李 滬，韓明明，詹 煒，劉 峰，謝慶平，徐萬土，樓 寶

(1.浙江海洋大學水產(chǎn)學院，浙江舟山 316022；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院水生生物研究所，浙江杭州 310021；3.象山港灣苗種有限公司，浙江寧波 315799)

光譜除能夠影響大多數(shù)魚類的生長、發(fā)育、激素分泌、免疫等過程外[1-4]，對胚胎畸形和孵化時長等方面同樣具有物種特異性影響，如大菱鲆Scophthalmus maximus胚胎在藍光下心跳比在其他光譜下提早半小時出現(xiàn)，并且綠光下初孵仔魚的畸形比例明顯高于其他光譜處理組[5]。大西洋鳙鰈Hippoglossus hippoglossus(Linnaeus,1758)胚胎在黑暗下2 d 之內(nèi)完成出膜，在紅光或橙光下將延長至4 d，在藍光或者白光下需要的時間則更長[6]。在一些魚類如大菱鲆、歐洲鰻鱺Anguilla anguilla中發(fā)現(xiàn)光譜組成對胚胎孵化率沒有影響[5,7]，但是在其他魚類中是否同樣如此尚不清楚。

胚胎自母源傳遞途徑獲得的免疫因子如IgM 和C3 對保護胚胎在孵化過程中抵抗外界水體病菌的入侵具有重要保護作用[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)上述免疫因子除以蛋白形式外，還可以mRNA 的形式進行母源傳遞并在發(fā)育過程中進行轉(zhuǎn)錄和翻譯[10]。TGF-βs(Transforming growth factor βs)在一系列免疫過程如T 細胞和B細胞分裂[11-12]，淋巴細胞對高內(nèi)皮微靜脈細胞附著[13]及單核細胞內(nèi)細胞因子翻譯[14-15]中起抑制作用。在對虹鱒Oncorhynchus mykiss頭腎巨噬細胞的研究中發(fā)現(xiàn)TGF-β1 與呼吸爆發(fā)有關[16]。Interleukin-1 是重要的促炎性細胞因子，通過上調(diào)或下調(diào)其他細胞因子來導致炎性反應發(fā)生[17]，其中魚類中IL-1β 主要在激活T細胞過程中發(fā)揮作用[18]。對于光譜是否影響胚胎發(fā)育過程中免疫因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯尚不得而知。除免疫因子外，生物節(jié)律調(diào)控相關基因同樣自胚胎階段開始表達，如斑馬魚Danio rerio胚胎中節(jié)律系統(tǒng)組成基因period1自受精第一天開始自主轉(zhuǎn)錄，但是其表達水平的節(jié)律變化需要隨外界溫度波動來調(diào)節(jié)，另外2 個節(jié)律調(diào)控相關基因clock1和bmal1的轉(zhuǎn)錄變化則需要光照：黑暗的周期轉(zhuǎn)換來完成調(diào)整[19]。另外，前人研究認為溫度和光照主要分別影響孵化時長和孵化率大小[20]，但在光譜影響下節(jié)律調(diào)控關鍵基因的表達存在何種變化尚沒有說明。

大多數(shù)魚類胚胎因其視網(wǎng)膜尚未發(fā)育完善而不具備感光能力，此時腦部在介導外界光環(huán)境的過程中起重要作用[21]。黑視蛋白(melanopsin)是一種非視覺類視蛋白，具有感光特性[22-23]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該蛋白在魚類大腦中具有分部位點多、表達形式多樣的特點，如在鳙鰈的間腦、后腦、間-后腦間隙、視頂蓋和松果體部位均發(fā)現(xiàn)opn4m1,opn4m3,opn4x1和opn4x2分布[24]。同樣在斑馬魚胚胎腦部不同部位存在opn4xa,opn4a和opn4b表達[25]。目前普遍認為黑視蛋白能誘導哺乳動物由光引發(fā)的生物節(jié)律行為，如在小鼠中已經(jīng)證明該蛋白與光引起的節(jié)律調(diào)控變化密切相關[26]，在硬骨魚類中如斑馬魚中同樣發(fā)現(xiàn)該蛋白與“光動反應”和急性反應存在明確聯(lián)系[27]，在大西洋鳙鰈中同樣發(fā)現(xiàn)該蛋白可能參與胚胎組織發(fā)育調(diào)控過程[28]，在魚類胚胎中黑視蛋白是否具有類似作用及作用模式尚不明確。

