程磊，陳蔚濤，于曉麗

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部珠江中下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510380）

鯽（Carassius auratus）在中國分布廣泛，具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究價(jià)值[1]。2019 年，中國鯽年養(yǎng)殖產(chǎn)量約270 萬t，是最重要的淡水養(yǎng)殖對象之一[2]。魚類線粒體DNA 具有結(jié)構(gòu)緊湊保守、母系遺傳、進(jìn)化較快等特點(diǎn)，被廣泛用作群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)地理學(xué)研究中的分子標(biāo)記[3]。Takada 等[4]基于線粒體DNA 遺傳標(biāo)記揭示了鯽中存在兩大譜系，一支分布于日本列島，另一支分布于歐亞大陸除日本列島以外的地區(qū)，這兩大譜系內(nèi)又可分為若干亞譜系。Gao 等[5]在此基礎(chǔ)上增加了中國、越南等地的樣本，進(jìn)一步在大陸譜系內(nèi)識別出兩個(gè)新的亞譜系（C1 和C5）。上述工作比較全面地揭示了鯽的系統(tǒng)地理格局：日本譜系和歐亞大陸譜系最早分化；大陸譜系內(nèi)C1 分布于福建、越南等亞洲大陸南部；C2分布自東北亞直至歐洲的遼闊地域；C3 分布于臺(tái)灣島；C4 主要分布于琉球群島；C5 主要分布于長江中下游；C6 則在中國長城以南廣泛分布[4,5]。此外，陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)中亞和東北亞存在另一個(gè)獨(dú)特的譜系（C7）[6-9]。

2018 年，Rylková 等[10]揭示越南鯽中有兩個(gè)分化明顯的譜系，其中一支對應(yīng)于中國鯽，另一支則被稱為“越南譜系”。該研究還指出越南譜系內(nèi)部分為兩個(gè)亞譜系：一支分布于越南北部，向北可以到達(dá)中國的珠江流域和福建省等華南地區(qū)；另一支分布于越南的南部。此前，越南魚類學(xué)家認(rèn)為鯽屬（Carassius）在越南分布有一個(gè)獨(dú)特的物種C.argenteaphthalmus，該種以眼緣紅色為最顯著的特征。但是，Rylková 等[10]研究后認(rèn)為，C.argenteaphthalmus和越南譜系并非對應(yīng)關(guān)系，考慮到鯽的種內(nèi)表型變異較大，該種是否真實(shí)有效尚存疑。

Gao 等[5]的研究中并未分析檢測位于中國福建和越南之間的廣東、廣西等省區(qū)的鯽樣本；Rylková等[10]的研究雖然涉及到廣西的鯽樣本，但是并未與Gao 等采自福建的樣本加以比較[5,6]。在前人工作的基礎(chǔ)上，本文采集了廣東陽春、潮州和廣西博白等地鯽樣本，使得總的樣本覆蓋了越南及中國的福建、廣東、廣西等地。本文基于線粒體細(xì)胞色素B 基因（Mitochondrial cytochrome b，Cyt b），初步揭示了華南地區(qū)和越南鯽的遺傳分化，加深了對中國鯽譜系地理格局的認(rèn)識，為鯽種質(zhì)資源的保護(hù)與利用提供了數(shù)據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和總DNA 提取

本研究用到的樣本主要有三個(gè)來源：（1）作者從廣東陽春（24 尾）、潮州（2 尾）及廣西博白（10 尾）采集的樣本，共計(jì)36 尾；（2）Gao 等[5]采自福建、越南等地的樣本共計(jì)77 尾；（3）Rylková 等[10]采集的越南、廣西等地鯽樣本，共計(jì)33 尾。采集樣本時(shí)，剪取小塊的魚鰭組織，以酒精固定保存。在實(shí)驗(yàn)室中，以蛋白酶K 消化、酚-氯仿抽提總DNA[11]，純化后的DNA 溶于去離子水中，稀釋至約50 ng/μL 備用[8]。

1.2 線粒體DNA 變異檢測

線粒體Cyt b 基因擴(kuò)增引物為L14724（5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′）和H15915（5′-CT CCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′）[12]。PCR 反應(yīng)體系為30 μL，包含1×的Es-Taq MasterMix（康為世紀(jì)），正反向引物各0.3 μM，約50 ng DNA 模板。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；最后72℃終延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否為單一、清晰的目的條帶，陽性PCR 產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行純化及測序。

