譚玉嬌，郭翠蓮，王 可，楊林圜，汪晚晴，輝啟林，畢鑫磊，趙正雄*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

碳氮代謝是煙株最基礎(chǔ)的生理代謝，也是決定煙葉產(chǎn)質(zhì)量形成的重要代謝［1-3］。大量研究證實，優(yōu)質(zhì)煙葉形成的生理代謝要求呈現(xiàn)出前期氮代謝、碳的轉(zhuǎn)化、固定代謝強(qiáng)、碳的積累代謝弱，而后期則表現(xiàn)出相反的趨勢［4-5］。烤煙碳氮代謝進(jìn)程的強(qiáng)弱及快慢受到諸多因素的影響，其中，品種是決定烤煙碳氮代謝的內(nèi)在遺傳因素［1，4］，除此之外，還有生物脅迫［6］、非生物脅迫［7-8］、激素［9-10］、打頂時期［11］、土壤pH值［12］，以及施入肥料的營養(yǎng)水平及營養(yǎng)類型，如氮水平［13-15］、氮素形態(tài)［16-19］。

硝酸還原酶（NR）是氮代謝過程中的重要守門酶；谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）是構(gòu)成氮代謝過程GS/GOGAT偶聯(lián)循環(huán)的關(guān)鍵成員酶，其中，谷氨酰胺合成酶因時空及組織的特異性而存在GS1和GS2兩種同工酶；總氮是各時期氮代謝產(chǎn)生含氮化合物的重要集合體，它們在各時期的濃度及含量都對生育期內(nèi)氮代謝的調(diào)控發(fā)揮著不可替代的作用［20-21］。蔗糖合成酶（SS）、磷酸蔗糖合成酶（SPS）、可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（SAI）和α-淀粉酶是表征碳代謝強(qiáng)弱及其走向的關(guān)鍵酶，其中，SS和SAI酶是負(fù)責(zé)蔗糖水解的重要酶類，但其水解產(chǎn)物及時期不同，SAI酶主要在生育前、中期發(fā)揮提供碳骨架和能量的作用，維持碳的轉(zhuǎn)化代謝；SS主要在生育后期發(fā)揮提供核苷酸類物質(zhì)的作用，保證碳的積累代謝；SPS不可逆地催化蔗糖的合成，加持碳骨架的長距離運輸工作；α-淀粉酶協(xié)調(diào)各時期葉綠體的庫存工作，奠定碳的積累代謝基礎(chǔ)；而總糖則是對各時期碳代謝產(chǎn)物的直接體現(xiàn)，上述酶及產(chǎn)物均能直接或間接地指示碳代謝在生育期內(nèi)的走勢及波動情況［21-24］。

烤煙從土壤中主要吸收和利用銨態(tài)氮、硝態(tài)氮2種不同形態(tài)的氮［25］。氮素形態(tài)具有較強(qiáng)的地域差異性，不同氮素形態(tài)對烤煙碳氮代謝酶的活性及總氮、總糖含量的影響不同［26-27］。楊春霞［28］、岳俊芹［17］等認(rèn)為，單一氮源對煙株代謝的促進(jìn)作用顯著低于復(fù)合氮源，全銨處理的煙株后期SPS酶的活性較高，顯著提高了向碳的積累代謝過渡的難度，不利于優(yōu)質(zhì)煙葉質(zhì)量的形成；郭曉惠［18］、韋建玉［29］等認(rèn)為，高比例的硝態(tài)氮對烤煙葉片總糖積累有促進(jìn)作用，對NR、α-淀粉酶的活性有抑制作用，對總氮積累則無明顯作用；而花蕊等［30］則指出，硝態(tài)氮不僅能促進(jìn)水溶性總糖的積累，而且也能促進(jìn)總氮的積累；謝晉等［31］則表示，硝態(tài)氮顯著提高了碳的積累代謝，促進(jìn)了總糖、還原糖等碳水化合物的積累，顯著降低了氮代謝，抑制了總氮、煙堿等含氮化合物的積累；介曉磊［32］、Court［33］等認(rèn)為，銨態(tài)氮能顯著提高總糖含量，并且能顯著降低總氮含量。

