王彪，趙楊，仇杰

(貴州大學 林學院 貴州省森林資源與環(huán)境研究中心， 貴州 貴陽 550025)

花粉是高等植物的雄配子體，在雙受精中起到傳遞父本基因的作用，了解植物花粉粒的形態(tài)在植物分類和花粉萌發(fā)能力方面具有積極的參考意義。花粉形態(tài)可用于研究植物分類，并已在秋海棠屬(Begonia)[1]、黃精屬(Polygonatum)[2]、楊梅屬(Maesa)[3]和薔薇屬月季組(R.sect.chinenses)[4]等的植物分類中得到利用?；ǚ鄣男螒B(tài)與花粉萌發(fā)能力顯著相關，萌發(fā)的花粉粒顯著大于未萌發(fā)的花粉粒[5-6]。正常發(fā)育的花粉雖然有輕微的凹陷，但整體飽滿，形狀規(guī)則，只有極個別花粉較癟；而敗育的花粉粒則基本呈皺扁三角形、癟三角形或不規(guī)則畸形[6]。因此，了解花粉粒的形態(tài)對于研究花粉離體萌發(fā)具有重要的意義。

雜交是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)植物新品種選育的主要手段，雜交育種的成功率與花粉活力的高低密切相關，選擇花粉活力高的品種作為父本，才能得到更多的雜交后代。現(xiàn)在，花粉活力檢測的方法有很多，常用的主要有TTC染色法、I2-KI染色法、醋酸洋紅染色法、過氧化物酶染色法，但染色法在實際運用中得到的結果與實際的結果有較大的偏差，而花粉離體萌發(fā)則更加接近于實際的結果，因此花粉離體萌發(fā)被認為是檢測花粉活力最可靠的方法[7]。在合適的溫度下，適宜的培養(yǎng)基組分能夠更好地促進花粉體外萌發(fā)。有關研究表明蔗糖、硼酸在花粉離體培養(yǎng)時對于花粉萌發(fā)和花粉管生長具有顯著的促進作用[8-9]。生長調(diào)節(jié)劑GA3、IAA和NAA也會影響花粉萌發(fā)和花粉管生長[10-12]。

七姊妹薔薇(RosamultifloraThunb.var.carneaThory)是薔薇科薔薇屬野薔薇(RosamultifloraThunb)的一個變種，重瓣花，粉紅色，花朵碩大，一枝七花或十花，具有很高的園林觀賞價值，廣泛用于城市道路、公園和庭院等綠化，深受人們喜愛。七姊妹薔薇具有較強的耐熱性[13]，是薔薇屬優(yōu)良的耐熱種質(zhì)資源，也是培育薔薇耐熱品種的優(yōu)良材料來源。對于七姊妹薔薇花粉萌發(fā)，已有研究表明10%蔗糖適宜七姊妹薔薇花粉的萌發(fā)，萌發(fā)率達84.2%[14]。但對于硼酸、蔗糖和植物生長調(diào)節(jié)劑對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響還未見報道。因此，本研究以七姊妹薔薇新鮮花粉為試驗材料，觀察花粉形態(tài)，探究蔗糖、硼酸、IAA、NAA和GA3對其花粉離體萌發(fā)的影響，以期為七姊妹薔薇花粉的活力檢測、雜交育種等研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用貴州大學校園內(nèi)的七姊妹薔薇花粉作為試驗的材料。參試七姊妹薔薇植株常規(guī)管理。于2021年5月17日選擇10株正常開花的健康成年植株，在其花朵開放當天每株取6個花苞，共60個花苞。其中，30個花苞取出花藥待其自然散粉備用，另外的花苞放入4 ℃的冰箱中保存，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉形態(tài)觀察