1.3 序列處理及數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果使用Clustal W 程序[13]進(jìn)行序列比對（alignment）。采用DnaSP V6[14]軟件計(jì)算單倍型數(shù)（Number of haplotypes）、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（Number of polymorphic sites）、單倍型多樣性（Haplotype diversity）和核苷酸多樣性（Nucleotide diversity）等參數(shù)。用Mega 7.0 軟件[15]計(jì)算序列的堿基組成、群體內(nèi)和群體間的平均遺傳距離；以鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建單倍型進(jìn)化樹。使用Arlequin 3.5 軟件[16]提供的分子方差分析（Analysis of Molecular Variance，AMOVA）檢測變異來源，樣本采用兩種不同的分組：（1）按照樣本的采集地，分為福建（FJ）、兩廣（LG）和越南（VN）三組；（2）按照樣本的譜系歸屬，分為C1A、C1B 和C1C 三組。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體Cyt b 基因遺傳多樣性

本研究共獲得146 尾鯽的線粒體Cyt b 基因部分序列，比對后得到的序列長747 bp，共檢測到32種不同的單倍型（表1），變異位點(diǎn)70 個(gè)，其中包含37 個(gè)簡約信息位點(diǎn)（parsimony informative sites），33個(gè)單變異位點(diǎn)（singleton variable sites）。觀察到堿基置換（substitutions）71 次，其中轉(zhuǎn)換（transitions）62次，顛換（transversions）9 次。平均堿基組成：C=28.25%、T=30.21%、A=27.39%、G=14.16% 。A+T 的含量（57.60%）高于G+C 的含量（42.41%），堿基組成存在偏倚?？偟膯伪缎投鄻有詾?.900±0.016，核苷酸多樣性為（1.686±0.847）%（表2）。

表1 鯽線粒體細(xì)胞色素b 單倍型變異的位點(diǎn)及在各群體中的分布Tab.1 The variable sites and population distribution of Cyt b haplotypes in goldfish Carassius auratus

表2 基于Cyt b 基因序列各類群的遺傳參數(shù)Tab.2 Genetic parameters of each group based on Cyt b gene sequences

2.2 單倍型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

為明確各單倍型的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，基于之前的研究結(jié)果[4,5,6-9]，以黑鯽（Carassius carassius）為外類群，將本研究鑒定的32 種單倍型加入后，基于Cyt b基因構(gòu)建了鯽屬的鄰接樹（Neighbor-joining，NJ）。樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和前人的研究結(jié)果基本一致，支持鯽可以分為日本譜系和亞洲大陸譜系兩大支系。本研究鑒定的32 種Cyt b 單倍型均屬于大陸譜系，但是分屬于6 個(gè)不同的亞譜系（圖1）。多數(shù)的單倍型屬于Gao 等[5]所發(fā)現(xiàn)的C1 譜系，但本研究的結(jié)果支持C1 實(shí)際分為3 個(gè)不同的亞譜系：譜系C1A 包含了Gao 等[5]采集自福建及本文采自廣東的部分樣本；譜系C1B 包含了Rylková 等[10]采自廣西和越南中北部及本文采自廣東的部分樣本；譜系C1C 則包含了Gao 等[5]和Rylková 等[10]分別采自越南中南部的樣本。余下的少數(shù)樣本（22/146）分屬于大陸譜系內(nèi)部三個(gè)已知的譜系（C2、C4 和C6）。

圖1 鯽基于Cyt b 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹Fig.1 Phylogenetic tree（Neighbor-joining）of goldfish Carassius auratus based on Cyt b sequences

2.3 群體遺傳分化分析

依據(jù)采樣地點(diǎn)信息將樣本分成福建（FJ）、兩廣（LG）、越南（VN）三個(gè)群體進(jìn)行分子方差分析（AMOVA）分析。結(jié)果顯示：三地的鯽有顯著的遺傳分化（Fst=0.444，P＜0.01），群體內(nèi)和群體間均有豐富的遺傳變異（表3）。兩兩群體間的Fst 為0.304～0.494間，各群體間均存在顯著的遺傳分化（P＜0.01），群體內(nèi)和群體間遺傳距離也較大（表4）。按照樣本的譜系歸屬分成C1A、C1B、C1C 三組進(jìn)行AMOVA 分析。結(jié)果顯示三個(gè)譜系間有著更為顯著的遺傳分化（Fst=0.885，P＜0.01），譜系內(nèi)遺傳變異明顯小于譜系間，表明大部分遺傳變異存在于譜系之間（表3）。

表3 基于線粒體Cyt b 基因序列的分子方差分析Tab.3 Analysis of molecular variance（AMOVA）based on Cyt b haplotypes

表4 基于線粒體Cyt b 基因單倍型群體間的遺傳分化系數(shù)Fst（對角線下方）、群體間的遺傳距離（對角線上方）及群體內(nèi)遺傳距離（對角線上）Tab.4 Population pairwise Fst（below diagonal，P＜0.01）,genetic distances among populations（above diagonal）and genetic distances within populations（on diagonal）based on Cyt b gene sequences

