閆學(xué)春，欒培賢，吳學(xué)工

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

魚類種間、屬間的物種之間的雜交統(tǒng)稱為魚類遠(yuǎn)緣雜交。遠(yuǎn)緣雜交是常規(guī)育種中引進(jìn)可利用的優(yōu)良外源基因，提供種質(zhì)創(chuàng)新的有效途徑之一。它可以實現(xiàn)兩個物種間的基因轉(zhuǎn)移，使其后代的表現(xiàn)性狀和與表現(xiàn)型相關(guān)的基因組成發(fā)生改變，在魚類的遺傳育種和進(jìn)化中表現(xiàn)出重要作用[1]，也極大豐富了魚類的遺傳基礎(chǔ)，在魚類的育種領(lǐng)域中運用廣泛[2-12]。在魚類育種中，遠(yuǎn)（近）緣種屬作為改良魚類遺傳組成的一個巨大基因庫，蘊藏著許多對魚類改良極其有用的基因（如優(yōu)良蛋白質(zhì)、氨基酸品質(zhì)、抗病性等）。因此，利用遠(yuǎn)緣雜交將近（遠(yuǎn)）緣種屬有利基因?qū)媵~類，打破了其遺傳穩(wěn)定性，使雙親的有益性狀重新組合，可以大大拓展魚類的遺傳基礎(chǔ)，從中選出新品種和新種質(zhì)，對魚類遺傳理論研究和育種工作具有重要意義。但在遠(yuǎn)緣雜交的親本之間遺傳關(guān)系相對較遠(yuǎn)，甚至超遠(yuǎn)緣的物種間多基因復(fù)雜性狀（如數(shù)量性狀）的轉(zhuǎn)移比較難于實現(xiàn)，而魚類顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交（distant hybridization）技術(shù)彌補了遠(yuǎn)緣雜交的不足。該技術(shù)是將未經(jīng)遺傳修飾的外源總DNA 直接導(dǎo)入受體魚受精卵內(nèi)，越過了染色體數(shù)目不同存在著DNA 分子差異性排斥而造成的遠(yuǎn)緣雜交中親本的不親和性和子代不育等自然障礙，從而直接實現(xiàn)了基因水平的遠(yuǎn)緣雜交[13,14]。因此，顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)具有獲得鯉科魚類品質(zhì)改良新品種的可行途徑[15]。有關(guān)魚類外源總DNA 的導(dǎo)入技術(shù)已有過報道[16,17]。

魚類是重要的優(yōu)質(zhì)蛋白源，為人類提供了重要的食物來源。鏡鯉（Cyprinus carpio）屬鯉科鯉屬，自西德引進(jìn)，多棲息水域中下層，雜食性，鱗片少，體型較粗壯，生長速度快，含肉率高，適合在中國推廣養(yǎng)殖[18]。鱖（Siniperca chuatsi）屬真鱸科鱖屬，在中國南北方的水系里均有分布，生活在水清的江河湖泊的近底層，是典型的肉食性魚類，肉多刺少，肉潔白細(xì)嫩，呈蒜瓣狀，肉實而鮮美，是淡水魚中上等食用魚[19]。因此，將鱖的優(yōu)良基因?qū)腌R鯉體內(nèi)，對改善鏡鯉肉質(zhì)具有重要意義。本研究在檢測外源DNA確定整合的基礎(chǔ)上[20]，測定和評估了F1代顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉肌肉的營養(yǎng)成分和營養(yǎng)價值，可為開展魚類肉質(zhì)改良研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉

實驗魚取自1 齡F1代顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉和普通鏡鯉，每組魚各取30 尾，提取肌肉。顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的制作方法參照閆學(xué)春等（2011）[15]。

1.1.2 鱖基因組DNA 提取

在鱖的尾部抽取血液，采用酚/氯仿抽提法，55℃水浴消化，無水乙醇沉淀，TE 溶解，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。具體提取方法參見閆學(xué)春等（2018）[16,17]。