將新鮮花粉輕撒在樣品臺上后放置在離子濺射儀(MSP-mini)噴金10 s，在掃描電子顯微鏡(Hitachi TM4000 plus)下觀察拍照。選取3個視野，每個視野花粉數(shù)大于30，觀察花粉的外部形態(tài)，對每個視野中圓滿花粉和干癟花粉分別計數(shù)，計算圓滿花粉和干癟花粉分別占視野內(nèi)總花粉的比例，計算平均值；測量所選視野中所有花粉的縱軸長與橫軸長，計算花粉的平均縱軸長與橫軸長。

1.2.2 試驗設置

選用1%的瓊脂為培養(yǎng)基固化劑，設置4種蔗糖濃度梯度(50、 100、150、200 g/L)與3種硼酸濃度梯度(50、100 、150 mg/L)，采用完全隨機設計的二因素試驗討論蔗糖和硼酸2種因子對花粉萌發(fā)的影響情況，從其中選出七姊妹薔薇花粉萌發(fā)情況最佳的培養(yǎng)基作為基本的培養(yǎng)基。

在基本培養(yǎng)基中添加不同濃度(0.5、1、5、10、20 mg/L)的萘乙酸(NAA)、不同濃度(1、5、10、20、40 mg/L)的吲哚乙酸(IAA)以及不同濃度(20、40、60、80、100 mg/L)的赤霉素(GA3)，對照為不添加植物生長調(diào)節(jié)劑，討論每種植物生長調(diào)節(jié)劑對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)的影響。

1.2.3 花粉培養(yǎng)

將配置好的液態(tài)培養(yǎng)基加熱，迅速吸取液態(tài)培養(yǎng)基，滴在載玻片上，輕輕搖晃形成厚度均勻的液體薄層。待溫度適宜以后用毛筆蘸取少量的花粉均勻地彈撥于培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基放入帶有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿，隨后放入溫度已經(jīng)恒定的25 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，蔗糖和硼酸雙因素試驗培養(yǎng)4 h，植物生長調(diào)節(jié)劑試驗培養(yǎng)2 h。

1.2.4 花粉萌發(fā)率及花粉長度的測量

取出培養(yǎng)基，用紙巾擦去培養(yǎng)皿底部的水分，以免影響觀察時的清晰度。使用顯微鏡統(tǒng)計花粉萌發(fā)率和花粉管長度。在蔗糖和硼酸對花粉萌發(fā)影響的雙因素試驗中選取5個視野的花粉總數(shù)和萌發(fā)數(shù)計算萌發(fā)率，在萘乙酸(NAA)、生長素(IAA)、赤霉素(GA3)對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)影響的單因素試驗中選擇3個視野的花粉總數(shù)和萌發(fā)數(shù)計算萌發(fā)率，花粉管長度超過1/2花粉直徑者視為萌發(fā)；選擇3個不同的視野，每個視野隨機選擇5條花粉管測量花粉管長度，計算花粉管長度。

花粉管長度(μm)=測量的所有花粉管長度(μm)/測量的花粉粒數(shù)

花粉萌發(fā)率(%)=(視野內(nèi)萌發(fā)的花粉個數(shù)/視野內(nèi)觀察的花粉總數(shù))×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2010進行統(tǒng)計，使用R(R 4.0.4)語言aov函數(shù)進行方差分析、Duncan法進行多重比較和ggplot函數(shù)進行圖形制作，使用Adobe Photoshop(Illustrator CC)對圖形進行細微調(diào)整。

2 結果與分析

2.1 花粉外部形態(tài)

如圖1，七姊妹薔薇的花粉具有3個萌發(fā)溝，萌發(fā)溝的兩端基本到達兩極。平均極軸長(P)47.0 μm，平均赤道軸長(E)22.5 μm，為超長球形(P/E>2)。發(fā)育良好的花粉其表面光滑，形狀飽滿，為易于萌發(fā)的花粉。而發(fā)育不好的花粉則表現(xiàn)為干癟，萌發(fā)溝深而寬，形狀扭曲并且花粉較小，花粉萌發(fā)就較為困難。七姊妹薔薇93.2%的花粉光滑飽滿，僅有6.8%的花粉扭曲干癟。

