尚念杰， 劉宏宇， 陳夢姣， 桂 陽

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所， 貴陽 550006； 2.貴州省食用菌育種重點實驗室，貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究中心， 貴陽 550006； 3.貴陽護理職業(yè)學(xué)院， 貴州 貴陽 550006)

炭角菌屬于子囊菌綱、球殼目、炭棒科、炭角菌屬,其菌核幼嫩時可食用，成熟后稱為烏靈參，是一種名貴的中藥[1-2]。炭角菌科多為腐生菌，在系統(tǒng)學(xué)中具有重要價值，同時在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很大的開發(fā)潛能，其中很多炭角菌種類具有很高的藥用價值[3-4]。例如炭角菌多具有安神、止血和降血壓等功效，在失眠、心悸等病癥方面具有很好的治療作用[5]。黑柄炭角菌具有補氣、固腎、除濕和鎮(zhèn)靜安神功效[6]。有研究表明，不同炭角菌菌絲對碳氮源的利用和環(huán)境有不同的要求[7]。因此，探索不同炭角菌的生物學(xué)特性，對馴化、栽培及開發(fā)利用炭角菌具有重要意義。本研究旨在對野外獲得的一株炭角菌進行分離鑒定，并對其進行不同碳氮源條件下培養(yǎng)，探究該炭角菌在不同碳氮源條件下的生長情況。

1 材料與方法

1.1 菌株的鑒定

使用液氮研磨子實體至粉末狀，加1 mL CTAB混勻，65 ℃、60 min進行水浴(每5 min搖勻一次)，加DNA提取液(25∶24∶1)1 mL，混勻，室溫靜置5 min，離心(1 200 xg，15 min)，取上清至離心管[8]。使用DNA提取試劑盒(OMEGA，D 3195-02)提取分子標本的DNA。PCR擴增引物選擇ITS 1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)PCR擴增各野生菌物的ITS序列。PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)親緣相近菌株的ITS序列，然后通過CLUSTAL-X 2.0程序進行多重序列比對[9]。使用Neighbor-joining法通過使用MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10]。

1.2 不同碳源對蕉孢炭角菌菌絲生長速率的影響

本試驗供試碳源為葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉7種。以供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖的含碳量為標準，用等量含碳量的另外6種碳源分別代替，配置7種不同碳源的培養(yǎng)基，觀察不同碳源對蕉孢炭角菌菌絲生長的影響[11]。供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈣0.5 g，維生素B 1 100μg，瓊脂10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 不同氮源對蕉孢炭角菌菌絲生長速率的影響

本試驗供試氮源為硫酸銨、草酸銨、尿素、酵母粉、蛋白胨5種。以供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基蛋白胨含量為標準，用等量含氮量的另外4種氮源分別代替，配置5種不同氮源的培養(yǎng)基，觀察不同氮源對蕉孢炭角菌菌絲生長的影響。供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方同1.2。

1.4 菌絲的培養(yǎng)與觀察

將上述培養(yǎng)基配制好后，按常規(guī)方法滅菌、制平板，冷卻后在無菌條件下接種一塊6 mm的活化菌絲塊，接種后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期觀察菌絲特征，測量菌絲生長速度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

將菌株在NCBI進行blast比對后發(fā)現(xiàn)，該菌株與Xylariaallantoidea較為相似。在GenBank中與Xylariasp. GSM-1 (No. KP 204382)相似度為99.15%，與Xylariaallantoidea94042903 (No.GU 324743)相似度為99.06%，與XylariaallantoideaMEL 2382670 (No.KP 013033)相似度為98.70%。實驗室將該菌株命名為XylariaallantoideaGY-12，將其ITS序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫得到相應(yīng)的基因號為Accession No. MZ 597867。圖1為基于ITS序列制作的XylariaallantoideaGY-12的neighbor-joining進化樹。從圖中可以看出，菌株GY-12與菌株XylariaallantoideaMEL 2382670和XylariaallantoideaGAB 243在一個分支上，關(guān)系最為相近。因此，菌株GY-12是屬于Xylariaallantoidea一個種。

注：Bootstrap值表示為1 000次重復(fù)的百分比，Bar，0.01。圖1 基于菌株GY-12的ITS基因序列和系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)型菌株的NJ樹

2.2 不同碳源對蕉孢炭角菌GY-12菌絲生長的影響

通過表1得知，蕉孢炭角菌GY-12菌絲生長速度以果糖、麥芽糖為碳源生長最快，日均生長分別為4.24 mm和3.67 mm；乳糖最慢，日均生長僅為1.93 mm。以果糖、麥芽糖和乳糖為碳源的處理中，菌絲長勢較好，顏色潔白，菌絲濃密健壯。綜合生長速度和菌絲長勢，蕉孢炭角菌GY-12菌絲生長的最佳碳源是果糖和麥芽糖。

表1 不同碳源對蕉孢炭角菌GY-12菌絲生長速度的影響

2.3 不同氮源對蕉孢炭角菌GY-12菌絲生長的影響

通過表2看出，菌絲生長以酵母粉為氮源生長最快，日均生長為3.76 mm，效果最差的是硫酸銨和尿素，日均生長僅為0.57 mm和0.89 mm。菌絲長勢以酵母粉為氮源長勢最好，菌絲潔白、濃密健壯；硫酸銨和尿素最差，表現(xiàn)出菌絲細弱、稀釋、淺白，生長不育。綜合蕉孢炭角菌菌絲生長速度和菌絲長勢，5種氮源中最佳是酵母粉。

表2 不同氮源對蕉孢炭角菌菌絲生長速度的影響

3 討 論

本實驗為鑒定從野外獲得的一株炭角菌，并探究該炭角菌在不同碳氮源條件下的生長情況。研究表明，菌株GY-12與菌株XylariaallantoideaMEL 2382670和XylariaallantoideaGAB 243在一個分支上，關(guān)系最為相近，是Xylariaallantoidea的一種。在供試的7種碳源中，菌株GY-12都能夠利用，但在實驗中發(fā)現(xiàn)，菌絲生長最適碳源為果糖和麥芽糖，說明菌株GY-12的菌絲對醛糖較容易吸收利用。在供試的5種氮源中，菌絲生長最適氮源為酵母粉，最差氮源為硫酸銨和尿素。硫酸銨的效果差，可能是由于硫酸銨中隨著銨離子優(yōu)先被利用而引起pH值下降，使得菌絲生長減弱；由于尿素經(jīng)高溫處理后易分解，放出氨和氫氰酸，致使培養(yǎng)基的pH值升高，造成對菌絲生長的抑制。在后期可以設(shè)計最佳方案以獲取菌株GY-12的最適培養(yǎng)基，同時對其菌絲進行液相質(zhì)譜分析，為后續(xù)的藥理生物活性研究奠定基礎(chǔ)。