陳 鈺，曾廣婷，劉 梅，汪佳歡，劉行平，竺柏康，陳慶國

(1.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學石油化工與環(huán)境學院，浙江舟山 316022；3.舟山市污水處理有限公司，浙江舟山 316000)

伴隨著海上石油的開發(fā)與運輸，海上溢油事故時有發(fā)生，海洋石油污染問題一直是亟待解決的重大環(huán)境問題[1]。目前，海洋溢油污染治理方法主要分為物理、化學和生物修復技術。生物修復技術由于是實現石油無害化及實現生態(tài)恢復的唯一途徑，在處理海洋溢油方面發(fā)揮了巨大作用[2]。其中，固定化微生物技術因其經濟效益好、污染物去除效率高、可重復利用等優(yōu)點已在溢油污染修復工程得到應用[3-4]。固定化微生物技術是指通過物理或化學方式將所需要的游離態(tài)微生物集中固定在某一特定載體內，使其在適宜的環(huán)境條件下保持生物活性并迅速增殖的方法[5]。相比于傳統(tǒng)的微生物處理方法，該技術有效提高了特定菌種對環(huán)境中原油等污染物質的處理效率[6]。目前研究的熱點和應用前景廣泛的一種載體是生物炭，由于其優(yōu)良的吸附性能和生物兼容性，在固定化微生物應用領域越來越得到重視[7]。生物炭來源廣泛，可由各種廢棄的有機生物質高溫碳化獲得。其中，污泥基生物炭，來源于常見的固廢城市污泥，因具有高的比表面積和豐富的孔隙結構以及大量的官能團等特點，是污泥資源化利用的有效途徑，已被應用于土壤和水污染治理與修復中[8-9]，包含重金屬、氨氮和多環(huán)芳烴等多種污染物的去除[10-12]。因此，將污泥基生物炭固定化微生物應用于海洋溢油修復有望成為助力解決海洋石油污染的有力手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

城市污水廠脫水污泥，干燥、粉碎后保存?zhèn)溆?；菌種為實驗室保存的海洋石油烴降解菌Alcanivoraxsp.ASW-2；磷酸、無水硫酸鈉等所用藥劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g,牛肉膏3 g，NaCl 10 g,去離子水1 000 mL。

原油培養(yǎng)基：培養(yǎng)基配方按照文獻[13]，原油添加量為0.1～5 g·L-1。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min 后使用，接種后的培養(yǎng)基置于振蕩培養(yǎng)箱中120 r·min-1培養(yǎng)，除溫度條件優(yōu)化外，其余均為25 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物炭載體制備

采用常用的生物炭活化劑磷酸對污泥進行活化[14]。以不同濃度的磷酸溶液(30%～60%)對經過預處理后的干燥污泥進行活化，將活化后污泥置于管式爐中(氮氣保護)，進行單因素單水平實驗，參考文獻[15]生物炭制備條件，設定不同碳化溫度(300～800 ℃)與碳化時間(0.5～2.5 h)，優(yōu)化制備生物炭，獲得制備污泥基生物炭的最優(yōu)條件，同時根據掃描電鏡與紅外光譜分析制備的污泥基生物炭特性。

1.3.2 生物炭固定化微生物效果評價

將石油烴降解菌ASW-2 在肉湯培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)3 d，對該菌進行離心制備菌懸濁液。該菌菌濃在5×108～5×1011CFU·mL-1之間OD600吸光度呈線性，獲得線性方程菌濃y=8×1011x(OD600)-7×1010。根據吸光度調節(jié)配制菌濃為5×1011CFU·mL-1菌懸濁液，用1 g 制備的生物炭對50 mL 菌懸濁液吸附固定10 h，以吸附前后菌懸濁液的OD600值為評價指標[16]，考察不同條件下制備的生物炭對石油烴降解菌ASW-2 的吸附固定能力，進而優(yōu)化生物炭制備條件。也通過單因素單水平實驗考察不同菌濃的菌懸液(5×1010～5×1011CFU·mL-1)與不同吸附時間(2～30 h)對生物炭吸附固定降解菌效果的影響，優(yōu)化降解菌ASW-2 固定化條件。

1.3.3 微生物降解原油實驗

采用單因素單水平實驗，考察固定化菌與游離菌在相同條件下對不同濃度的原油(0.1～5 g·L-1)的降解效率，探究降解效率隨降解時間(0～15 d)的變化。設定不同鹽度(10～40)、pH(6～9)、溫度(5～35 ℃)條件下降解原油。初始實驗條件為溫度25 ℃、鹽度30、pH 8，原油濃度為1 g·L-1降解7 d。實驗按順序進行，上一步實驗優(yōu)化后的實驗條件作為下一步實驗的設定條件。參考文獻[17]方法，用紫外分光光度法(254 nm 波長)測定微生物降解前后培養(yǎng)基原油濃度變化，優(yōu)化固定化菌的降解條件，并與游離菌的降解效果作對比。通過氣相色譜儀(GC-FID)和氣質聯(lián)用儀(GC-MS)測定固定化微生物和游離微生物降解前后石油中主要的烴組分的變化[18]，以考察生物炭固定化微生物對石油各組分的降解特性。

