張賀蕾，陳 芬，馬 麗，劉 博

（1.江蘇省農業(yè)科學院 宿遷農科所，江蘇 宿遷 223800；2.大連海洋大學 科技與環(huán)境學院，江蘇 大連 116023）

0 引言

萱草（Hemerocallis fulva）又名金針菜、鹿箭、忘憂草等，是阿?；疲ˋsphodelaceae）萱草屬（Hemerocallis L.）的多年生宿根草本花卉。其品種種類繁多，花色豐富多彩，花型千變萬化，適應性強，喜陽光又耐半蔭，喜干旱又耐濕潤。萱草屬植物有15～18種，主要分布于亞洲溫熱帶至熱帶地區(qū)，原產于我國的約有11種［1］。重瓣萱草（Hemerocallis fulva var. kwanso Regel）多為雄蕊瓣化，花瓣數(shù)多于6，根肉質，葉片較寬，早上開花晚上凋謝，花型獨特，可分為芍藥型重瓣和套疊型重瓣［2］；因其花瓣多重層次感強，近年來還出現(xiàn)了重瓣卷邊型、重瓣花心環(huán)型、重瓣鑲邊型等［3］。由于重瓣萱草的自然結實率偏低，其繁殖方式以分株繁殖為主［4］，多叢植、片植、行植于花帶和花境中，也可作樹林地被植物。此外，萱草是我國傳統(tǒng)的母親花，寓意著偉大的母愛，近年來，越來越多的優(yōu)新品種流行于家庭園藝。同時，萱草作為金針菜的近親，依托黃花菜產業(yè)不僅促進了休閑農業(yè)的打造，促進了金針菜產業(yè)發(fā)展的提檔升級，而且是“美麗鄉(xiāng)村”建設中不可多得的鄉(xiāng)土植物［5］。

遺傳多樣性是一個群體或者種內個體之間的遺傳變異總和。不同物種的遺傳多樣性都是獨一無二的，都儲存在其基因中，是長期進化的產物。目前，與國外相比，我國重瓣萱草育種工作進展較為緩慢，應用于我國的重瓣萱草大部分都是國外培育的品種。主要是由于不斷的反復雜交，沒有新的基因加入，從而使其種間差別不顯著。因此，利用分子生物學手段，從分子水平研究重瓣萱草品種的親緣關系和遺傳背景是十分重要的［6］。

SSR熒光標記毛細電泳法是近年來發(fā)展起來的一種以DNA測序儀為平臺檢測PCR擴增產物的一種方法［7］；與銀染法相比，熒光測序技術每個位點多檢測3個等位變異，檢測效果更加準確、高效［8］。它不僅實現(xiàn)了擴增產物電泳的自動化，而且實現(xiàn)了電泳數(shù)據(jù)記錄的自動化［9］，該方法已在研究樣本遺傳多樣性、基因鑒定中得到應用。本研究選用34個重瓣萱草品種作為實驗材料，利用熒光標記毛細管電泳技術進行分子標記檢測，從DNA水平上探討了重瓣萱草的遺傳多樣性和多態(tài)性水平，并根據(jù)其遺傳相似系數(shù)進行了聚類分析，以期加快發(fā)掘優(yōu)異的基因資源，推進重瓣萱草種質資源的分子育種研究，為今后培育更多的重瓣萱草新品種提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料為從國內外收集的32種重瓣萱草品種：殘酷的命運、粉娃娃、摩西火、雙子座侍者、四十二街、紫色糖、粉紅、鋼琴男子、午后、謊言和口紅、太空海岸雪天使、強盜、邊境松露、國家的驕傲、荷葉雙摺邊、天馬行空富麗、夏娃、摩洛哥夏季、獨領風騷、快樂的流氓、黃鶴樓、中國山、事理情歌、萊邦、命定、蕾絲方巾、驚艷、黃色公主、冰淇淋、粉紅女孩、雙面嬌娃、雙重美味。還有2種重瓣萱草品種是以‘酒紅341’（單瓣型）作為母本，‘蕾絲方巾’作為父本，雜交后獲得的F1代品種：15087-3、15087-5。供試材料（表1）均栽植于江蘇省農業(yè)科學院宿遷農科所萱草種質資源圃內，采用分株繁殖栽培方式，每個材料分割成3株，株距為20 cm左右，行距25 cm左右，并將其標號。采用正常的水肥管理方法，定期除草，使其始終保持干凈的生長環(huán)境。