1.2 方法

1.2.1 外源基因?qū)?/p>

在當(dāng)年鏡鯉的繁殖季節(jié)，人工繁殖中采集高質(zhì)量的卵和精液，混合受精后，利用顯微操作儀對黏附在培養(yǎng)皿上的受精卵（第一次卵裂期）進(jìn)行顯微注射，注射量為1 nL[21]。

1.2.2 取樣方法

取實驗魚和對照魚兩側(cè)背部肌肉，去除表皮和鱗片，稱重，做好標(biāo)記，放入-40℃冰箱保存，備用。樣品的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分、水分和氨基酸含量均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（哈爾濱）測定。

1.2.3 常規(guī)營養(yǎng)成分測定

采用馬福爐灰化法（國家標(biāo)準(zhǔn)：GB5009.4-2010）測定灰分含量；采用索氏抽提法（國家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T5009.6-2003）測定粗脂肪含量；采用凱氏微量定氮法（國家標(biāo)準(zhǔn)：GB5009.5-2010）測定粗蛋白質(zhì)含量；采用直接干燥法（國家標(biāo)準(zhǔn)：GB5009.3-2010）測定水分含量。

1.2.4 氨基酸測定

對17 種氨基酸的測定，均采用國家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T5009.124-2003 鹽酸水解法測定。色氨酸在酸水解過程中被破壞而無法檢出。

1.2.5 營養(yǎng)評價

采用1973 年FAO/WHO 建議的雞蛋蛋白模式和氨基酸評分標(biāo)準(zhǔn)模式的比較，通過下方公式求得[22-25]，AAS（氨基酸評分）、CS（化學(xué)評分）和EAAI（必需氨基酸指數(shù)）。數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用t-檢驗法分析差異顯著性，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

式中，Sn為雞蛋蛋白質(zhì)的氨基酸；n 為比較的氨基酸數(shù)；tn為實驗蛋白質(zhì)的氨基酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要營養(yǎng)成分

實驗魚與對照魚的營養(yǎng)成分見表1 和圖1。由表1 可知，實驗魚的蛋白質(zhì)含量顯著高于對照魚（P＜0.05），而脂肪含量低于對照魚，無顯著差別（P＞0.05）。兩種魚灰分和水分含量基本一致，無顯著差別（P＞0.05）。

表1 F1 代顯微介導(dǎo)鱖魚基因鏡鯉與普通鯉的肌肉營養(yǎng)成分比較（/%鮮重）Tab.1 Comparison of muscle nutrition composition between the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control common mirror carp

圖1 顯微介導(dǎo)鱖基因的鏡鯉F1 代與普通鏡鯉的蛋白質(zhì)含量Fig.1 Protein content in the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

2.2 氨基酸

顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代的氨基酸總含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為79.77%，高于普通鏡鯉的74.53%，經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計分析，有顯著差別（P＜0.037）（表2）。其中谷氨酸（Glu）含量為所測的17 種氨基酸中含量最高（分別為12.78%和11.72%）。而含量較多的5 種氨基酸依次為谷氨酸（Glu）、天門冬氨酸（Asp）、賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）和精氨酸（Arg）。

表2 顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉F1 代與對照鏡鯉的氨基酸含量（g/100g DW）Tab.2 Amino acid contents in muscle in the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

在所測的17 種氨基酸（色氨酸除外）中，還包括人體必需的苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、亮氨酸（Leu）、蘇氨酸（Thr）和異亮氨酸（Ile）等7 種氨基酸[26,27]。顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代的必需氨基酸含量為32.71%，占氨基酸總量的41.01%；普通鏡鯉的必需氨基酸含量為30.48%，占氨基酸總量的40.90%。

顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代肌肉中鮮味氨基酸為天門冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly），其總含量（30.07%）占氨基酸總量的37.70%，普通鏡鯉的鮮味氨基酸總含量為28.12%，占氨基酸總量的37.73%。經(jīng)比較，顯微介導(dǎo)鱖基因鏡子代的4 中鮮味氨基酸含量和總量都高于普通鏡鯉，經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計分析，谷氨酸和天門冬氨酸差異顯著（P＜0.05）。有顯著差異的還有絲氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸和組氨酸（P＜0.05）（圖2、圖3）。