2 結果與討論

2.1 污泥基生物炭制備與微生物固定化條件優(yōu)化

2.1.1 活化劑濃度與活化時間對生物炭吸附效果的影響

制備生物炭的碳化溫度為600 ℃，碳化時間30 min，考察了活化劑磷酸的濃度及活化時間對生物炭吸附固定石油降解菌效果的影響，結果如圖1 所示。由圖1(a)可知，隨磷酸濃度的升高，生物炭對石油降解菌的吸附量呈上升趨勢，磷酸濃度由45%提升至50%時，生物炭的吸附效果得到顯著提升，因為高濃度磷酸對污泥的潤漲作用增強，加速了造孔速度。其中，磷酸濃度達到55%時生物炭的吸附能力最強，對石油降解菌的吸附量達到1.64×1011CFU·g-1。而磷酸進入污泥內部對污泥進行活化需要一定時間[19]，圖1(b)表明活化時間與生物炭的吸附能力隨活化時間增長先增加后減少?；罨瘯r間為2 h 時生物炭對石油降解菌的吸附量達到最大，吸附量為1.77×1011CFU·g-1。

圖1 活化劑使用條件優(yōu)化Fig.1 Optimization of activator conditions

2.1.2 碳化溫度與碳化時間對生物炭吸附效果的影響

制備生物炭的活化劑濃度為55%，活化時間為2 h，考察了碳化溫度及碳化時間對生物炭吸附固定石油降解菌效果的影響，結果見圖2。由圖2(a)可見，碳化溫度為300～500 ℃時生物炭對石油降解菌的吸附效果呈上升趨勢，碳化溫度為550 ℃時，由于有機物大量揮發(fā)，生物炭表面逐漸形成比較完善的孔隙結構，比表面積增大，生物炭的吸附能力最強。碳化溫度上升至600 ℃時，可能是由于生物炭孔隙結構由微孔變?yōu)橹锌谆虼罂祝瑢е卤缺砻娣e減小，生物炭的吸附能力有所下降[20]。隨著溫度繼續(xù)提高，污泥中少量無機物的分解和有機物之間的縮合使生物炭孔隙結構重新形成，使生物炭吸附效果有所提升。此結果與楊艷琴等[21]、王格格等[22]研究結果一致。由圖2(b)可知，隨著碳化時間的增長，生物炭對石油降解菌的吸附量先增后降，碳化時間為1 h 時生物炭的吸附效果最佳。因為污泥需要一定時間才能完全碳化，碳化不完全時生物炭孔隙結構不發(fā)達，吸附效果較差。1 h 后生物炭碳化完全，碳化時間繼續(xù)延長，原本較完善的孔隙結構被破壞，生物炭吸附效果變差。

圖2 碳化條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of carbonization conditions

2.1.3 生物炭固定化微生物條件優(yōu)化

將優(yōu)化條件下制備的生物炭進行微生物固定化條件優(yōu)化，結果見圖3。圖3(a)表明，生物炭對石油降解菌的固定量整體隨初始菌液濃度的提高而增長，當初始菌濃超過3×1011CFU·mL-1時生物炭固定量的提升速率有所下降。初始菌濃較低時菌懸液中的石油降解菌幾乎都被生物炭所吸附，石油降解菌量限制了生物炭的吸附能力[23]。當初始菌濃增加時，生物炭的吸附能力得到快速提升，當初始菌濃為5×1011CFU·mL-1時生物炭對石油降解菌的吸附量最大，為1.94×1011CFU·g-1。

圖3(b)可以看出，當初始菌濃為5×1011CFU·g-1時，0～12 h 時生物炭對石油降解菌的固定量隨時間變化增長迅速，因生物炭的吸附能力有一定限度，12 h 后生物炭對石油降解菌的吸附基本達到飽和，固定化菌量達到2.06×1011CFU·g-1，隨時間繼續(xù)增長，生物炭吸附的菌量基本保持恒定，甚至略有下降。此趨勢與秦麗姣[24]在探究不同時間下載體材料對石油降解菌吸附量的研究結果一致。

圖3 生物炭吸附固定化菌條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of conditions for biochar adsorbed immobilization of bacteria