目前光譜對海水魚類胚胎的影響研究主要集中在底棲的鲆鰈魚類如大西洋庸鰈和大菱鲆中，而在中上層海水養(yǎng)殖魚類中尚沒有相關研究。小黃魚Larimichthys polyactis是我國歷史上“四大海產(chǎn)”之一，具有可觀的養(yǎng)殖前景。與鲆鰈魚類不同，該魚主要生活在中上層海域[29]。為進一步揭示光譜影響魚類胚胎發(fā)育的主要過程并揭示黑視蛋白和節(jié)律調(diào)控系統(tǒng)在響應外界光譜中的作用，筆者以小黃魚為材料，通過對不同的光譜環(huán)境下胚胎孵化率、孵化時長、免疫水平等方面進行比較，并通過熒光定量表達技術對melanopsin和clock的表達進行相對定量來探索光譜影響魚類胚胎孵化的主要過程機制，同時為實際生產(chǎn)中的光譜運用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

實驗由6 組不同光譜(紅光，red：660～670 nm；藍光，blue：455～465 nm；綠光，green：515～525 nm；白光，full：400～780 nm)及黑暗(dark)和自然光照(natural)組成，每組有3 個重復(n=3)(圖1)，不同光譜的特定波段由定制的LED 燈(無錫華兆泓光電科技有限公司，www.ledhzh.com)提供。不同光譜組之間用不透光的塑料紙隔開。每個養(yǎng)殖桶(h=1.50 m，d=0.80 m，水深：0.60 m)中放置一個孵化網(wǎng)兜(d=h=0.30 m),并且在網(wǎng)兜內(nèi)布1 000 粒受精卵，受精卵由寧波象山港灣苗種有限公司提供。在養(yǎng)殖桶上方懸掛實驗用燈并用遮光簾將燈和養(yǎng)殖桶遮蓋，利用光譜儀(Everfine,PLA30)測量并調(diào)整LED 燈的旋鈕使得每個養(yǎng)殖桶水面的光通量均為(1.76±0.04) μmol·m-2·s-1。實驗水溫為18±1 ℃，光照周期為24 L：0 D，鹽度為24±0.5。

圖1 不同光譜影響小黃魚胚胎孵化實驗現(xiàn)場設計Fig.1 The site design of embryo incubation of L.polyactis under different spectra

1.2 取樣及處理

每2 h 從每個養(yǎng)殖桶里的孵化兜中隨機取20 粒受精卵并在體視顯微鏡(萊卡，S9D，德國)下觀察和拍照，直至孵化完成，并隨后用液氮將所取的胚胎進行固定。孵化完成后統(tǒng)計各實驗組的孵化率和孵化時長。分析各組在各取樣點的發(fā)育時期，從而確定各組的發(fā)育進度。

免疫因子測定：按照試劑盒操作方法對液氮凍存的各組出膜前(51 hpf)胚胎(n=60 粒)中免疫因子(IgM、C3、TGF-β 和IL-1β)含量水平進行分析(默沙克，武漢)。

基因表達分析：

(1)RNA 提取：按照Trizol 方法進行，主要步驟如下：自液氮中取出液氮凍存的51 hpf 胚胎100 mg 置于1.50 mL 離心管中，加入1 mL Trizol 充分勻漿，室溫靜置5 min 后加入0.2 mL 氯仿，振蕩15 s，室溫靜置15 min；4 ℃離心，12 000 r·min-1×15 min，取上清；加入等體積異丙醇，將管中液體輕輕顛倒混勻，室溫靜置10 min；4 ℃離心，12 000 r·min-1×15 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4 ℃離心，12 000 r·min-1×15 min，棄上清并重復1 次；室溫干燥，加入3～50 mL DNAsae/RNAsae Free H2O，溶解后得到樣品RNA。通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA 的質(zhì)量，并利用微量分光光度計(Nanodrop 2 000，美國)測定RNA 樣品的濃度。

