潘 婷，李澤鋒，陳 凱，王 中，楊小年，朱麗穎，汪耀富，蒲文宣，曹培健，楊 軍，羅朝鵬*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

2. 湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，長沙市雨花區(qū)勞動中路386 號 410007

二氯喹啉酸屬于生長素類除草劑，主要用于防除稗草和闊葉類雜草，是我國稻田中常用的除草劑，年施用面積占稻作區(qū)面積的25%［1］。由于長期大量使用，近年來湖南、廣東和江西等煙稻輪作區(qū)煙草上陸續(xù)發(fā)生二氯喹啉酸藥害，給煙葉生產(chǎn)造成較大損失［2-3］。煙草二氯喹啉酸藥害產(chǎn)生的原因是前茬水稻使用二氯喹啉酸，造成土壤殘留，導(dǎo)致在后茬作物煙草上發(fā)生藥害。煙草二氯喹啉酸藥害已經(jīng)成為影響我國煙葉安全生產(chǎn)的主要問題。

作為一種生長素類除草劑，其作用機制與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及泛素/26S蛋白酶體途徑密切相關(guān)［4］，涉及生長素受體（Transport inhibitor response 1，TIR1/Auxin signaling f-box，AFB；TIR1/AFB）、共受體 Aux/IAA（Auxin/indole acetic acid）、SCF 型 E3 泛素化連接酶（S-PHASE Kinase associated protein 1-Cullin1-F-Box（SCF）-type E3 ligase）、生長素響應(yīng)因子（Auxin response factor，ARF）和生長素反應(yīng)基因等。其中SCF 型E3 泛素化連接酶是泛素/26S 蛋白酶體途徑的主要催化酶，TIR1/AFB和Aux/IAA是SCF 型E3 泛素化連接酶的組分。Aux/IAA 除了作為共受體外，還是ARF 的抑制子。ARF 是一類轉(zhuǎn)錄因子，能夠特異地與生長素響應(yīng)基因啟動子區(qū)域的生長素響應(yīng)元件（Auxin response element，AuxRE）結(jié)合，激活或抑制生長素響應(yīng)基因的表達［5］。生長素類除草劑的主要作用機制是：除草劑首先與TIR1/AFB 和Aux/IAA 結(jié)合，啟動生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，形成SCFTIR1/AFB-Aux/IAA-生長素復(fù)合體，進入泛素/26S蛋白酶體途徑，導(dǎo)致Aux/IAA發(fā)生泛素化降解，并解除Aux/IAA 對ARF 的抑制，進而激活生長素響應(yīng)基因的表達［6-8］。生長素響應(yīng)基因包括ACS和9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）等［9］。

ACS 是乙烯合成的關(guān)鍵酶，可催化形成乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）。研究發(fā)現(xiàn)，二氯喹啉酸通過誘導(dǎo)ACS 過量表達而產(chǎn)生大量乙烯，導(dǎo)致植物生長受阻甚至死亡，可能是生長素類除草劑防治雜草的作用機制［10］。二氯喹啉酸也用于防治禾本科雜草馬唐，但由于長期大量使用，馬唐已產(chǎn)生了抗藥性。使用二氯喹啉酸處理馬唐，敏感株系中乙烯含量提高3 倍，而抗性株系中的乙烯含量沒有顯著變化。使用ACS 抑制劑進行預(yù)處理，能使敏感株系在藥害發(fā)生時乙烯含量下降89%，藥害癥狀程度減輕37%［11］。在稗草中也得到相似的研究結(jié)果［12］。說明植物發(fā)生藥害時可通過降低自身乙烯含量，而減輕藥害癥狀，降低藥害損失。目前已經(jīng)完成ACS 基因家族鑒定的植物有擬南芥［13］、黃瓜［14］和蘋果［15］等，而煙草ACS 基因家族的系統(tǒng)鑒定與分析尚未見報道。為此，對普通煙草品種紅花大金元ACS 基因家族進行了鑒定，并對這些基因在二氯喹啉酸脅迫條件下的表達模式進行了分析，以明確煙草二氯喹啉酸藥害的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