表1 34個重瓣萱草品種信息表

1.2 用CTAB法提取植物基因組DNA

DNA的提取采用優(yōu)化后的CTAB法：取34個重瓣萱草品種3～5 g新鮮材料的葉子或幼芽，剪碎，放到已加有鋼珠的2 mL的離心管中，再將離心管放入盛有液氮的保溫桶中，震蕩，磨碎；在其解凍之前迅速加入65 ℃預熱的CTAB提取液600～700 μL，迅速搖勻；將粗提取液裝入1.5 mL的離心管中，在65 ℃水浴20 min，期間不時搖動；隨后將離心管放進離心機，以8000 r/min離心10 min，離心后輕拿輕放，為避免吸入雜質，將上清轉到新的1.5 mL的離心管中；加入Glass Milk 3～5 μL和600 μL DNA Binding Buffer（或6 mol/L NaCl），充分混勻，在65 ℃水浴15 min，中間需翻轉；室溫放置5 min，放入離心機，4000 r/min離心1 min，棄上清，留管底，加入500 μL無水乙醇，吹打懸浮，洗滌，8000 r/min離心1 min；棄上清，重復上一步，再次加入500 μL無水乙醇，吹打懸浮，洗滌，8000 r/min離心1 min，棄上清，室溫干燥；最后加100 μL TE（pH 7.0），70 ℃水浴5 min，離心，吸取上清轉移至新的離心管中，放冰箱-20 ℃保存。

1.3 熒光毛細管電泳SSR-PCR擴增體系

反應體系總體積為25 μL，其中包含模板DNA（20 ng/μL）2 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTP（25 mmol/L）2 μL、熒光標記（FAM）正向SSR引物（5 μmol/L）1 μL、方 向 引 物（5 μmol/L）1 μL、rTap酶（5 U/μL）0.2 μL、ddH2O 16.3 μL。擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min；55～59 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后60 ℃延伸30 min，4 ℃保存。

1.4 熒光毛細管電泳位點信息監(jiān)測

將PCR產物移入分析區(qū)無菌通風櫥上進行后續(xù)操作。取96孔板，在板的側壁上寫上上機板號，如SSR_20210501-YuMI-1E。取20 μL Rox500內標,加入980 μL去離子甲酰胺內，渦漩混勻，離心，以每孔8 μL分裝到新的96孔板內，再取2 μL PCR產物對應地加入各孔中（加PCR產物時檢查2個板是否對應一致，是否將96孔板放倒，確保每孔對應正確）。最后將PCR產物板蓋上密封膜，存留；將測序跑樣板蓋上封口膜，短暫離心后，于95 ℃變性5 min，結束后立刻放到冰盒內保存5～10 min；然后將封口膜慢慢揭掉，更換96孔膠皮墊，離心。打開ABI3730xl儀器及電腦，待穩(wěn)定后打開信號收集軟件。

1.5 數(shù)據(jù)分析

待34個重瓣萱草電泳結束后，用GeneMapper 4.0軟件對樣品的原始數(shù)據(jù)進行分析，直接讀取樣品SSR片段長度，再利用Popgene和Power Marker V 3.25進行數(shù)據(jù)轉換并分析，計算出主等位基因頻率、基因型數(shù)、等位基因數(shù)、基因多樣性、雜合度、多態(tài)性信息含量等遺傳多樣性相關指標。利用NTSYS-pc 2.10 e算出遺傳相似系數(shù)，繪制聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選及優(yōu)化

本實驗引物均由青島科創(chuàng)質量檢測有限公司合成。共合成302對引物，并根據(jù)SSR Hunte檢測到的SSR位點進行篩選，初步篩選出PCR相對穩(wěn)定、具有多態(tài)性、重復性好的12對高多態(tài)性引物（表2），并將其優(yōu)化后，對34個重瓣萱草品種進一步進行位點檢測。