(2)RNA 反轉(zhuǎn)錄：利用翌圣試劑盒(翌圣，中國，編號：11141ES60)完成，過程如下：①去除殘留基因組DNA：配制混合液，其中5 g DNA digester Mix 3 μL,total RNA 1 μg,用RNase free H2O 補足至15 μL，用移液器輕輕吹打混勻。42 ℃孵育2 min。②往①的反應管中直接加入5 μL 4×HifairⅢSuperMix plus，用移液器輕輕吹打混勻。按照如下程序進行反轉(zhuǎn)錄：25 ℃，5 min；55 ℃，15 min；85 ℃，5 min。

(3)熒光定量PCR 實驗：設計并委托相關試劑公司進行合成引物(表1)，以actin 為內(nèi)參基因，以自然光組為對照組，利用熒光定量PCR 技術對各組孵化后期(51 hpf)胚胎中的melanopsin和clock基因的相對表達水平進行檢測和相對定量分析。該實驗利用試劑盒(諾唯贊，中國，編號：Q411-03)完成并按以下程序進行：預變性：95 ℃，30 s；循環(huán)反應：95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；40 個循環(huán)。

表1 熒光定量PCR 引物細節(jié)一覽表Tab.1 The list of primer details for the relative real-time quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Graphpad Prism 8 軟件的“One-way ANOVA analysis”對不同實驗組進行組間孵化率及相關基因表達的顯著性差異分析，并完成圖表制作。以P＜0.05 為顯著差異(*)，P＜0.01 為非常顯著(**)，P＜0.001 為極其顯著(***)。

2 實驗結果

2.1 不同光譜下小黃魚胚胎發(fā)育速度

對同一時間點下各組胚胎照片進行統(tǒng)計和比較，我們發(fā)現(xiàn)各光譜組間胚胎發(fā)育快慢有明顯區(qū)別。經(jīng)選取，以組間發(fā)育差異明顯的13、24、29、40 和51 hpf 為關鍵點進行分析(圖2 和表2)。

表2 在下列時間點各組胚胎處于當前發(fā)育階段的百分率(%)Tab.2 The ration of the embryo at the current stage at the following time points (%)

圖2 不同光譜組胚胎發(fā)育速度不同F(xiàn)ig.2 The embryonic development speed was different among the spectra groups

各組從13 hpf 已經(jīng)可見明顯的孵化速度差異，如此時紅光組已有80% 胚胎進入高囊胚期，自然光組和黑暗組則分別有75.00%和73.68%的胚胎進入該發(fā)育階段，而綠光組和藍光組分別只有47.61%和27.27%的胚胎處于高囊胚期階段。

24 hpf 時，紅光組和黑暗組的幾乎全部胚胎進入原腸晚期，而其他4 組進入該時期的胚胎不到50%。29～51 hpf 階段內(nèi)各組胚胎依次進入眼囊期、尾芽期和心跳期，此時組間胚胎發(fā)育進度差異逐漸明顯，尤其在40 hpf 時，紅光組和黑暗組胚胎已分別有98%和93.20%的胚胎進入尾芽階段，同時進入該時期的自然光組和全光組胚胎所占比例分別為55.75%和68.75%，而藍光組和綠光組尚沒有胚胎進入該時期。從62 hpf 開始各組胚胎逐漸開始出膜，其中首次在紅光組、黑暗組和全光組中觀察到出膜仔魚。