圖1 花粉電子顯微鏡掃描圖

2.2 蔗糖和硼酸對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響

經(jīng)過方差分析發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入蔗糖對七姊妹薔薇的花粉萌發(fā)(圖2A)及花粉管生長(圖2B)均有極顯著的影響；加入硼酸對花粉萌發(fā)有顯著的影響，對花粉管生長影響不顯著。在蔗糖濃度為50、100和200 g/L時隨硼酸濃度的增加花粉萌發(fā)率降低，但在蔗糖濃度為150 g/L的情況下，花粉萌發(fā)率隨硼酸濃度的增加而增加，蔗糖與硼酸的交互作用對七姊妹薔薇的花粉萌發(fā)和花粉管生長均具有極顯著的影響。七姊妹薔薇花粉萌發(fā)率隨蔗糖濃度的增加先增加后降低，在蔗糖質(zhì)量濃度為150 g/L和硼酸質(zhì)量濃度為150 mg/L的培養(yǎng)基中七姊妹薔薇的花粉萌發(fā)率最高，達到72%。在蔗糖和硼酸對七姊妹薔薇花粉管生長影響的所有試驗處理中，有3個處理(蔗糖150 g/L+硼酸150 mg/L、蔗糖200 g/L+硼酸50 mg/L、蔗糖200 g/L+硼酸150 mg/L)顯著高于其他處理，花粉管長度分別達到838.7 、722.9和656.7 μm。綜上所述，在該試驗所設置的試驗處理中蔗糖150 g/L+硼酸150 mg/L對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)和花粉管生長效果最佳。

圖2 蔗糖和硼酸對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響

2.3.1 萘乙酸對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響

萘乙酸(NAA)不是七姊妹薔薇花粉體外萌發(fā)的必需物質(zhì)，七姊妹薔薇花粉在不含NAA的培養(yǎng)基中依然能夠萌發(fā)(萌發(fā)率為44%)，但是NAA濃度對花粉萌發(fā)有顯著影響(圖3A)。在NAA濃度為0 ～10 mg/L時，花粉萌發(fā)率隨NAA濃度的增加而增加；在濃度為1 ～10 mg/L時，花粉萌發(fā)率均高于CK，且在此濃度區(qū)間花粉萌發(fā)率與CK存在顯著差異(P<0.05)；在NAA濃度為10 mg/L時，花粉萌發(fā)率最高，為57%；NAA濃度在20 mg/L時，花粉萌發(fā)率顯著(P<0.05)低于對照組，萌發(fā)率僅為19%。NAA也會影響花粉管生長的速度(圖3B)，添加1 mg/L和5 mg/L的NAA，花粉管的生長長度增加，但是不顯著(P>0.05)；在NAA濃度在5 ～20 mg/L時花粉管長度隨NAA濃度的增加而下降，且在此濃度區(qū)間花粉管長度存在顯著差異(P<0.05)；NAA濃度在20 mg/L時，花粉管長度僅為149.9 μm，顯著低于對照組(P<0.05)。綜上所述，NAA濃度為10 mg/L時花粉萌發(fā)率達到最高，NAA對于花粉管生長沒有顯著促進作用且高濃度(20 mg/L)時反而起到抑制作用。