2.2 制備的生物炭的性能表征

2.2.1 SEM 表征

污泥樣品處理前后的掃描電鏡圖如圖4 所示：磷酸活化后，污泥呈現明顯的層狀結構，增大了比表面積，提供大量吸附位點，使其吸附性能增強[25]。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，細菌在污泥基生物炭內部生長，并分泌出較多的如多糖、蛋白質等生物大分子代謝產物分布在污泥基生物炭表面使其表面變得很光滑。制備的磷酸活化改性的生物炭比表面積為29.13 m2·g-1，總孔體積為0.043 m2·g-1，平均孔徑為12.32 nm，與文獻[21]制備的生物炭性能相當。

圖4 樣品SEMFig.4 SEM image of samples

2.2.2 紅外光譜表征

如圖5 所示，污泥高溫碳化后，1 424 cm-1(締合態(tài)的酰胺基吸收峰)、870 cm-1(伯胺的NH 面外彎曲振動峰)，相對于未碳化樣品吸收峰顯著增強，說明含氮有機質在高溫下發(fā)生聚合。3 744 cm-1、710 cm-1也出現了較為明顯的吸收峰，為-OH的振動峰，是氫鍵締合產生的吸收峰，特別是預處理中使用H3PO4活化污泥引入-OH 后吸收峰較為明顯增強。H3PO4活化后生物炭樣品中吸收峰(1 034 cm-1，C-O-C 伸縮振動峰；560 cm-1，芳香酮類羰基振動峰)相對于直接高溫碳化的吸收峰顯著增強[26]，說明磷酸活化后使制備的生物炭活性官能團明顯增多。

圖5 污泥樣品與不同處理制備的生物炭的FTIR圖譜Fig.5 FTIR spectra of sludge samples and biochar prepared by different treatments

2.3 固定化微生物降解原油的特性與環(huán)境條件優(yōu)化

2.3.1 固定化載體對原油的吸附貢獻

設定初始固定化載體添加量為1 g·L-1，原油濃度為1 g·L-1，考察固定化載體添加量及原油濃度對生物炭載體去除原油影響，結果如圖6 所示。由圖6 可以看出，隨著載體添加量的增加，載體對原油的吸附率有所提升，但整體吸附效果不佳，而原油濃度與載體吸附率之間未呈現明顯相關性。固定化載體對油吸附的貢獻較小，對原油的吸附率均在5%以下，結合固定化菌對原油降解率數據可以看出，固定化菌對原油的去除主要是生物降解貢獻。在不同原油濃度條件下，微生物對原油的降解率可達32%～90%。而且，扣除吸附貢獻，固定化載體的添加也顯著促進了生物降解，載體固定化后微生物對不同濃度原油的降解效果可提升8%～17%。

圖6 生物炭載體對原油去除影響Fig.6 Effect of biochar carrier on crude oil removal

2.3.2 原油濃度與降解時間對固定化微生物降解原油的影響

考察了原油濃度與降解時間對固定化微生物降解原油的影響，結果如圖7 所示。如圖7(a)所示，固定化菌與游離菌對原油的降解率均隨原油濃度的升高而下降，高濃度原油對石油降解菌有一定抑制作用。原油濃度為0.1 g·L-1時，降解7 d，固定化菌與游離菌對原油的降解效果最佳，降解率分別為97.78%與90.24%。而隨著濃度增加，原油的抑制效果逐漸增強，5 g·L-1的高濃度原油條件下降解率分別降至50%和35%以下。陳曦等[27]研究也表明石油濃度過高，限制微生物對營養(yǎng)物質的吸收，甚至對石油降解菌產生毒害作用。與游離菌相比，固定化提升了微生物對原油的降解效率，在原油濃度為1 g·L-1，固定化對微生物降解的促進作用最為顯著，提升降解率可達17.23%；設定原油濃度為1 g·L-1時，考察了微生物對原油的降解率隨降解時間的變化，結果如圖7(b)所示。如圖7(b)所示，微生物對原油的降解率隨降解時間的增長先增加后趨于平穩(wěn)。第7 天時固定化菌對原油的降解率趨于穩(wěn)定，為75.87%，比游離菌高23.98%。游離菌對原油的降解在第9 天趨于穩(wěn)定，降解率為56.67%。與游離菌相比，固定化加快了微生物對原油的降解速率，提高了石油烴降解菌對原油的降解效果。已有文獻已報道利用各種材料吸附固定化降解菌提高對石油的生物降解效率。宋佳宇等[28]利用改性聚丙烯工業(yè)吸油棉吸附固定化石油降解菌，相比游離菌，18 d 降解后固定化菌對1 g·L-1的原油去除率為70.01%，比游離菌提高20%左右；韓志勇等[29]利用核桃殼吸附固定石油烴降解菌，在原油濃度為3.9 g·L-1、固定化菌7 d 對原油降解率達到66.8%。ZHOU Hanghai,et al[30]利用玉米秸稈生物炭固定化石油烴降解菌降解燃料油，對1%的燃料油7 d 降解率可達94.7%，比游離菌提高40.3%。以上研究表明，生物炭在促進原油生物降解方面具有明顯優(yōu)勢。