表2 12對SSR引物信息表

2.2 多態(tài)性分析

34個重瓣萱草品種在12對高多態(tài)性SSR引物上進行擴增，擴增結果見表3。12對高多態(tài)性SSR引物共獲得111個等位基因，平均9.2500個，34個重瓣萱草品種的遺傳多樣性變化（基因多樣性）范圍為0.5826～0.9277，多態(tài)性信息含量（PIC）變 化 范 圍 為0.5684～0.9236，最 高 的 均 為P5，最低的均為P7。遺傳多樣性平均值為0.8043，多態(tài)性信息含量（PIC）平均值為0.7875，Shannon信息指數(shù)（I）平均值為1.8753，觀測雜合度變化范圍為0.1333～0.7333，期望雜合度變化范圍為0.5057～0.9385（表4），說明34個重瓣萱草品種之間遺傳基礎廣，遺傳多樣性處于較高水平。在位點P5的遺傳多樣性水平偏離平衡程度最低，在位點P7的遺傳多樣性水平偏離平衡程度最高。

表3 12對SSR引物對34個重瓣萱草品種的擴增結果

表4 12對引物對34個重瓣萱草品種的SSR遺傳多樣性

2.3 UPGMA聚類分析

34個重瓣萱草品種基于遺傳相似系數(shù)矩陣，采用UPGMA方法進行聚類分析，根據(jù)聚類樹狀圖（圖1），在距離系數(shù)L=0.4128處，可將這34個種質劃分為兩大類群。‘中國山’‘雙面嬌娃’‘粉紅女孩’‘雙重美味’4個重瓣萱草品種聚成類群Ⅰ，‘殘酷的命運’‘粉娃娃’‘摩西火’‘雙子座侍者’‘四十二街’等30個重瓣萱草品種聚成類群Ⅱ，其中重瓣萱草‘摩洛哥夏季’在L=0.4108時與類群Ⅱ聚在一起，說明重瓣萱草‘摩洛哥夏季’與類群Ⅱ的相似性大于與類群Ⅰ的相似性，在L=0.4128時聚到一起。這表明兩大類群之間親緣關系較遠，存在較大的遺傳差異。

圖1 UPGMA法構建的34種重瓣萱草品種的樹狀聚類圖

類群I可劃分為2個亞類：（I）亞類和（Ⅱ）亞類，其中（I）亞類為24號‘萊邦’，（Ⅱ）亞類又分A、B 2個小亞類。在B小亞類中，32號‘雙面嬌娃’、34號‘雙重美味’聚類在一起，與A小亞類中的33號‘粉紅女孩’聚成（Ⅱ）亞類。這一類群中4個重瓣萱草品種內外花被片顏色相同，且紅色系為主要色系，花瓣寬度較大，葉片寬度均較寬，著花密度較大。

類群Ⅱ包括重瓣萱草‘殘酷的命運’‘粉娃娃’‘摩西火’‘雙子座侍者’等共計30個重瓣萱草品種，其中7號‘粉紅’、30號‘黃色公主’組成小類，與31號‘冰淇淋’聚在一起，再與（Ⅲ）亞類聚成Ⅱ大類。在所有供試的重瓣萱草品種中，28號‘15087-3’、29號‘15087-5’最早聚在一起，說明這2種重瓣萱草親緣關系極其接近，它們的相似性最高，遺傳差異最小，聚類后又與26號‘蕾絲方巾’在0.2500時聚在一起，這與28號‘15087-3’和29號‘15087-5’是以‘酒紅341’作為母本，‘蕾絲方巾’作為父本雜交后所得F1代品種相一致。這一類群中的30個重瓣萱草品種顏色多樣，有紅色、紫紅、橙紅、橙黃、黃色、橙色六大色系，且花序形態(tài)多樣，葉叢姿態(tài)均為半直立，葉叢高度均為中等，直徑較小，內外花被片邊緣波皺程度較強。