2.2 不同光譜組胚胎孵化率

實驗發(fā)現(xiàn)各組小黃魚胚胎在本實驗條件下經(jīng)過約62 h 開始出膜，但各組孵化率各不相同(圖3)。孵化率方面，紅光組胚胎孵化率最高，為49.56%，其他各組由高到低依次為黑暗組(38.66%)、全光組(31.46%)、自然光組(31.25%)、綠光組(30.72%)和藍光組(29.58%)。顯著性差異方面，除自然光組與全光組、全光組與綠光組、綠光組與藍光組及自然光組與綠光組之間沒有顯著差異外，其他各組間均差異顯著。

圖3 不同光譜下小黃魚胚胎孵化率不同F(xiàn)ig.3 The hatching rate was different when under different spectra

2.3 不同光譜下小黃魚胚胎免疫水平

對出膜前(51 hpf)6 組胚胎中免疫球蛋白(IgM)、補體C3、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β、白介素IL-1β 的含量水平進行測定，結果發(fā)現(xiàn)光譜對上述指標同樣存在不同影響(圖4)。其中紅光組胚胎中IgM 含量水平顯著高于其他組，其他各組從高到低依次為自然光組、綠光組、全光組和藍光組。其中藍光組與綠光組、全光組與綠光組、全光組與藍光組之間差異不顯著。自然光組、綠光組和全光組中的C3 水平高于黑暗組、藍光組和紅光組。TGF-β 和IL-1β 在不同實驗組間同樣存在顯著差異，兩者均在自然光組中含量最高，其次在藍光組和綠光組中的含量也高于黑暗組和紅光組。

圖4 51hpf 時小黃魚各組胚胎中IgM、C3、TGF-β 和IL-1β 的含量比較Fig.4 The comparison of the concentration of IgM,C3,TGF-β and IL-1β in the embryo of L.polyactis at 51 hpf

2.4 不同光譜影響下小黃魚胚胎melanopsin 和clock 的表達水平

熒光定量real time-PCR 實驗結果顯示，黑視蛋白基因melanopsin及節(jié)律調(diào)控基因clock在不同實驗組中的相對表達水平均存在顯著性差異，其中melanopsin在藍光組中表達水平最高，其余由高到低依次為全光組、綠光組、黑暗組和紅光組(圖5-A)。clock在紅光組中表達水平最高，其余各組表達水平由高到低依次為全光組、黑暗組、綠光組和藍光組(圖5-B)。

圖5 51 hpf 時不同光譜下小黃魚胚胎中melanopsin 和clock 基因的相對表達情況Fig.5 The relative expression of melanopsin and clock in the embryo of L.polyactis at 51 hpf under different spectra

3 討論

3.1 光譜能夠影響小黃魚胚胎孵化率、孵化時長

不同魚類由于生活水層不同，其所處的光譜組成也不盡相同，在對環(huán)境長期適應的過程中其各自進化出適合自己的光譜感知系統(tǒng)及最適波長范圍[30]。本實驗發(fā)現(xiàn)，紅光組胚胎孵化率和發(fā)育速度明顯高于其他組，黑暗組胚胎孵化率和發(fā)育速度介于紅光組和其他組(自然光組、全光組、綠光組和藍光組)之間，藍光組胚胎孵化率及發(fā)育速度均低于其他光譜組，說明紅光能夠加快小黃魚胚胎發(fā)育及提高孵化率，而藍光則對該過程具有抑制作用。自然光和全光是混合光，可能由于各光譜的復合效應而使得該兩組胚胎的孵化率及發(fā)育速度在6 個實驗組中居中。以往有觀點認為魚類胚胎的孵化時長或者進程快慢主要取決于溫度，而孵化率的高低則主要取決于光照條件[20]，我們的實驗結果顯示光譜環(huán)境除能影響孵化率外，對胚胎發(fā)育快慢同樣具有顯著差異影響，這一點在吳樂樂等[5]對光譜影響大菱鲆胚胎孵化的研究中同樣得到證明。小黃魚屬于暖溫性近底層魚類，生活在水深不超過100 m 的海區(qū)[29]，其產(chǎn)卵場主要在50 m 以內(nèi)的淺海域[31]，其受精卵為浮性卵，長波長的光線如紅光因攜帶能量低只能穿透很淺的水域，并且極易在表層水域處發(fā)生反射和散射，而短波長的光線如藍光因攜帶能量大能穿透到100 m 水深處甚至更多[32]。本實驗中紅光下胚胎孵化率最大，胚胎發(fā)育快于其他實驗組，說明在長期對環(huán)境的適應過程中，小黃魚胚胎在孵化過程中有可能進化出了區(qū)別于鲆鰈類的趨向以長波長的光為最適光譜的感知系統(tǒng)。