以5 葉期普通煙草品種K326 為材料，每株煙澆灌20 mL 濃度0.2 mg/kg 的二氯喹啉酸溶液（75%可濕性粉劑，成都科利隆生化有限公司），采集澆灌處理后2 h、6 h、1 d、7 d和14 d的煙草葉片和根組織，對照（以0 h 表示）澆灌同等體積的清水。每個時間點取3株，每株為1次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

使用擬南芥ACS家族蛋白序列在煙草和番茄基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.sgn.cornell.edu/）中進行比對（BLASTP，E值＜100），將獲得的序列進行家族保守結(jié)構(gòu)域分析（PFAM：PF00155.18），鑒定普通煙草、林煙草、絨毛狀煙草和番茄ACS 蛋白。利用在線軟件Compute pI/Mw（http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）進行煙草蛋白質(zhì)分子量和等電點預(yù)測。使用WoLF PSORT 軟 件 （https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進行亞細胞定位預(yù)測。利用MEGAX軟件進行多序列比對（MUSCLE法）和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建（鄰接法，bootstrap設(shè)置為1 000）。使用Genedoc軟件進行氨基酸序列比對和編輯。順式作用元件預(yù)測使 用 PlantCARE 數(shù) 據(jù) 庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），啟動子長度選擇起始密碼子上游2 000 bp。

所用引物見表 1。 內(nèi)參引物為 26s-F：5′-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3′，26s-R：5′-T CTCCCTTTAACACCAACGG-3′。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。第一鏈cDNA合成以O(shè)ligo（dT）為引物，使用AMV（Takara，寶生物工程大連有限公司）進行合成。定量PCR 使用2×SYBR Green qPCR Mix 試劑（KEMIX，北京密碼子生物科技有限公司），所用儀器為Bio-rad CFX96。根據(jù)Livak等［16］的方法進行相對表達量分析。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草ACS家族鑒定及基本特征分析

根據(jù)擬南芥ACS 家族蛋白序列，分別鑒定普通煙草、林煙草、絨毛狀煙草和番茄ACS 家族蛋白。普通煙草有26 個ACS 基因（表2），林煙草12 個，絨毛狀煙草 11 個，番茄 14 個。23 個普通煙草 ACS 基因定位在染色體上，9 號染色體上的ACS 基因最多，有 3 個；3 個基因定位在 scaffold 上。ACS 基因外顯子數(shù)3～4 個。CDS 長度為1 002～1 476 bp，編碼的蛋白最長含有491 aa，最短含有333 aa。分子量37.49～55.31 kDa，等電點5.29～8.62。核苷酸序列同源性為35.3%～99.9%，氨基酸一致性為27.5%～100% 。Ntab0327960、Ntab0675660、Ntab0907580、Ntab0292120 和 Ntab0756340 等 5 個蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，屬穩(wěn)定蛋白質(zhì)，其余均為不穩(wěn)定蛋白。蛋白總平均親水性均為負值，因此煙草ACS 全部為親水性蛋白。亞細胞定位預(yù)測表明，煙草ACS蛋白主要定位在細胞核或者細胞質(zhì)中。

表2 煙草ACS家族的基本特征Tab.2 Essential characteristics of tobacco ACS family

2.2 系統(tǒng)進化分析

采用來源于普通煙草、林煙草、絨毛狀煙草、番茄和擬南芥5個物種共72條ACS的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖1。圖1 中顯示，ACS 家族進化形成3類，分別為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類。其中Ⅲ類成員最少，普通煙草有5個成員。Ⅰ類成員最多，普通煙草有13個成員。相比較而言，擬南芥在Ⅱ類中成員最多（5個），在Ⅰ類中次之（3個），在Ⅲ類中只有1個成員。

圖1 煙草ACS家族的系統(tǒng)進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of tobacco ACS family

