白菜種子發(fā)芽指數(shù)都有顯著的抑制作用(p<0.05)，但準(zhǔn)噶爾山楂種子部位不同、不同提取相，其對白菜種子發(fā)芽指數(shù)的抑制程度也有所不同。顯著性分析結(jié)果顯，種殼各提取相對白菜種子發(fā)芽指數(shù)的影響顯著高于種皮和種胚(p<0.05)；除了水相外，種皮和種胚各相的發(fā)芽指數(shù)差異不明顯(p>0.05)。其中，準(zhǔn)噶爾山楂種殼中的乙酸乙酯相對白菜種子發(fā)芽指數(shù)的影響最大，與ck以及其他各相的差異極顯著(p<0.01)。

圖3 甲醇浸提液各提取相對白菜種子GI的影響Fig.3 Effects of methanol extracts on germination index (GI) of cabbage seeds

由圖4可知：除了種殼的水相外，準(zhǔn)噶爾山楂種子各部位不同提取相對白菜種子活力指數(shù)都有顯著的抑制作用(p<0.05)，且有機(jī)相抑制作用均顯著大于水相(p<0.05)。其中，準(zhǔn)噶爾山楂種殼乙酸乙酯相的抑制作用最大(p<0.01)，活力指數(shù)從0.74降至0.03。說明影響白菜種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的抑制物存在于準(zhǔn)噶爾山楂種子各部位。

圖4 甲醇浸提液各提取相對白菜種子VI的影響Fig.4 Effects of methanol extracts on vigor index (VI) of cabbage seeds

2.4 甲醇浸提液各提取相對白菜種子平均發(fā)芽時(shí)間的影響

種子的發(fā)芽速度對育苗具有重要的參考價(jià)值，其值越小說明種子發(fā)芽能力越強(qiáng)，是種子萌發(fā)過程中極其重要的指標(biāo)[34]。從表1可見，準(zhǔn)噶爾山楂種皮和種胚各提取相對白菜種子平均發(fā)芽時(shí)間的影響較小，而種殼反之，其中種殼乙酸乙酯相的影響最大，與ck及同組其他各相的差異極顯著(p<0.01)，與ck比平均發(fā)芽時(shí)間從1.15 d延長至2.86 d。除種殼的乙酸乙酯相外，白菜種子平均發(fā)芽時(shí)間集中在1.10～1.49 d之間。以上結(jié)果表明，影響白菜種子平均發(fā)芽時(shí)間的內(nèi)源性抑制物主要集中在種殼浸提液中。

1 甲醇浸提液各提取相對白菜種子平均發(fā)芽時(shí)間的影響Table 1 Effects of methanol extracts of different phases on average germination time of cabbage seeds

2.5 甲醇浸提液各提取相對白菜幼苗生長的影響

從圖5可知，準(zhǔn)噶爾山楂種殼的乙酸乙酯相和水相以及種皮的水相對白菜幼苗根長的抑制作用不明顯，種胚的水相和石油醚相有促進(jìn)作用，其他相都有不同程度的抑制作用。其中，種殼的乙醚相、甲醇相和種皮的石油醚相、乙酸乙酯相、甲醇相以及種胚的乙醚相、甲醇相對白菜幼苗根長的抑制作用極顯著(p<0.01)。

圖5 甲醇浸提液各提取相對白菜幼苗根長的影響Fig.5 Effects of methanol extracts on root length of cabbage

由圖6可知，在種殼中，除了水相和乙酸乙酯相外，乙醚相、石油醚相和甲醇相對白菜苗高均有顯著的抑制作用(p<0.01)，抑制作用表現(xiàn)為乙醚相>石油醚相>甲醇相。種皮和種胚提取相中除了水相外，其余各相對白菜苗高有極顯著的抑制作用(p<0.01)，抑制作用表現(xiàn)為：乙醚相>石油醚相>乙酸乙酯相>甲醇相。以上結(jié)果表明，準(zhǔn)噶爾山楂種殼、種皮和種胚浸提液都對白菜苗高有不同程度的抑制作用。

圖6 甲醇浸提液各提取相對白菜苗高的影響Fig.6 Effects of methanol extracts on seedling height of cabbage