3.2 光譜能夠影響小黃魚胚胎免疫分子的轉(zhuǎn)錄和表達

母源傳遞現(xiàn)象存在于包括魚類在內(nèi)的許多物種中。魚類通過該過程可以將營養(yǎng)和免疫成分傳遞到未受精卵中，后者通過和精子結合進而將這些營養(yǎng)和免疫組分傳遞到受精卵中。卵膜作為第一道免疫防線能夠保護胚胎免受外界物理損傷和阻擋外界病原菌到達胚胎[33]，除此之外，經(jīng)母體傳遞來的免疫因子如IgM和C3 等構成了胚胎的第二道免疫防線[34-35]。研究已經(jīng)證明母源傳遞來的補體系統(tǒng)能通過旁路途經(jīng)(alternative pathway，AP)保護胚胎抵御外界病菌入侵[10,36-37]。與此同時免疫球蛋白IgM 可能起到調(diào)理素的作用，協(xié)助吞噬細胞進行吞噬作用[38]。本實驗的另一個發(fā)現(xiàn)是光譜能影響胚胎內(nèi)免疫因子如IgM 和C3 的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。通過對不同實驗組出膜前胚胎中的免疫因子含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)IgM、C3、TGF-β 和IL-1β 均存在表達，其含量水平由高到低依次為C3＞IgM＞IL-1β＞TGF-β，并且光譜對上述免疫因子的含量具有顯著差異影響。以IgM 和C3 為例，IgM 在紅光組胚胎中含量水平最高，在黑暗組中最低，其他實驗組中IgM 的表達水平介于上述兩組之間。C3 在自然光組和綠光組中的含量水平遠高于其他實驗組。通常，C3 在急性反應(acute phase response)中水平會升高[39]，由此我們推測這兩組光譜環(huán)境不適用于胚胎孵化并在出膜過程對胚胎產(chǎn)生脅迫效應，從而使得胚胎中C3 水平遠高于其他組。盡管藍光同樣對孵化有抑制作用，但是該組中C3 含量水平卻低于上述3 組，其中原因還不明確。實驗中小黃魚胚胎來自相同親魚的同一批受精卵，孵化過程中除外界光譜環(huán)境不同外，其他環(huán)境條件如孵化溫度、光照周期和水質(zhì)等因素都相同，這說明各組間胚胎中免疫水平存在差異主要由光譜環(huán)境影響了它們的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程導致的。

TGF-β 與IL-1β 與炎性反應(inflammatory responses)有關，前者主要是通過抑制作用來防止炎性反應對宿主自身的傷害，而后者主要通過激活T 細胞來激活炎性反應[11-16]。我們的實驗結果顯示上述兩者均在自然光組中的水平最高，而在其他組中存在不同的變化趨勢，這說明不同的光譜組成對TGF-β 與IL-1β這兩類免疫因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯影響不同。但是進一步比較發(fā)現(xiàn)，IL-1β 在不同組中的變化趨勢與C3 基本一致，這或許與它們在免疫過程中的作用是一致的。TGF-β 與上述兩種免疫因子不同，結合其具有抑制免疫效應的特點，并且除黑暗組和紅光組外，在其他組中的含量都較高，我們猜測除其他光譜環(huán)境因?qū)ε咛サ姆趸a(chǎn)生不利的脅迫作用，進而激發(fā)并使得胚胎內(nèi)TGF-β 的含量水平升高。