圖3 NAA對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響

2.3.2 生長素對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響

生長素(IAA)不是七姊妹薔薇花粉體外萌發(fā)的必需物質(zhì)，七姊妹薔薇花粉在不含IAA的培養(yǎng)基中依然能夠萌發(fā)(萌發(fā)率為44%)，但是IAA濃度對花粉萌發(fā)有顯著影響(圖4A)。在IAA濃度為0～1 mg/L時，花粉萌發(fā)率隨NAA濃度的增加而增加；在濃度為1 mg/L時，花粉萌發(fā)率顯著高于CK(P<0.05)，達到48%；在IAA濃度為1～40 mg/L時，花粉萌發(fā)率隨IAA濃度的升高而降低，且在濃度為20 mg/L時花粉萌發(fā)率顯著低于對照組(P<0.05)，為19%；添加40 mg/L的IAA時，花粉完全沒有萌發(fā)，抑制效果顯著。在本試驗所設置的IAA濃度梯度(1、5、10、20、40 mg/L)下，IAA對花粉管生長無顯著促進作用，且高濃度(40 mg/L)時反而起到強烈的抑制作用(圖4B)。綜上所訴，適合七姊妹薔薇花粉萌發(fā)的IAA濃度為1 mg/L。

圖4 IAA對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響

2.3.3 赤霉素對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響

赤霉素(GA3)不是七姊妹薔薇花粉體外萌發(fā)的必需物質(zhì)，七姊妹薔薇花粉在不含GA3的培養(yǎng)基中依然能夠萌發(fā)(萌發(fā)率為44%)，但是GA3濃度對其花粉萌發(fā)有顯著影響(圖5A)。在GA3濃度為0 ～60 mg/L時，花粉萌發(fā)率隨GA3濃度的增加而增加；在濃度為60 mg/L時，花粉萌發(fā)率顯著高于CK，達到64%；在GA3濃度為60～100 mg/L時，花粉萌發(fā)率隨GA3濃度的升高而降低，且在濃度為100 mg/L時花粉萌發(fā)率顯著低于對照組，僅為28%。在本試驗所設置的GA3濃度梯度(20、40、60、80、100 mg/L)下，GA3對花粉管生長無顯著促進作用(圖5B)。綜上所訴，適合七姊妹薔薇花粉萌發(fā)的GA3濃度為60 mg/L。

圖5 GA3對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響

3 討論與結論

每種花粉的形態(tài)及結構都有差別，其大小、形狀、萌發(fā)孔和花粉表面的花紋是研究植物分類的重要依據(jù)[15]?；ǚ鄣男螒B(tài)對于研究花粉的萌發(fā)有一定的指示作用，通常表現(xiàn)為發(fā)育異常的花粉，其花粉小、扭曲和干癟等。本試驗觀察了七姊妹薔薇花粉，發(fā)現(xiàn)90%以上的花粉形態(tài)光滑飽滿，具有較好的萌發(fā)基礎。

蔗糖是花粉萌發(fā)所需的重要物質(zhì)，在花粉的萌發(fā)過程中起到提供能量和調(diào)節(jié)滲透壓的作用。蔗糖濃度顯著影響花粉萌發(fā)和花粉管生長，這在油茶(Camelliaoleifera)[16-17]、白花栝樓(TrichosanthesdioicaRoxb.)[18]、桃(AmygdaluspersicaL.)[19]等植物中已經(jīng)得到驗證。蔗糖對花粉萌發(fā)的影響表現(xiàn)為低濃度促進，高濃度抑制，本試驗也得出相同的結果。硼在植物體中分布不均，以花中分布最多。在本試驗中發(fā)現(xiàn)硼酸對于七姊妹薔薇花粉的萌發(fā)具有顯著影響，在大巖桐(Sinningiaspeciosa)花粉的研究中也得出相同的結論[20]，但硼酸對七姊妹薔薇花粉管的生長影響不顯著，與大巖桐花粉的研究中的結果并不相同，并且發(fā)現(xiàn)蔗糖與硼酸的交互作用對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)及花粉管生長有顯著的影響，其萌發(fā)率和花粉管長度在150 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸時最高。表明七姊妹薔薇花粉萌發(fā)的過程中，硼酸的作用主要是協(xié)助蔗糖發(fā)揮作用。這可能是由于硼離子能與蔗糖形成絡合物，使糖易于通過質(zhì)膜在組織中傳輸，從而促進了糖的吸收與代謝。