目前，對碳氮代謝的研究報道已經(jīng)有很多，但所得結(jié)論仍不統(tǒng)一，一方面，可能是由于不同烤煙品種在不同區(qū)域種植，其體內(nèi)自身碳氮代謝會存在一定的差異；另一方面，也可能是由于不同地區(qū)土壤理化性質(zhì)差異導(dǎo)致了烤煙對不同形態(tài)氮的吸收存在差異，從而影響了碳、氮代謝。基于此，本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，挑選出3個典型的氮素形態(tài)配比，以K326為材料設(shè)置盆栽試驗，全面闡明烤煙生育期內(nèi)碳氮代謝酶的活性及總氮、總糖對不同銨硝配比的響應(yīng)機(jī)制，為后期碳、氮這2種代謝的適時轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)煙葉優(yōu)質(zhì)、適產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及供試材料

本研究于2019年11月至2020年3月，在云南省晉寧區(qū)寶峰鎮(zhèn)大春河基地以K326為試驗材料進(jìn)行盆栽試驗。所用肥料為云南省云天化集團(tuán)提供的含巴斯夫硝化抑制劑（DMPP）的硫酸鉀型復(fù)合肥（N-P2O5-K2O=13-10-22，銨硝比=7∶3）、鈣鎂磷肥（18% P2O5）、硫酸鉀（50% K2O）、硝酸鉀（N-P2O5-K2O=13.5-0-44.5）。盆栽土壤為未種植過作物的紅色土，土壤的基本理化性質(zhì)：有機(jī)質(zhì)14.768 g/kg、全氮0.838 g/kg、堿解氮61.956 mg/kg、速效磷8.4762 mg/kg、速效鉀66.312 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)置銨硝比為7∶3、5∶5和3∶7的3個不同氮素形態(tài)配比的處理，其中各處理不足的硝態(tài)氮以硝酸鉀補充、磷以鈣鎂磷肥補充、鉀以硫酸鉀補充，每株煙各肥料的施用量如表1所示。所選盆栽規(guī)格為：上直徑為35 cm、盆高30 cm，每盆裝土13 kg，控制施入純氮8 g，N∶P∶K的質(zhì)量比為1∶1∶2.5；基肥與追肥比為6∶4，基肥于移栽時完全拌土施入，追肥于移栽后40 d每盆兌1000 mL水一次性施入。其他栽培管理措施均按照優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)規(guī)范要求。每個處理移栽60株，共計180株。

表1 各處理肥料施用的種類及其施用量 g/盆

1.3 測定方法

分別于烤煙移栽后45 d（旺長期）、70 d（打頂后1 d）和95 d（成熟期）對各處理隨機(jī)取6株，取樣部位為中部葉（第1次取樣為從下往上數(shù)的第8葉，第2次和第3次為從下往上數(shù)的第11片葉，均距葉尖1/3的部位），取樣后，切碎混勻，液氮保存?zhèn)溆?，用于測定碳代謝酶（SPS、SS、SAI、α-淀粉酶）和氮代謝酶（NR、GS、GOGAT）的活性。測定方法采用試劑盒法，試劑盒購于蘇州格銳思生物科技有限公司。此外，同時期另選6株，取相同葉位，105 ℃殺青、75 ℃烘干，由云南省同川農(nóng)業(yè)分析測試技術(shù)有限公司測定各時期煙葉總氮、水溶性總糖的含量。

1.3.1 粗酶液的制備 將各處理取回的待測樣品，準(zhǔn)確稱取1 g，置于預(yù)冷的研缽中，隨后加入1 mL酶提取液，快速研磨至勻漿，完全轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，于4 ℃、12000 r/min下離心10 min，上清液即為酶粗液。

1.3.2 酶活性的測定 各類酶活性的測定均按照各自試劑盒內(nèi)的試驗操作步驟嚴(yán)格執(zhí)行。其中，以每小時每克鮮重樣品中催化產(chǎn)生1 nmol NO-的