3.3 光譜能夠影響小黃魚胚胎的節(jié)律調(diào)控

胚胎發(fā)育節(jié)律調(diào)控過程具有物種特異性，如在斑馬魚胚胎中，生物鐘關鍵基因period1自受精卵發(fā)育第一天開始就可以在無光存在的情況下進行表達，并且其表達的節(jié)律波動隨外界溫度變化而發(fā)生。與period1不同，clock1和bmal1的節(jié)律性轉(zhuǎn)錄則需要光照-黑暗的周期變化來誘導產(chǎn)生[19]。本實驗中，相比較其他實驗組，黑暗條件下胚胎中節(jié)律調(diào)控基因clock依然存在表達，這說明在小黃魚胚胎中該基因可以不依賴光照-黑暗周期變化而表達。并且黑暗組胚胎中該基因只與在紅光組中的表達水平有顯著差異，與其他光譜組無差異，說明小黃魚中該基因的表達水平高低受外界光譜環(huán)境影響，其中長波長的紅光能夠促進其表達。

黑視蛋白(melanopsin)在由外界光譜引發(fā)的自身節(jié)律調(diào)整過程中起重要的光子感知、能量轉(zhuǎn)化的作用。該蛋白是一類廣泛存在于脊椎動物中的具有7 個跨膜結構的G 蛋白結合受體[40]，以11-順視黃醛為感光基團，當吸收外界光子后，蛋白結構由順式變?yōu)榉词絒41]，并通過與Gq/11類G 蛋白結合激活磷脂酶C(phospholipase C,PLC)[42]，后者進一步水解磷脂酰肌醇(PIP2)產(chǎn)生二?；视?DAG)和三磷酸肌醇(IP3)[43-44]，隨后引發(fā)膜外Ca2+經(jīng)過TRP 離子通道進入胞內(nèi)，使得膜電位發(fā)生去極化并激活電壓門離子通道(voltage-operated calcium vhannel,VOCC)[45-47]。黑視蛋白對短波長的藍色光具有光敏性，其表達水平隨外界光譜環(huán)境而變化，并且與節(jié)律調(diào)控之間存在密切聯(lián)系。如熱帶魚視網(wǎng)膜上合成的褪黑素和黑視蛋白表達水平因外界光譜環(huán)境不同而變化[48-49]。靳二輝等[50]在研究單色光對肉雞松果體黑視蛋白表達的影響時，發(fā)現(xiàn)該蛋白的表達水平在藍光、白光、綠光、紅光組中依次降低。該蛋白在硬骨魚類如大西洋庸鰈魚眼部視網(wǎng)膜和腦部廣泛存在，并且在胚胎后期腦部已經(jīng)存在表達[20]。我們的實驗結果與之相似，發(fā)現(xiàn)藍光組melanopsin表達水平最高，而其clock表達水平最低，紅光組則與之相反。結合兩組胚胎的孵化情況，我們推測紅光通過提高胚胎中clock的表達，促進了胚胎發(fā)育的節(jié)律調(diào)控過程，進而產(chǎn)生了提高孵化率、縮短孵化時長和提高免疫水平的最終孵化效應。

通過本研究得出以下結論：光譜對小黃魚胚胎在孵化率、孵化時長、主要的免疫因子的表達及節(jié)律調(diào)控均具有顯著影響，其中紅光下小黃魚胚胎孵化率最高，完成最快，而且IgM 的含量水平最高。藍光不利于小黃魚胚胎孵化，其他光譜組成對胚胎孵化的影響介于紅光和藍光之間。自2015 年首次實現(xiàn)小黃魚人工繁育和養(yǎng)殖以來，其胚胎孵化率和仔魚存活率逐年上升，但胚胎的孵化率仍然較低，在一定程度上影響了小黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的進一步推廣。目前在生產(chǎn)中依舊采用自然光或節(jié)能燈照明，本研究從理論上驗證了采用光譜調(diào)控對小黃魚胚胎孵化的重要促進作用，對在生產(chǎn)中推廣新型的光譜調(diào)控應用具有一定的參考意義。