圖2 顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉F1 代與普通鏡鯉的4 種鮮味氨基酸比較Fig.2 Comparison of four kinds of flavor amino acid between the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

圖3 顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉F1 代與普通鏡鯉的5 種氨基酸比較Fig.3 Comparison of top five amino acid between the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

2.3 營養(yǎng)價值評定

以WHO/FAO 制定的雞蛋蛋白模式和氨基酸評分標(biāo)準(zhǔn)模式為標(biāo)準(zhǔn)[28-29]，分別計算實驗魚與對照魚的AAS、CS、EAAI（表3 和表4）。在氨基酸評分中，兩種魚的纈氨酸（Val）均為第一限制性氨基酸，蛋氨酸＋胱氨酸（Met＋Cys）均為第二限制性氨基酸；在化學(xué)評分中，兩種魚中的蛋氨酸＋胱氨酸（Met＋Cys）均為第一限制性氨基酸，纈氨酸（Val）為第二限制性氨基酸。實驗魚的必需氨基酸指數(shù)為73.64，高于對照魚的68.71。

表3 F1 代顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉與普通鏡鯉肌肉必需氨基酸含量Tab.3 Muscle essential amino acid contents in the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

表4 F1 代顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉與普通鏡鯉的AAS、CS 和EAAI 比較Tab.4 Comparison of amino acid score,chemical score and essential amino acid index between the F1 generation microinjected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

3 討論

3.1 顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代的主要營養(yǎng)成分

影響魚肉品質(zhì)的因素較多，主要包括遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境等，而粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分等在魚肌肉質(zhì)量的評價中起決定性作用。蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命的基本物質(zhì)，也是人類的主要食物成分，可以直接反映魚肌肉的營養(yǎng)價值。脂肪是人體熱能的重要來源，也是體內(nèi)脂肪酸的主要來源，灰分的含量則是肌肉中微量元素和礦物質(zhì)含量的標(biāo)志。本研究中，顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代的蛋白質(zhì)含量為18.69%，顯著高于普通鏡鯉17.45%（P＜0.05），而脂肪含量為2.63%，低于普通鏡鯉的2.93%，沒有顯著差別，灰分和水分與普通鏡鯉沒有差別。至于導(dǎo)致鏡鯉蛋白質(zhì)含量增高的原因，是否是整合進(jìn)入受體基因組的某段基因得到了表達(dá)，而表達(dá)的正是鱖控制蛋白質(zhì)合成的那段基因[30]，還有待進(jìn)一步分析驗證。

有關(guān)外源總DNA 導(dǎo)入對動植物蛋白的影響都有報道。如閆學(xué)春等[15,30]在導(dǎo)入未經(jīng)遺傳修飾的中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）總DNA 的鯉的粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照鯉，粗脂肪含量顯著低于對照鯉。在植物方面，如呂英海等[31]研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入大豆（Glycine max）總DNA 的大麥（Hordeum vulgare）籽粒中蛋白質(zhì)含量明顯提高，沒有發(fā)現(xiàn)表型變異現(xiàn)象。通過對顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的研究，也為改良魚類肌肉肉質(zhì)提供了一條新途徑。