2.3 氨基酸序列分析

ACS屬于以磷酸吡哆醛（PLP）為輔酶的酶家族，酶活性中心位于保守區(qū)域［17］。ACS 家族成員含有7個保守氨基酸基序（BOX1～BOX7）和11個保守氨基酸位點（以▼和*標(biāo)示）。從氨基酸序列比對結(jié)果（圖2）中發(fā)現(xiàn)，所有煙草ACS 均含有保守位點E（BOX1中的·），該位點決定了ACS 催化反應(yīng)的特異性［18］。BOX2中的Y位點與ACS的底物識別相關(guān)［19］，煙草有3 個 ACS 缺 少 該 位 點 ，分 別 是 Ntab0870430、Ntab0187580和Ntab0187590。

圖2 ACS氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of ACS

ACS 蛋白 C 端序列包含 1 個保守的絲氨酸（S）位點，該位點能夠被CDPK 磷酸化。還包含3 個MAPK磷酸化位點。根據(jù)ACS蛋白序列比對結(jié)果，I類成員C 端氨基酸序列較長，除Ntab0187580 外，均含有CDPK和MAPK磷酸化位點。Ⅲ類成員C端最短，沒有CDPK 和MAPK 磷酸化位點。Ⅱ類成員除Ntab0759760 外，均含有CDPK 磷酸化位點和TOE基序。

2.4 啟動子分析

啟動子是基因表達調(diào)控的重要元件［14］。煙草ACS基因啟動子區(qū)的激素相關(guān)順式作用元件分析結(jié)果（圖3）顯示，煙草ACS基因啟動子區(qū)含有脫落酸、茉莉酸、水楊酸、生長素和赤霉素5種激素反應(yīng)共10種類型的順式作用元件。其中赤霉素反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件有3種，茉莉酸、水楊酸和生長素反應(yīng)有2種，脫落酸有1種。絕大多數(shù)基因的啟動子區(qū)都含有ABRE、CGTCA-motif和TGACG-motif 3種類型的順式作用元件。在這3種類型元件中，ABRE的數(shù)量最多，特別是在Ntab0504530 和Ntab0060800 中含有7個ABRE元件。SARE與水楊酸反應(yīng)相關(guān)，該元件只在Ntab0292120中發(fā)現(xiàn)。TGA-element和AuxRR-core是生長素反應(yīng)元件，TGA-element在10個基因的啟動子中均存在，其中Ntab0115830 含有4個TGA-element。表明煙草ACS基因表達可能受脫落酸、茉莉酸、水楊酸、生長素和赤霉素5種激素的調(diào)控。

圖3 普通煙草ACS啟動子激素相關(guān)順式作用元件分析Fig.3 Analysis on hormone-related cis-acting elements of NtACS promoter

2.5 表達模式分析

相對表達量分析結(jié)果（圖4）顯示，煙草ACS 家族絕大多數(shù)成員受二氯喹啉酸誘導(dǎo)而上調(diào)表達。上調(diào)幅度較大的基因有Ntab0759760、Ntab0856230、Ntab0650880、Ntab0187590 和 Ntab0805630，分別上調(diào) 137、126、71、42 和 39 倍。相反，Ntab0504530 和Ntab0187580在葉片和根系中均下調(diào)表達。

圖4 普通煙草ACS家族基因表達分析Fig.4 Expression analysis of NtACS gene family

大部分基因在葉片中的上調(diào)幅度較大，在根系中則相對較小。但Ntab0292120 和Ntab0650880、Ntab0003870、Ntab0474970 和 Ntab0060800 5 個基因則相反，在根系中上調(diào)幅度較大，在葉中較小。Ntab0883620、Ntab0907570 和 Ntab0675660 3 個基因只在葉片中上調(diào)表達，在根系中表達量變化不大。Ntab0474970在葉中和根系中的表達趨勢相反，在葉片中上調(diào)表達了19 倍，在根系中卻下調(diào)表達了10倍。

大部分基因在二氯喹啉酸溶液處理后24 h表達量最高，但Ntab0907570 和Ntab0675660 兩個基因在處理后14 d 表達量最高，Ntab0504530 在處理后7 d表達量最高，Ntab0003870在處理后6 h表達量最高，Ntab0569080在處理后2 h表達量最高。

