朱 婧，徐海燕△，朱躍芳，趙靜芝，譚鑫強(qiáng)

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110000； 2.湖南省株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 株洲 412000； 3.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 412000）

N-亞硝胺類(lèi)化合物屬遺傳毒性雜質(zhì)，進(jìn)入人體可立即通過(guò)細(xì)胞色素P450 酶代謝活化，生成活性烷基及小分子醛，與DNA 和蛋白質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而破壞DNA 的復(fù)制及損傷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等［1-2］，在痕量水平即可造成DNA 和染色體損傷。故此類(lèi)化合物屬?lài)?guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）M7（R1）（《評(píng)估和控制藥物中DNA反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)》）指南［3］中提及的“關(guān)注隊(duì)列”物質(zhì)。且根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的致癌物清單［3］，N-亞硝基二甲胺（NDMA）和N-亞硝基二乙胺（NDEA）均屬2A 類(lèi)致癌物質(zhì)。此外中國(guó)藥典委員會(huì)、美國(guó)食品藥物管理局（FDA）、歐洲藥品質(zhì)量管理局（EDQM）已發(fā)布了氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC -MS/MS）法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法等多種檢測(cè)方法，以檢測(cè)沙坦類(lèi)藥物中N- 亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)［4-14］。替格瑞洛為環(huán)戊基三唑嘧啶類(lèi)新型口服抗血小板藥物，于2010 年12 月在歐洲上市，用于急性冠狀動(dòng)脈綜合征（ACS）的治療［15］。其主要經(jīng)縮合反應(yīng)、環(huán)合反應(yīng)、取代反應(yīng)、脫異丙基反應(yīng)合成［16］。替格瑞洛的起始物料合成過(guò)程中使用N，N-二異丙基乙胺（DIPEA），可能含有二甲胺、二乙胺和二異丙基乙胺，在環(huán)合反應(yīng)時(shí)使用亞硝酸鈉/乙酸條件進(jìn)行重氮化環(huán)化反應(yīng)，故可能產(chǎn)生N- 亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)［17］，如N -亞硝基二異丙胺（NDIPA）、NDMA和NDEA。為了保證藥品的安全和質(zhì)量可控，本研究中參照2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則9306“遺傳毒性雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則”［18］，采用GC-MS/MS法檢測(cè)替格瑞洛中N-亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

8890型氣相色譜儀、7010B型三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）；MS105DU 型電子分析天平（精度為0.01 mg）及ME204/ 02 型電子分析天平（精度為0.1 mg），均購(gòu)于梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.2 試藥

NDMA標(biāo)準(zhǔn)溶液（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，批號(hào)為985092ME，質(zhì)量濃度100 μg/mL）；NDEA 對(duì)照品（美國(guó)Cato Research Chemicals Inc.，批號(hào)為0325-RA-0011，含量97.8%）；NDIPA對(duì)照品（上海啟泰生物科技有限公司，批號(hào)為19082291，含量95.35%）；氘代N-亞硝基二甲胺（NDMA-d6）標(biāo)準(zhǔn)溶液（北京曼哈格生物科技有限公司，批號(hào)為14658-034，質(zhì)量濃度為100 μg/mL）；甲醇（美國(guó)Spectrum 公司，HPLC 級(jí)，批號(hào)為3TB0010）；替格瑞洛（原料藥，批號(hào)分別為20200801，20200901，20200902，2020903，2020904；粗 品，批 號(hào) 分 別 為20200701，20200801，20200901，20200902，20200903；均購(gòu)自湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Agilent VF - WAXms 毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm，1.0 μm），程序升溫（初始柱溫為40 ℃，保持0.5 min，以20 ℃/min的速率升至200 ℃，再以60 ℃/min的速率升至230 ℃，保持8 min），進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/ min，進(jìn)樣方式為不分流，進(jìn)樣量為1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊離子源（EI），溶劑延遲7 min；電壓為70 eV，離子源溫度為250 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），檢測(cè)定量離子質(zhì)荷比（m/z）為130→88（NDIPA），74→44（NDMA），102→85（NDEA），檢測(cè)定性離子m/z為130→42（NDIPA），74→42（NDMA），102→56（NDEA）。

2.2 溶液制備

內(nèi)標(biāo)溶液：精密量取NDMA-d6標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，置500 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得。

混合對(duì)照品溶液：取NDIPA 和NDEA 對(duì)照品各約15 mg，精密稱(chēng)定，分別置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，分別作為NDIPA 和NDEA 對(duì)照品貯備液。各精密量取1 mL，置同一100 mL 容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液定容，即得NDIPA 和NDEA 對(duì)照品溶液；分別精密量取1 mL，與NDMA 標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL 置同一50 mL 容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液定容，搖勻，即得NDIPA，NDMA，NDEA混合對(duì)照品貯備液。精密量取1 mL，置20 mL容量瓶，用內(nèi)標(biāo)溶液定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取替格瑞洛約400 mg，精密稱(chēng)定，置20 mL容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液溶解并定容，搖勻。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液、混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2，表明內(nèi)標(biāo)溶液不干擾NDMA，NDEA，NDIPA的檢測(cè)。

1.NDMA 2.NDEA 3.NDIPAA.內(nèi)標(biāo)溶液 B.混合對(duì)照品溶液圖1 總離子流圖1.NDMA 2.NDEA 3.NDIPAA.Internal standard solution B.Mixed reference solutionFig.1 Total ion flow chromatograms