植物生長調(diào)節(jié)劑是人工合成的具有和植物內(nèi)源激素功能相似的物質(zhì)，能調(diào)控植物體內(nèi)物質(zhì)代謝和生理功能。以往的研究中發(fā)現(xiàn)植物生長調(diào)節(jié)劑對花粉的萌發(fā)及花粉管生長具有一定的影響，如：對早黑寶葡萄(Vitisvinifera)[21]和黃刺玫(Rosaxanthina)[12]的研究表明低濃度的萘乙酸對花粉萌發(fā)有促進作用，當濃度增大時，抑制效果突出；楊谷良等[22]研究發(fā)現(xiàn)，萘乙酸對黃金梨(Pyruspyrifolia)花粉管的生長表現(xiàn)出抑制作用。本研究與前人的研究結果相似，低濃度的萘乙酸促進七姊妹薔薇花粉萌發(fā)，高濃度的萘乙酸抑制其的花粉萌發(fā)。

赤霉素對對花朵具有重要的意義，其不僅能作為開花抑制劑[23]，更能作為花粉萌發(fā)促進劑。研究表明，過高和過低的赤霉素都不利于棗(ZizyphusjujubaMill．)花粉的萌發(fā)和花粉管的生長，10 mg/L的赤霉素對棗花粉萌發(fā)的促進作用最顯著，1.0 mg/L的赤霉素對棗花粉管生長的促進作用最顯著[24]；新疆‘晚豐’巴旦木(Prunusdulcis‘Wanfeng’)花粉萌發(fā)和花粉管生長的最適赤霉素濃度為0.001 5%[25]；榆葉梅(Prunustriloba)花粉萌發(fā)和花粉管生長的最適赤霉素濃度為25.0～100.0 mg/L[26]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)60 mg/L的赤霉素最適合七姊妹薔薇花粉的萌發(fā)，與榆葉梅花粉萌發(fā)最適濃度有重合。但在赤霉素濃度為100 mg/L時七姊妹薔薇的花粉萌發(fā)明顯受到抑制作用，而在榆葉梅花中則是最適的濃度范圍，并且赤霉素不能顯著促進七姊妹薔薇花粉管的生長，但在棗和榆葉梅花中則能顯著地促進其花粉管生長?？偠灾嗝顾貙Σ煌ǚ勖劝l(fā)的作用并不相同，但都表現(xiàn)出低促高抑的大致規(guī)律。

吲哚乙酸對不同植物花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響結果不同。如：孫慧瑛等[27]和楊曉梅等[28]對不同植物花粉的研究表明，吲哚乙酸在低濃度條件下促進花粉萌發(fā)和花粉管生長,高濃度下則有抑制作用；吲哚乙酸對‘秦冠’蘋果(MaluspumilaMill.)花粉管生長沒有明顯的促進作用，隨吲哚乙酸濃度的增大其抑制效果更加顯著[29]。在本試驗中吲哚乙酸濃度為1 mg/L時最適合七姊妹薔薇花粉萌發(fā)，吲哚乙酸對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)具有低濃度促進，高濃度抑制的效果。吲哚乙酸對七姊妹薔薇花粉管生長無顯著影響。

本試驗觀察了七姊妹薔薇花粉的形態(tài)，研究了蔗糖與硼酸雙因素對花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響，得出如下結論：硼酸、蔗糖、萘乙酸、赤霉素和吲哚乙酸能促進七姊妹薔薇花粉萌發(fā)和花粉管生長，其最佳濃度分別為150 mg/L、150 g/L、10 mg/L、60 mg/L、1 mg/L。蔗糖和硼酸的交互作用對七姊妹薔薇花粉萌發(fā)和花粉管生長作用顯著，但其余因子之間是否具有交互作用還需進一步研究。這些結果可為七姊妹薔薇花粉活力檢測和以七姊妹薔薇作為父本雜交提供參考。