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，ACS 蛋白C 端是酶活性調(diào)控的主要區(qū)域。該區(qū)域長度差異較大。Ⅰ類成員C端序列最長，含有1個CDPK磷酸化位點和3個MAPK磷酸化位點。這些位點的磷酸化能夠穩(wěn)定ACS 蛋白活性，從而增加乙烯產(chǎn)生量［20-22］；而非磷酸化，會造成蛋白迅速被26S 蛋白酶體途徑降解，從而降低乙烯產(chǎn)生量。Ⅲ類成員C 端長度最短，不含有任何已知的調(diào)控位點。Ⅱ類成員C端長度較長，含有1個TOE基序和1個CDPK磷酸化位點。TOE基序是E3連接酶的結(jié)合位點，E3連接酶的結(jié)合會促進Ⅱ類ACS蛋白的降解。TOE基序中含有1個CDPK磷酸化位點，該位點的磷酸化能夠抑制26S 蛋白酶體與ACS 的C端結(jié)合，從而維持ACS 蛋白的穩(wěn)定性并增加乙烯產(chǎn)生量；而非磷酸化會造成ACS 迅速被26S 蛋白酶體途徑降解［23］。在 TOE 基序中，WVF 這 3 個氨基酸是E3 連接酶與ACS 結(jié)合所必需的。在煙草中，除WVF 形式外，還有 WGF、WVS 和 WVV 3 種突變形式，這些突變形式是否會影響TOE與E3連接酶的結(jié)合，進而影響ACS的穩(wěn)定性和乙烯的產(chǎn)生量，還需要進一步試驗驗證。

生長素和乙烯之間存在相互作用，生長素能促進乙烯合成，乙烯也能促進生長素合成［24］。作為一種生長素類除草劑，二氯喹啉酸通過誘導(dǎo)ACS 過量表達而產(chǎn)生大量乙烯，從而導(dǎo)致雜草死亡，可能是二氯喹啉酸除草的作用機制之一［4］。本研究結(jié)果表明，在二氯喹啉酸處理后，大部分ACS 家族成員都上調(diào)表達，和雜草中的表達相似，推測煙草二氯喹啉酸藥害跟除草的作用機制相似，都是通過誘導(dǎo)ACS 過量表達，造成乙烯大量積累，從而使煙草表現(xiàn)出藥害癥狀。

二氯喹啉酸作為一種生長素類物質(zhì)，其作用與生長素信號途徑密切相關(guān)，而ARF 等生長素信號途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子能夠直接結(jié)合到生長素響應(yīng)基因啟動子區(qū)的生長素響應(yīng)元件上，從而調(diào)控生長素響應(yīng)基因的表達［5］。對煙草ACS啟動子分析發(fā)現(xiàn)，至少有11個ACS含有生長素反應(yīng)元件TGA-element，有4個含有元件AuxRR-core，說明ARF可能調(diào)控這些基因的表達。因此，推測二氯喹啉酸調(diào)控ACS表達，其過程是：二氯喹啉酸首先與生長素受體結(jié)合，通過生長素信號途徑和泛素/26S 蛋白酶體途徑，激活A(yù)RF。ARF 結(jié)合到ACS 啟動子區(qū)的生長素反應(yīng)元件上，啟動這些基因大量表達，最終造成乙烯的過量積累。

4 結(jié)論

普通煙草紅花大金元ACS家族有26個成員，全部為親水性蛋白，主要定位于細胞核或者細胞質(zhì)中，進化形成3 類。Ⅰ類成員含有CDPK 和MAPK 磷酸化位點，Ⅲ類成員不含有CDPK 和MAPK 磷酸化位點，Ⅱ類成員含有CDPK 磷酸化位點和TOE 基序。啟動子區(qū)含有脫落酸、茉莉酸、水楊酸、生長素和赤霉素共5種激素反應(yīng)的10種順式作用元件。二氯喹啉酸能誘導(dǎo)大部分煙草ACS基因的上調(diào)表達。