圖7 原油濃度與降解時間對固定化菌降解原油的影響Fig.7 Effects of crude oil concentration and degradation time on crude oil degradation by immobilized bacteria

2.3.3 環(huán)境條件對固定化微生物降解原油的影響

利用固定化菌和游離菌對1 g·L-1原油降解7 d，考察在實驗設定的環(huán)境條件(溫度、鹽度、pH)變化范圍內，溫度、鹽度、pH 對固定化菌和游離菌降解原油效率的影響，結果如圖8 所示。如圖8 所示，隨著溫度、鹽度、pH 的增加，降解菌對原油的降解率均呈現先上升后下降的趨勢。微生物對這些環(huán)境因素有一定耐受范圍，超過耐受范圍后微生物對原油的降解效果明顯下降[31]。菌降解原油的最適溫度為25 ℃，高溫與低溫對微生物降解原油產生一定抑制作用，但固定化對溫度抑制作用有一定程度減弱；鹽度為30 時，菌對原油的降解效果最佳，鹽度為10～30 時固定化對菌原油降解率的提升效果較好，當鹽度繼續(xù)上升時由于高鹽度的抑制作用，固定化的提升效果有所下降；固定化菌與游離菌的最適pH 分別為7.5 與8，pH 改變時固定化菌原油降解率的變化較小，說明固定化顯著提升了菌對pH 的耐受性。田秀梅等[32]的研究也表明，pH為7～8 時固定化菌對石油的去除效果較佳，pH 過低或過高都會影響微生物的生長繁殖和酶的活性。固定化提升了石油降解菌對環(huán)境的耐受性，在相同環(huán)境條件下，經過7 d 降解，固定化后菌對原油的降解率最大可達78.71%，與游離菌相比降解效率可提升約28%。

圖8 環(huán)境條件對固定化菌降解原油的影響Fig.8 Effects of environmental conditions on degradation of crude oil by immobilized bacteria

2.3.4 微生物對正構烷烴與多環(huán)芳烴的降解

游離菌和固定化菌降解原油7 d 后的樣品(未接種的原油培養(yǎng)基做空白)，利用GC-FID 和GC-MS 測定油樣品中主要烷烴組分(C10-C32)和芳烴組分(16 種海洋中常見的多環(huán)芳烴)變化[33]如圖9 所示。如圖9所示看出，降解菌ASW-2 對正構烷烴和多環(huán)芳烴均有一定降解去除。降解菌ASW-2 對正構烷烴(C12-C32)的降解作用(37.4%)顯著高于多環(huán)芳烴(23.5%)。而污泥基生物炭固定化菌顯著提高了石油降解菌對正構烷烴和多環(huán)芳烴的去除，污泥基生物炭固定化菌對正構烷烴去除率可達51.3%，去除率提高13.9%；對多環(huán)芳烴去除率可達28.8%，去除率提高5.3%。污泥基生物炭固定化菌對于中短鏈烷烴特別是C28 以下烷烴去除效果提高顯著，而對于長鏈烷烴去除效果(C28 以上)提高效果小于中短鏈烷烴，污泥基生物炭固定化菌對于多環(huán)芳烴中含量較高的三環(huán)和四環(huán)的多環(huán)芳烴，如苊、蒽、熒蒽去除具有較明顯的提高效果，這與KUMARI S,et al[34]的研究結果一致。

圖9 降解前后主要原油組分變化Fig.9 Changes of main components of crude oil before and after degradation

3 結論

本論文探究了污泥基生物炭制備、吸附固定化微生物與微生物降解原油條件的優(yōu)化，并考察了固定化微生物降解原油的特性，得出以下結論：

(1)55%磷酸活化2 h 并在500 ℃條件下碳化1 h 后制得的生物炭具有良好的孔隙結構和較大的比表面積，吸附效果較好，對石油降解菌的吸附量最大可達1.77×1011CFU·g-1。

(2)生物炭固定化微生物的最優(yōu)初始游離菌濃為5×1011CFU·g-1，在此菌濃條件下吸附12 h 后，生物炭對微生物的吸附達到穩(wěn)定，吸附量可達2.06×1011CFU·g-1。

(3)在pH 為8，鹽度為30，溫度為25 ℃的環(huán)境條件下，固定化菌對原油的降解效果最佳。在最優(yōu)環(huán)境條件下降解7 d 后，固定化菌對1 g·L-1原油的最大降解率可達78.71%。

(4)與游離微生物相比，生物炭固定化后的微生物對原油的降解能力更強，且對環(huán)境有更強的耐受性。生物炭固定化顯著提高了石油降解菌對正構烷烴和多環(huán)芳烴的去除，正構烷烴去除率提高13.9%，多環(huán)芳烴去除率提高5.3%。