3 討論

本研究分析的146 尾從越南和我國華南地區(qū)采集的鯽樣本分屬于6 個(gè)鯽線粒體譜系，其中中國境內(nèi)的樣本分屬于5 個(gè)譜系，余下的1 個(gè)譜系分布限于越南的南部。福建、廣東、廣西采集的樣本多屬于C1A 或C1B，只有少數(shù)個(gè)體攜帶其他譜系的線粒體DNA。這部分個(gè)體所攜帶的線粒體譜系都有各自已知的集中分布區(qū)[4,5]，且與越南和華南地區(qū)相距較遠(yuǎn)。因此，本文認(rèn)為C1A 和C1B 是華南地區(qū)的土著類型，而C1B 和C1C 則是越南鯽的主要譜系，譜系C1B 即Rylková 等[10]鑒定出的越南北部譜系，越南南部的鯽則屬于另一個(gè)譜系（C1C）。Rylková 等[10]雖然注意到Gao 等[5]的論文，但是只將其中的越南樣本納入分析，忽視了Gao 等[5]采集的福建樣本，更沒有與已知的其他鯽譜系一并考察，因此該研究只注意到越南南部和北部的鯽屬于兩個(gè)不同的譜系。本研究系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn)，多數(shù)福建樣本屬于C1A，既不與越南南部（C1C）相同，也不屬于越南北部的譜系（C1B）。本研究結(jié)果顯示：譜系C1A 主要分布于福建，C1B 為越南北部類型，C1C 為越南南部類型，而兩廣地區(qū)則是C1A 和C1B 的交匯區(qū)。

本文直接采集的樣本不算多，但是綜合前人的研究，認(rèn)為上述觀點(diǎn)能夠反映這一區(qū)域的真實(shí)狀況。Gao 等[5]采集的、認(rèn)為同屬于C1 譜系的越南鯽樣本，攜帶的線粒體DNA 屬于越南南部類型（C1C），與上述觀點(diǎn)一致。而Rylková 等[10]指出越南南部和北部的鯽分別屬于不同線粒體DNA 譜系，其采集的廣西鯽樣本與越南北部鯽屬于同一譜系（C1B）。Rylková 等[10]也認(rèn)為C1B 向北可以達(dá)到中國南方。本文采集的兩廣樣本多數(shù)屬于C1A 或C1B，即一部分線粒體DNA 與福建鯽的主要譜系（C1A）相同，一部分與越南北部相同（C1B），也與上述觀點(diǎn)一致。不論是按照地理來源，還是線粒體DNA 譜系歸屬來劃分，本文所分析的鯽樣本均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。綜上所述，三項(xiàng)研究的獨(dú)立采樣分析結(jié)果是一致的，均符合本文指出的三個(gè)土著譜系的分布格局。

值得注意的是，除了上述三個(gè)主要的土著鯽譜系外，這一區(qū)域中還檢測到了一定比例的其他線粒體譜系。如福建群體中有約16%的個(gè)體屬于C4 譜系[5]，而本研究在兩廣地區(qū)采集的樣本中有少量的C2 和C6 譜系，甚至越南的樣本中也有少數(shù)個(gè)體屬于C6 譜系。鯽不同線粒體譜系有自己的集中分布區(qū)，但是也存在著一定的譜系混雜。這種譜系混雜即可能是自然過程，也可能是人類活動(dòng)引起的，或兩者共同作用的結(jié)果[4,5]。C4 譜系主要分布于琉球群島，同時(shí)在中國中東部地區(qū)也有分布。琉球群島現(xiàn)在雖然與亞洲大陸隔海相望，但是歷史上曾多次有陸橋相連接，與中國中東部地區(qū)的直線距離并不遙遠(yuǎn)[4,5]。福建群體中出現(xiàn)較高比例C4 譜系，推測主要是自然過程所致。至于C2 和C6 是在中國分布范圍最廣的鯽線粒體DNA 譜系[5]，我國養(yǎng)殖最廣泛的銀鯽和金魚，其線粒體DNA 就分屬于C2 和C6 譜系[4,5,17]。銀鯽和金魚養(yǎng)殖逃逸，對土著鯽造成威脅和遺傳污染已在國際上引起了關(guān)注[18-24]。本文認(rèn)為，在廣東、越南等地群體中出現(xiàn)C2 和C6 譜系的線粒體DNA，可能主要是人類活動(dòng)的結(jié)果。

本研究顯示：華南地區(qū)和越南共存在3 個(gè)土著的鯽線粒體譜系（C1A、C1B 和C1C），而不是之前認(rèn)為的1 個(gè)或2 個(gè)，進(jìn)一步揭示了鯽具有豐富的遺傳多樣性和復(fù)雜的系統(tǒng)地理格局，有助于鯽種質(zhì)資源的保護(hù)與利用。魚類線粒體DNA 母系遺傳、缺乏重組的特點(diǎn)，使得其難以解析多譜系混居群體的遺傳結(jié)構(gòu)，后續(xù)有必要利用微衛(wèi)星等核基因組遺傳標(biāo)記，進(jìn)一步探究不同地域鯽的遺傳結(jié)構(gòu)。