2量定義為1個NR酶活力單位；每克組織在每分鐘內(nèi)使A540吸光值變化0.01定義為1個谷氨酰胺合成酶活性單位；每克組織每分鐘生產(chǎn)1 nmol的谷氨酸定義為1個谷氨酸合成酶活性單位；37 ℃下每克組織每分鐘產(chǎn)生1 μg還原糖定義為1個可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶活性單位；每毫升每分鐘催化產(chǎn)生1 mg麥芽糖定義為1個α-淀粉酶活性單位；每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1 μg果糖定義為1個蔗糖合成酶活性單位；每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1 μg蔗糖定義為1個磷酸蔗糖合成酶活性單位。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019、SPSS 19.0軟件制作圖表及進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮素形態(tài)配比對烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.1.1 對硝酸還原酶活性的影響 硝酸還原酶（NR）是氮代謝過程中的關(guān)鍵酶和限速酶。有研究表明，不同銨硝配比對NR酶的活性有顯著影響，NR隨施入硝態(tài)氮比例的升高而升高［21-24］。本試驗結(jié)果也得出了相似結(jié)論（圖1）：除移栽后70 d，銨硝比7∶3和3∶7處理的NR酶活性顯著高于銨硝比5∶5處理外，其余處理時期均得出銨硝比3∶7處理的NR酶活性高于或顯著高于銨硝比7∶3和5∶5處理的結(jié)論，即：高比例硝態(tài)氮施入量對NR的激活作用較高或顯著較高。此外，隨煙株生育期的延長，銨硝比7∶3和5∶5處理的煙葉NR酶的活性呈先升高后降低的趨勢，而銨硝比3∶7處理的煙葉NR酶的活性則逐漸升高。

圖1 不同氮素形態(tài)配比對煙株生育期內(nèi)NR酶活性的影響

2.1.2 對谷氨酰胺合成酶及谷氨酸合成酶活性的影響 GS/GOGAT偶聯(lián)循環(huán)是氨同化過程中的重要組成部分。有研究指出，參與循環(huán)的GS和GOGAT酶的活性與土壤中的銨態(tài)氮比例呈顯著正相關(guān)關(guān)系［21-22］。圖2顯示，移栽45 d的烤煙葉片GS2和GOGAT酶的活性均以銨硝比7∶3處理最高，且銨硝比7∶3、5∶5處理的GS2酶活性無顯著差異，銨硝比5∶5、3∶7處理的GOGAT酶活性無顯著差異；移栽70、95 d的GS2和GOGAT酶活性均以銨硝比3∶7處理最高，其中，移栽70 d的GS2酶活性以銨硝比3∶7處理顯著高于5∶5處理，而5∶5處理又顯著高于7∶3處理；GOGAT酶的活性以銨硝比5∶5和3∶7處理顯著高于7∶3處理，且5∶5、3∶7處理之間無顯著差異。移栽95 d的GS2酶活性以銨硝比3∶7處理最高，銨硝比7∶3、5∶5處理之間無顯著差異；GOGAT酶活性表現(xiàn)為銨硝比5∶5處理略低于3∶7處理，且兩者的GOGAT酶活性均顯著高于7∶3處理。此外，3個處理下的GS2、GOGAT酶活性在煙株生育期內(nèi)的變化趨勢各不相同，即：銨硝比7∶3處理下的葉片GS2、GOGAT酶活性均隨生育期逐漸下降；而5∶5處理呈先升高后降低的趨勢；3∶7處理的GS2酶活性逐漸升高，而GOGAT酶活性變化則與5∶5處理一致，呈先升高后降低的趨勢。

圖2 不同氮素形態(tài)配比對煙株生育期內(nèi)GS2、GOGAT活性的影響

2.2 不同氮素形態(tài)配比對烤煙碳代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.2.1 對蔗糖合成酶活性的影響 蔗糖合成酶（SS）是衡量煙葉中內(nèi)含物質(zhì)充盈情況的關(guān)鍵指標(biāo)［21-22］。圖3顯示，前期銨硝比7∶3和3∶7處理對SS酶活性的激活作用顯著強(qiáng)于5∶5處理，但前兩者的穩(wěn)定作用不如后者；3個處理的SS酶活性均呈下降趨勢，但5∶5處理的酶活性下降趨勢更緩。具體來說：在移栽45 d時，銨硝比7∶3、3∶7處理的SS酶活性顯著高于5∶5處理，且7∶3、3∶7處理之間無顯著差異；移栽70 d的酶活性以銨硝比3∶7處理最高，7∶3、5∶5處理之間無顯著差異；移栽95 d的酶活性以3∶7處理略高，但3個處理之間無顯著差異。