3 討論

隨著我國大力推廣生態(tài)型、節(jié)約型的園林綠化理念，宿根花卉在園林中發(fā)揮著越來越重要的作用［10］，萱草以行植、叢植、群植的配置方式大量栽植于花境、花壇中。重瓣萱草因其獨特花型具有較高的觀賞性，深受人們的喜愛，但我國對萱草的

研究仍處于初級階段，對重瓣萱草的研究更少，對其進行分類始終存在困難，進而無法充分掌握萱草的遺傳信息，影響了育種工作的進一步開展［11］。同時，我國重瓣萱草雜交所依賴的種質基礎薄弱，萱草種質資源的遺傳基礎較為狹窄，并且常出現(xiàn)雜交不親和現(xiàn)象，使得難以選育出有突破性的新品種。我國學者通過分子標記的方法對萱草遺傳多樣性研究較少，對重瓣萱草的研究更是寥寥無幾，并且前人對萱草的分子標記研究主要是利用EST-SSR［12］、ISSR［13］等標記。本研究利用SSR分子標記對34個重瓣萱草品種的遺傳多樣性進行研究，共篩選出PCR相對穩(wěn)定、重復性好、可擴增出預期大小片段的12對引物，且它們都具有較高的多態(tài)性（PIC＞0.5），這12對引物中共擴增出604條條帶，多態(tài)性百分率達100%。對比任陽［14］使用ISSR分子標記對50個萱草屬植物的研究中共擴增出196條條帶，多態(tài)性百分率為96.43%；彭澤宇［15］使用SRAP分子標記對13個萱草品種的研究表明，多態(tài)性百分率為90.1%，本研究的多態(tài)性百分率均比其高。本實驗采用熒光毛細管電泳法可以準確區(qū)分出34個重瓣萱草品種，克服了聚苯烯酰胺凝膠電泳法中人工對SSR片段辨別產生的誤差［16］，說明熒光毛細管電泳法的多態(tài)性和開發(fā)效率均較高，可有效地解釋材料間的遺傳差異，同時，也印證了該方法可以對不同重瓣萱草的遺傳多樣性水平進行鑒定和研究。

隨著科技水平的不斷提高，SSR分子標記被廣泛應用于遺傳多樣性的研究中，研究的成功與否取決于選用的分子標記的基因型數(shù)和質量的準確性［17］。朱華芳等［18］利用5對SSR標記對6個萱草原種或變種和14個萱草園藝品種進行了PCR擴增，共擴增出23條條帶，擴增片段大小在600～100 bp之間。本研究利用12個SSR標記對34個重瓣萱草品種進行檢測，共獲得了111個等位基因，平均9.2500個，遺傳多樣性平均值為0.8043，多態(tài)性信息含量（PIC）平均值為0.7875，Shannon信息指數(shù)（I）平均值為1.8753，表明各供試材料間遺傳多樣性水平較高；與此同時，平均觀測雜合度明顯低于期望雜合度（表3），說明這34個重瓣萱草品種純合子合體較多。本實驗數(shù)據(jù)為重瓣萱草品種的功能基因定位奠定了一定的理論基礎，同時也為之后的研究提供了純度鑒定依據(jù)。

羅軍武等［19］研究認為，彼此間親緣關系的遠近可以通過遺傳距離的大小反映出來。戴李川［20］研究表明，遺傳距離越大，遺傳多樣性越高，遺傳基礎越廣泛。本研究實驗數(shù)據(jù)表明，34個重瓣萱草品種的遺傳相似系數(shù)范圍為0.225～0.413，在聚類分析圖中，類群I中的4個重瓣萱草品種與類群Ⅱ中的30個重瓣萱草品種親緣關系相對較近；28號‘15087-3’、29號‘15087-5’最早聚在一起，說明這2種重瓣萱草的親緣關系極其接近。重瓣萱草在遺傳進化與育種中基因庫較為局限，遺傳基礎比較狹窄，有可能是因為在育種時選擇的親本較為接近。因此，在遺傳相似系數(shù)較低的重瓣萱草品種中應加快發(fā)掘優(yōu)異的基因資源，從而推進重瓣萱草品種的分子育種研究，以期為今后培育更多的重瓣萱草新品種提供參考和依據(jù)。