郭金梅，魏淑英，李得鑫，高錄軍

(1.濰坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東濰坊 261000；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061；3.山東華農(nóng)生物制藥有限公司，山東濰坊 262000)

炎癥是機(jī)體對感染、組織損傷及傷害性刺激等做出的保護(hù)性反應(yīng)[1]。表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛及功能障礙，在一定范圍內(nèi)可提高機(jī)體抵抗力，但持續(xù)炎癥反應(yīng)會(huì)對機(jī)體造成損傷，攻擊自身組織，影響動(dòng)物機(jī)體的健康[2]，炎癥反應(yīng)也是一些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)[3]。復(fù)方楊樹花口服液在楊樹花口服液的基礎(chǔ)上進(jìn)行復(fù)方改良，以期解決動(dòng)物體腸道炎癥問題。因此，試驗(yàn)通過預(yù)先使用復(fù)方楊樹花口服液，對小鼠耳腫脹、足趾腫脹和血清中TNF-α，IL-1，IL-6分泌量的影響，以探究復(fù)方楊樹花口服液的體內(nèi)抗炎效果。為進(jìn)一步開發(fā)復(fù)方楊樹花口服液的藥理作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥品 復(fù)方楊樹花口服濃度1 g/ml(生產(chǎn)批號：20200402)，由濰坊富言中藥研發(fā)有限公司提供；阿司匹林片(生產(chǎn)批號：A100601)，購自山西云鵬制藥有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠120只，雄性，體重(30±2 g)，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司(動(dòng)物許可證號SCXK(京)2020-0002)。

1.3 主要試劑 二甲苯(生產(chǎn)批號：20190325)，購自南京試劑公司；LPS(生產(chǎn)批號：084M4159V)，購自Sigma公司型號L2880；TNF-α(生產(chǎn)批號：P131773)，IL-1(生產(chǎn)批號：338392)，IL-6(生產(chǎn)批號：333552)ELISA試劑盒，購自RD公司。

1.4 主要儀器 打孔器，購自河南智科弘潤環(huán)保科技有限公司；分析天平，購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；高速離心機(jī)，購自上海安亭科學(xué)儀器廠，CKX41光學(xué)顯微鏡，購自O(shè)lympus公司，全波長酶標(biāo)儀購，自Bio-Tek公司。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

1.5.1 小鼠耳廓腫脹試驗(yàn) 取雄性小鼠40只，隨機(jī)分為5組，8只/組，分別是空白對照組(生理鹽水：6 mL/kg)，陽性對照組(阿斯匹林:200 mg/kg)和給藥組(高劑量組(12 mL/kg)、中劑量組(6 mL/kg)、低劑量組(3 mL/kg))，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥45 min后，左耳涂抹二甲苯20 μL/只，右耳對照，40 min后脫頸椎處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用打孔器(8 mm/直徑)分別在左右耳同一部位打下圓耳片，稱重，每只鼠左右耳片重量之差值作為耳腫脹度，計(jì)算各組腫脹率。

1.5.2 小鼠足趾腫脹率試驗(yàn) 取雄性小鼠40只，試驗(yàn)分組與給藥同1.5.1。末次給藥45 min后，右后足足跖中部皮下注射0.1 mL 1%雞蛋清致炎。于致炎前和致炎后30 min，60 min，120 min按容積法測定每鼠右后肢正常足容積，計(jì)算足跖腫脹率及足腫脹抑制率。

1.5.3 體內(nèi)炎癥因子的檢測 取雄性小鼠40只，隨機(jī)分為5組，8只/組，分別是空白對照組，陽性對照組(LPS:15 mg/kg)和給藥組高劑量組(12 mL/kg)、中劑量組(6 mL/kg)、低劑量組(3 mL/kg)，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥6 h后，除空白對照組外，各組均以15 mg/kg劑量的LPS進(jìn)行腹腔注射，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。各組于腹腔注射LPS 12 h后，摘眼球采血，分離血清。ELISA測定小鼠血清中TNF-α，IL-1，IL-6 含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小鼠耳廓腫脹度的影響 由表1可知，與空白組相比，阿司匹林組與高、中、低劑量復(fù)方楊樹花口服液組均能顯著抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹(P<0.01)，且高劑量復(fù)方楊樹花口服液與阿司匹林效果相似(P>0.05)。

表1 復(fù)方楊樹花口服液對小鼠耳腫脹度的影響

2.2 對足趾腫脹度的影響 由表2可知，與空白對照組相比，復(fù)方楊樹花口服液三個(gè)劑量組在30 min、60 min、120 min均能顯著抑制1%蛋清引起的小鼠足趾腫脹(P<0.01或P<0.05)。并且在60 min～120 min小鼠足趾腫脹度達(dá)到峰值。高、中劑量復(fù)方楊樹花口服液能達(dá)到阿司匹林相似效果(P>0.05)，但高劑量效果更好。