圖3 不同氮素形態(tài)配比對煙株生育期內(nèi)SS酶活性的影響

2.2.2 對磷酸蔗糖合成酶活性的影響 磷酸蔗糖合成酶（SPS）在煙株體內(nèi)的活性可用于衡量烤煙碳代謝的強(qiáng)弱及其變化規(guī)律［21］。由圖4可知，自烤煙移栽45 d開始，3個處理的SPS酶活性就處于一個較低水平，甚至在移栽70 d時，還出現(xiàn)一個小的低峰值，而到移栽95 d時，SPS酶的活性明顯升高。此外，在各時期，3個處理的葉片SPS酶活性均以銨硝比5∶5處理最高，以3∶7處理最低，且在移栽45 d和70 d時，銨硝比7∶3、3∶7處理之間的酶活性無顯著差異；移栽95 d時，7∶3、5∶5處理之間無顯著差異。

圖4 不同氮素形態(tài)配比對煙株生育期內(nèi) SPS 酶活性的影響

2.2.3 對酸性轉(zhuǎn)化酶活性的影響 酸性轉(zhuǎn)化酶SAI是碳代謝為其他代謝提供必需碳骨架和能量的關(guān)鍵酶［21］。由本試驗結(jié)果（圖5）可知，3個處理下，前期的酸性轉(zhuǎn)化酶的活性明顯高于后期，呈緩慢下降的趨勢，且在處理過程中，僅在移栽45 d時銨硝比7∶3處理的酸性轉(zhuǎn)化酶的活性顯著高于3∶7處理，其余時期銨硝比7∶3處理均顯著高于5∶5、3∶7處理，而銨硝比5∶5和3∶7處理之間無顯著差異。

圖5 不同氮素形態(tài)配比對煙株生育期內(nèi)酸性轉(zhuǎn)化酶活性的影響

2.2.4 對α-淀粉酶活性的影響 α-淀粉酶活性的高低與煙株碳代謝的強(qiáng)弱及葉片內(nèi)含物質(zhì)積累情況息息相關(guān)［21-22］。由圖6可見，在3種氮素形態(tài)供應(yīng)模式下，α-淀粉酶的活性隨煙株生育期的推進(jìn)而呈先降低后升高的趨勢。此外，在3個時期內(nèi)，葉片α-淀粉酶的活性均以銨硝比3∶7處理的最高，以7∶3處理最低，且在移栽45、95 d時，銨硝比5∶5和3∶7處理的酶活性顯著高于7∶3處理，而5∶5、3∶7處理之間無顯著差異；而在移栽70 d時，α-淀粉酶的活性雖以銨硝比3∶7處理最高，但3個處理之間無顯著差異。

圖6 不同氮素形態(tài)配比對煙株生育期內(nèi)α-淀粉酶活性的影響

2.3 不同氮素形態(tài)配比對烤煙總氮及總糖含量的影響

煙葉總糖及總氮分別是碳代謝和氮代謝的重要產(chǎn)物之一，兩者在煙株各時期的含量是評價煙葉代謝活動強(qiáng)弱及走向的重要指標(biāo)，同時，也是表征烤煙產(chǎn)質(zhì)量的重要指標(biāo)［20-22］。圖7顯示了各時期內(nèi)烤煙葉片中水溶性總糖及總氮含量隨不同硝銨比的變化規(guī)律，其中，3個處理的總氮含量均隨生育期的進(jìn)程而呈逐漸下降的趨勢，總糖含量則呈上升的趨勢，且移栽70 d以后，各處理煙葉內(nèi)的總糖含量逐漸趨于穩(wěn)定。同時，整個生育期內(nèi)總氮含量對土壤氮素形態(tài)的響應(yīng)均以銨硝比5∶5處理最高，7∶3、3∶7處理之間則無明顯區(qū)別；總糖含量則以銨硝比7∶3處理最高，而3∶7處理的最低，且各處理之間均無顯著差異。