3.2 顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代氨基酸含量分析和營養(yǎng)價值

氨基酸種類組成和含量是衡量魚類肌肉營養(yǎng)價值的體現(xiàn)。本研究結(jié)果表明，顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代的氨基酸總含量、鮮味氨基酸和必需氨基酸含量均顯著高于普通鏡鯉；谷氨酸、天門冬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和賴氨酸顯著高于普通鏡鯉（P＜0.05），而絲氨酸、纈氨酸和組氨酸差異極顯著（P＜0.01）。谷氨酸和天門冬氨酸是魚肉里鮮味的特征氨基酸，反映了魚類肌肉的鮮美程度。顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代的必需氨基酸含量與總氨基酸含量的比值（WEAA/WTAA）為41.01%，而WEAA（必需氨基酸含量）與WNEAA（非必需氨基酸含量）的比值為69.54%。根據(jù)FAO/WHO 的理想模式，質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)組成氨基酸的必需氨基酸含量與非必需氨基酸含量的比值在60%以上，而WEAA/WTAA為40%左右[32-36]，可見顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代肌肉中氨基酸的組成符合優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代肌肉必需氨基酸總量高于WHO/FAO 模式，低于雞蛋模式，而普通鏡鯉低于WHO/FAO 和雞蛋模式，說明顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代肌肉的必需氨基酸含量豐富，其組成和比例與標(biāo)準(zhǔn)接近。根據(jù)AAS 預(yù)測，顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代和對照鏡鯉肌肉的第一限制氨基酸都是纈氨酸，第二限制氨基酸都是蛋氨酸+胱氨酸；根據(jù)CS 預(yù)測，兩種魚的第一限制氨基酸都是蛋氨酸+胱氨酸，第二限制氨基酸都是纈氨酸。而第一限制氨基酸纈氨酸和蛋氨酸及人體第一限制性氨基酸賴氨酸在顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代中含量豐富，顯著高于對照鏡鯉，可在蛋白質(zhì)營養(yǎng)上對人體起到補缺作用。顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉子代和對照鏡鯉的必需氨基酸指數(shù)分別為73.64 和68.71，說明其蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值要高于對照鏡鯉。這表明，利用顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)將鱖基因組DNA 導(dǎo)入受體鏡鯉，通過兩種基因組水平的遠(yuǎn)緣雜交，而提高鏡鯉的氨基酸含量對改良鏡鯉肉質(zhì)，培育出鏡鯉養(yǎng)殖新品種提供了理論參考[30]。有關(guān)利用外源基因?qū)攵岣甙被岷康囊灿羞^報道。如閆學(xué)春等[37]將河蟹（Eriocheir sinesis）基因組DNA 導(dǎo)入鏡鯉后其子代肌肉中的氨基酸含量，均高于普通鏡鯉，兩種鏡鯉的第一限制性氨基酸都是纈氨酸,與普通鏡鯉相比較，顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉具有一定的營養(yǎng)優(yōu)勢。

成功的魚類轉(zhuǎn)基因主要是通過顯微操作將單一性狀的目的基因?qū)雴蝹€細(xì)胞，以改變受體魚的一些簡單性狀，如抗病性狀[38]、生長性狀等[39,40]，其結(jié)果往往比常規(guī)育種在后代的篩選工作中具有較強的目的性。而魚類的一些經(jīng)濟(jì)性狀，如數(shù)量性狀等多為多基因控制，尋找將一復(fù)雜性狀的多個基因同時導(dǎo)入到受體魚中，以達(dá)到引入新的多基因復(fù)雜性狀來達(dá)到改良性狀目的的新方法，必然具有實際的重要價值[41]。在顯微介導(dǎo)外源總DNA 轉(zhuǎn)移中，供體的外源DNA 能提供完整的基因信息，這為顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣或超遠(yuǎn)緣基因間的轉(zhuǎn)移，特別是魚類間性狀多而雜的多基因轉(zhuǎn)移提供了有力的條件[42,43]。本研究結(jié)果對于是否影響顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉更為精細(xì)和復(fù)雜的代謝變化，以及是否對蛋白質(zhì)合成與分解產(chǎn)生了影響，以及對這些基因系統(tǒng)的復(fù)雜和調(diào)節(jié)機(jī)理的了解，都還需要做進(jìn)一步的深入研究。

3.3 結(jié)論

本研究依靠顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將未經(jīng)遺傳修飾的鱖總DNA 導(dǎo)入鏡鯉受精卵內(nèi)并獲得子代。對顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的AFLP 分析和陽性片段的測序，在分子水平上證明了鏡鯉整合了鱖DNA。在確定其穩(wěn)定遺傳的基礎(chǔ)上，測定了顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉F1代和普通鏡鯉肌肉的營養(yǎng)成分。發(fā)現(xiàn)顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉F1代的氨基酸和蛋白質(zhì)含量均高于普通鏡鯉，且符合FAO/WHO 標(biāo)準(zhǔn)的要求。研究結(jié)果為顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的品質(zhì)改良提供科學(xué)的理論依據(jù)。