線性關(guān)系考察及定量限與檢測(cè)限確定：將混合對(duì)照品貯備液用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋?zhuān)肗DMA 質(zhì)量濃度分別為2.09，5.22，10.44，15.66，20.88 ng/mL，NDEA 質(zhì)量濃度為0.61，1.54，3.07，4.61，6.14 ng/ mL，NDIPA 質(zhì)量濃度為0.58，1.46，2.91，4.37，5.83 ng/ mL 的系列混合對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、NDMA，NDEA，NDIPA與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。取混合對(duì)照品溶液（NDMA 2.09 ng/mL，NDEA 0.61 ng/ mL，NDIPA 0.58 ng/ mL），按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比分別為10∶1，3∶1 時(shí)的含量計(jì)作定量限和檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察及定量限和檢測(cè)限結(jié)果（n=5）Tab.1 Results of linear relation test，LOQ and LOD（n=5）

A.NDMA-d6 B.NDMA C.NDEA D.NDIPA圖2 MRM色譜圖A.NDMA - d6 B.NDMA C.NDEA D.NDIPAFig.2 MRM chromatograms

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次或連續(xù)進(jìn)樣3 d、1 d 1次，測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果日內(nèi)精密度中NDMA，NDEA，NDIPA 與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的RSD分別為2.10%，1.48%和1.48%（n=6），均小于5%，表明儀器精密度良好。日間精密度中NDMA，NDEA，NDIPA 與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的RSD分別為3.17%，1.83%和1.42%，均小于5%，表明日間精密度符合要求。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液，室溫放置0，8，19 h 時(shí)，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，NDMA，NDEA，NDIPA 與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的RSD分別為1.14%，2.72%，1.03%（n=3），表明供試品溶液在室溫下放置19 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品約400 mg，精密稱(chēng)定，各6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果NDMA，NDEA，NDIPA 與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的RSD分別為3.62%，1.46%，1.48%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品約400 mg，精密稱(chēng)定，共9份，分別加入混合對(duì)照品貯備液0.5，1，1.5 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品檢測(cè)

取多批次替格瑞洛粗品及對(duì)應(yīng)批次的原料藥，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果均未檢出這3種亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

替格瑞洛中亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)NDMA，NDEA 和NDIPA檢測(cè)方法主要依據(jù)2019 年4 月FDA 公布的檢測(cè)方法及文獻(xiàn)資料［19-21］制訂，根據(jù)雜質(zhì)限度和主成分理化性質(zhì)，為保證方法專(zhuān)屬性，將供試品溶液質(zhì)量濃度降低至20 mg/ mL，不僅減小了背景噪音，也大大降低了由樣品量過(guò)大導(dǎo)致主成分在系統(tǒng)殘留的風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)了燈絲和色譜柱的使用壽命。

N-亞硝胺類(lèi)為極性化合物，VF-WAXms毛細(xì)管色譜柱（30 mm×0.25 m，1.0 μm）適用于極性化合物，使各雜質(zhì)在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好分離，且柱流失較低，具有較低的背景噪聲，故確定使用此色譜柱進(jìn)行后續(xù)研究。

3.2 質(zhì)譜條件選擇

質(zhì)譜條件也參考2019 年4 月FDA 公布的NDIPA，NDMA 和NDEA 檢測(cè)方法［19-21］制訂，配制質(zhì)量濃度為2 ng/mL的線性溶液，通過(guò)比較-40，70 eV電子轟擊離子源電壓，響應(yīng)值無(wú)明顯差異，且70 eV 為常用電子轟擊離子源電壓，因此采用70 eV。

配制質(zhì)量濃度為2 ng/ mL 的線性溶液，對(duì)進(jìn)樣方式進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，與一般直接進(jìn)樣相比，采用脈沖不分流，可減少不穩(wěn)定待測(cè)物在進(jìn)樣口分解的機(jī)會(huì)，且樣品集中進(jìn)入色譜柱可提高檢測(cè)的靈敏度。

3.3 樣品測(cè)定結(jié)果分析

亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)致癌風(fēng)險(xiǎn)高，F(xiàn)DA網(wǎng)站公布的NDIPA、NDMA、NDEA 的臨時(shí)每日可接受攝入量（AI）分別為26.5，96，26.5 ng/ d［22］，根據(jù)替格瑞洛最大日劑量為180 mg，計(jì)算其限度（限度= AI/ 每日用藥量）分別為0.147，0.533，0.147 μg/ g。檢測(cè)多批次粗品及相對(duì)應(yīng)批次成品，3 種亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)均未檢出，表明此合成工藝對(duì)該類(lèi)雜質(zhì)清除效果較好。此外，由于在不同工藝步驟中分別使用能引入仲胺和亞硝化試劑的物料，產(chǎn)生亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的可能性本身極低，結(jié)合檢測(cè)數(shù)據(jù)，質(zhì)量控制風(fēng)險(xiǎn)較小。

綜上所述，本試驗(yàn)中采用LC-MS/MS法測(cè)定替格瑞洛中N-亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)，方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，基質(zhì)干擾小，適用于實(shí)驗(yàn)室中藥物基因毒性雜質(zhì)的日常檢測(cè)。