表2 復(fù)方楊樹花口服液對小鼠足趾不同時(shí)間段腫脹度的影響

2.3 對小鼠血清炎癥因子的影響 由表3可知，與空白對照組相比，LPS能極顯著性提高小鼠血清中TNF-α，IL-1β，IL-6的分泌量(P<0.01)，提前使用高劑量的復(fù)方楊樹花口服液能極顯著性抑制TNF-α，IL-1β，IL-6的異常分泌，與空白對照組差異不顯著(P>0.05)，提前使用低劑量的復(fù)方楊樹花口服液能顯著抑制TNF-α，IL-1β，IL-6的異常分泌(P<0.01)，但與空白對照組相比差異仍然顯著(P<0.01)。

表3 復(fù)方楊樹花口服液對小鼠血清中TNF-α，IL-1β，IL-6分泌量的影響

3 討論與結(jié)論

復(fù)方楊樹花口服液由蒼術(shù)、陳皮、厚樸、黃連、黃柏、柴胡、梔子、楊樹花組成，主要功效燥濕解毒、芳香醒脾。試驗(yàn)采用二甲苯耳廓涂抹、蛋清足部注射、LPS腹腔注射的方法建立小鼠炎癥模型，以阿司匹林作為西藥對照，觀察復(fù)方楊樹花口服液的抗炎作用。用二甲苯進(jìn)行耳腫脹實(shí)驗(yàn)，可增加毛細(xì)血管的通透性，使?jié)B入組織的液體增多，小鼠耳朵會(huì)出現(xiàn)紅腫[4]。耳廓腫脹度試驗(yàn)結(jié)果表明，阿司匹林能有效預(yù)防二甲苯引起的耳廓炎癥反應(yīng)，與王飛等研究相同[5]。12 mL/kg的復(fù)方楊樹花口服液也可預(yù)防炎癥反應(yīng)的發(fā)生，但隨著藥物濃度的降低效果變差。異體蛋白致腫法是制備急性炎癥模型的常用方法[6]，異體蛋白進(jìn)入機(jī)體后可在短時(shí)間內(nèi)引起組織的急性炎癥反應(yīng)，發(fā)生炎癥的部位明顯腫脹、體積增大，產(chǎn)生紅、腫、熱、痛等致炎癥狀[7]。足趾腫脹度試驗(yàn)結(jié)果表明，注射0.1 mL 1%蛋清后，在60 min～120 min內(nèi)小鼠足趾腫脹度達(dá)到峰值，30 min時(shí)，阿司匹林與各劑量復(fù)方楊樹花口服液均能起到良好抗炎作用，但60 min～120 min時(shí)，阿司匹林與低劑量復(fù)方楊樹花口服液效果下降，說明阿司匹林在60 min后體內(nèi)藥物濃度降低，復(fù)方楊樹花口服液抗足趾腫脹度需灌胃6 mL/kg以上。

小鼠腹腔注射LPS建立的小鼠炎癥模型具有方便、穩(wěn)定的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，LPS能引起小鼠巨噬細(xì)胞分泌大量的炎癥因子到血清中[8]。TNF-α是一種腫瘤壞死因子，能誘導(dǎo)多種炎癥因子產(chǎn)生，使細(xì)胞凋亡，其表達(dá)量的多少可以直接反映炎癥的嚴(yán)重程度[9]。IL-6和IL-1β也是炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)，過多的表達(dá)會(huì)引起一系列的炎性損傷[10]。有研究發(fā)現(xiàn)對脂多糖誘導(dǎo)的急性炎癥小鼠模型都有明顯的保護(hù)效應(yīng)的藥物，多數(shù)能明顯抑制小鼠血清和肝臟中炎癥因子釋放，使急性炎癥得到有效逆轉(zhuǎn)[11]。因此，抑制血清炎癥因子釋放和臟器巨噬細(xì)胞活化是發(fā)揮抗炎作用的重要指標(biāo)[12]。血清炎癥因子試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)方楊樹花口服液能顯著性降低LPS誘導(dǎo)的炎癥小鼠血清內(nèi)TNF-α，IL-1，IL-6 含量(P<0.01 orP<0.05)，可見，復(fù)方楊樹花口服液對LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥模型有保護(hù)效應(yīng)，但濃度越低，效果越差。

綜上所述，試驗(yàn)初步證實(shí)復(fù)方楊樹花具有抗炎的效果，但其分子機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步探究。