3 討論與結(jié)論

大多數(shù)休眠性種子的不同部位都存在內(nèi)源抑制物[35]，種類繁多，影響種子正常萌發(fā)和幼苗生長[36]。通常提取其成分并用非休眠的白菜種子做生物測定，以確定這些物質(zhì)是否存在[37]。本研究從內(nèi)源抑制物質(zhì)的角度分析準(zhǔn)噶爾山楂種子休眠的原因，結(jié)果表明，準(zhǔn)噶爾山楂種殼、種皮及種胚不同提取相對白菜種子萌發(fā)、苗高和根長均有抑制作用，而且不同部位浸提液不同有機(jī)相的抑制作用差異很明顯，有時(shí)還呈現(xiàn)促進(jìn)生長作用。

楊曉玲等[37]通過比較4種山楂種子抑制物質(zhì)對白菜種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)4種山楂種子各部位的乙醚相、乙酸乙酯相及甲醇相對白菜種子萌發(fā)均有較強(qiáng)的抑制作用，其中內(nèi)果皮的抑制活性最強(qiáng)，其次是種皮和種胚；廖源林等[11]通過研究野鴉椿種殼和種胚的內(nèi)源抑制物，發(fā)現(xiàn)種殼的抑制作用小于種胚，白菜種子發(fā)芽率隨著種殼和種胚浸提液濃度的增加而持續(xù)降低，但幼苗的根長和苗高表現(xiàn)為低促高抑；史鋒厚等[38]發(fā)現(xiàn)，南京紫椴種皮的抑制活性大于種皮和胚乳，種皮中含有的抑制物質(zhì)主要存在于乙醚相和甲醇相，而種子中的抑制物質(zhì)主要存在于甲醇相。本研究結(jié)果表明，準(zhǔn)噶爾山楂種子不同部位均含有抑制劑，不同部位內(nèi)源抑制劑的抑制程度不同：準(zhǔn)噶爾山楂種子中活性較強(qiáng)的內(nèi)源抑制劑主要分布在乙酸乙酯相、乙醚相和甲醇相，可能與它們的生理休眠密切相關(guān)，這與上述結(jié)果相似。而準(zhǔn)噶爾山楂種子同一部位的同一提取物對白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用不同。種皮對白菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和平均發(fā)芽時(shí)間的抑制作用大于種皮和種胚、種皮和種胚對白菜幼苗生長有較強(qiáng)的抑制作用。結(jié)果表明，準(zhǔn)噶爾山楂種子中不僅存在一種抑制劑，而且這些抑制劑對種子萌發(fā)和幼苗生長有不同的抑制作用。種殼對白菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及平均發(fā)芽時(shí)間的抑制作用大于種皮和種胚，而種皮和種胚對白菜苗生長的抑制作用較強(qiáng)。說明準(zhǔn)噶爾山楂種子中所含抑制物并非只有一種，且這些抑制物對種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用也不同。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)噶爾山楂種子不同部位的浸提液有機(jī)相對白菜種子和幼苗的抑制作用較大，而水相的抑制作用較小，種殼和種皮的水相以及種胚的水相和石油醚相等提取相有時(shí)對白菜種子和幼苗的生長具有促進(jìn)作用。原因可能是準(zhǔn)噶爾山楂種子甲醇浸提液的內(nèi)源性抑制物主要存在于有機(jī)相，而且不同部位所含有的內(nèi)源抑制物的種類或濃度不同，有些物質(zhì)在適宜的濃度時(shí)可能會出現(xiàn)促進(jìn)生長的作用。這與蔣玉婷等[10]、劉艷梅等[39]分別通過研究珍稀瀕危種斧形沙芥和桔梗種子內(nèi)源抑制物得到的結(jié)果是一致的。

內(nèi)源抑制物能不同程度地對種子萌發(fā)起到抑制作用[40-41]，不同內(nèi)源抑制物抑制作用及其解除方法也不同[42-43]。本研究以及以往的研究結(jié)果表明，準(zhǔn)噶爾山楂種子之所以在自然狀態(tài)下萌發(fā)率低，不僅是因?yàn)橥饨绛h(huán)境等因素，而且種子本身也含有內(nèi)源性抑制物。準(zhǔn)噶爾山楂種子不同部位的浸提液中可能含有不同的抑制性化學(xué)成分，這些成分能抑制種子萌發(fā)及幼苗生長，然而不同部位抑制物的抑制強(qiáng)度不同。因此，要確定準(zhǔn)噶爾山楂種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的成分、種類及含量，還需要進(jìn)一步深入研究。