圖7 不同氮素形態(tài)配比對煙株生育期內(nèi)葉片總氮、總糖含量的影響

3 討論與結(jié)論

在優(yōu)質(zhì)煙葉形成的過程中，一般要求隨煙株生育期的推進(jìn)，煙葉中必須有含氮化合物代謝逐漸向碳水化合物代謝過渡的趨勢。本研究結(jié)果表明，3個處理的NR活性在生育期內(nèi)均呈先升高后降低的趨勢，這符合后期氮代謝逐漸減弱的規(guī)律；此外，NR活性與硝態(tài)氮含量呈正相關(guān)或顯著正相關(guān)關(guān)系，這與賈保順［34］、楊志曉［24］、李成陽［35］、沈麗［36］等的研究結(jié)論一致。就GS2、GOGAT這2個酶的活性而言，其前期與銨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，后期與銨態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與王玉霞［37］、李成陽［35］等的研究結(jié)果存在差異，其原因可能是在煙株根系發(fā)育基本完善的處理前期，根系可能更偏向于吸收耗能更少的銨態(tài)氮，這大大促進(jìn)了根部GS1酶活性的提高，進(jìn)而提高了氮的轉(zhuǎn)運效率，從而促進(jìn)了葉片中GS2、GOGAT酶活性的提高；而后期隨生育期的進(jìn)程及維管束結(jié)構(gòu)的不斷完善，土壤中銨態(tài)氮含量因硝化及根系的吸收也在不斷減少，此時，土壤中的硝態(tài)氮可直接由維管束轉(zhuǎn)運到葉片，從而大大提高了GS2、GOGAT酶的活性［38］。

此外，本研究還得出，銨硝比3∶7處理的煙株在生育后期有利于提高SS、α-淀粉酶的活性，并降低SPS酶的活性，從而有助于降低碳的轉(zhuǎn)化及固定速率，并加速碳水化合物的積累，這表示適當(dāng)提高硝態(tài)氮的施入比例，不僅對煙葉打頂后內(nèi)含物質(zhì)的充實有幫助，而且還有利于碳代謝與氮代謝兩者之間的適時過渡和轉(zhuǎn)化，這與Wang［27］、岳俊芹［17］等對烤煙的研究結(jié)論相似。同時，本試驗也得出：生育期內(nèi)轉(zhuǎn)化酶及SS酶的活性均隨生育期的推進(jìn)而逐漸下降，但轉(zhuǎn)化酶活性的下降幅度不及SS，這意味著處理后期蔗糖的分解由這2個酶同時催化，這與張新要等［19］得出的轉(zhuǎn)化酶和SS在生育期內(nèi)呈互補趨勢的結(jié)論存在差異。除了氮素形態(tài)會影響碳氮代謝的強(qiáng)度及代謝進(jìn)程外，還有水分、溫度、光照等。胡亞杰等［39］認(rèn)為，成熟期水分過多，延緩了煙葉碳代謝周期，有利于含氮化合物的積累；張森等［1］指出，低溫會延長代謝周期，高溫則會破壞葉綠素，使得碳代謝失調(diào)；云菲等［40］認(rèn)為，遮陽會提高NR酶的活性，延長氮代謝周期。上述研究表明，植物體內(nèi)的碳氮代謝酶的活性對氮素形態(tài)的響應(yīng)差異還可能會受到其他環(huán)境因素的影響。

本試驗結(jié)果表明，各處理的總糖含量與銨態(tài)氮比例呈正相關(guān)關(guān)系，總氮含量以銨硝各占一半時最高，但它們對氮素形態(tài)的響應(yīng)差異不顯著。在本試驗條件下，綜合碳氮代謝的協(xié)調(diào)性及烤煙優(yōu)質(zhì)煙葉對內(nèi)在質(zhì)量的要求來看，以銨硝比3∶7處理的綜合得分最高，即：施用較高比例的硝態(tài)氮有利于煙株碳氮代謝協(xié)調(diào)運作及后期碳代謝和氮代謝的適時轉(zhuǎn)化，可考慮在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。