閆淑靜，陳春麗，謝湘云，高曉黎,2

（1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，2新疆天然藥物活性組分與釋藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830017）

黃體酮（P4）是一種由腎上腺皮質(zhì)、性腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)分泌的類固醇激素[1-2]，是臨床上用于黃體支持和絕經(jīng)激素治療的首選天然孕激素[3-4]，但由于其溶解度低且口服后具有顯著的首過效應(yīng)[5]，生物利用度低，臨床應(yīng)用受限[6]。口服P4后機(jī)體可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，其中代謝產(chǎn)物20α-羥基黃體酮（20α-DHP）具有P4 樣作用（藥效約為P4 的25%～50%）[7]，在調(diào)節(jié)排卵和促性腺激素的分泌，影響卵巢-垂體-下丘腦的交互作用中發(fā)揮重要作用[8]。20β-羥基黃體酮（20β-DHP）和20α-DHP 互為同分異構(gòu)體，但目前對(duì)于20β-DHP的作用鮮有研究報(bào)道，本研究探究20β-DHP對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（Rat endometrial stromal cell, RESC）增殖的影響，及其對(duì)RESC中孕酮受體（PR）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器LC-6AD 半制備高效液相色譜儀、LC-20AT高效液相色譜儀、DAD二極管陣列檢測(cè)器（日本島津公司），AB-135S 電子分析天平（德國梅特勒-托利多公司），CTR6000 倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司），Multiskan GO 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國ThermoFisher公司），NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國Ther?moFisher公司），QuantStudio6 Flex 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Abi 公司），H1-16KR 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑20α-DHP 對(duì)照品（加拿大多倫多研究化學(xué)品公司，批號(hào)：6-CWA-95-2），20β-DHP 對(duì)照品（美國TLC Pharma Chem 公司，批號(hào)：4047-033-A4），孕酮（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：W08J12H136927），噻唑藍(lán)（MTT，美國Biofroxx 公司，批號(hào)：829Z0514），胎牛血清（美國Hyclon 公司，批號(hào)：DD19099560），膠原酶Ⅰ型（美國Sigma 公司，批號(hào)：C0130-100MG），熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：BA1032），兔Vimentin（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1033-1-AP），RESC 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生物科技有限公司，批號(hào)：WH01112107XP），Trizol Reagent 試劑盒(美國Invitro?gen 公司，批號(hào)：350112），PrimeScript RT reagent Kit試劑盒（美國Takara 公司，批號(hào)：AKF1919A），TB Green Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量試劑盒（Takara 公司，批號(hào)：AKE1154A），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性SD 大鼠，6～8周齡，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：SCXK（新）2018-0002]，飼養(yǎng)溫度20℃～25℃，濕度40%～70%，均自由進(jìn)食飲水。

1.4 方法

1.4.1 20β-DHP 的制備將P4 在無水條件下經(jīng)氫化鋁鋰還原，二氧化錳局部氧化得到粗產(chǎn)物，合成路線見圖1。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析（75%正己烷/乙酸乙酯）純化后得20-DHP。配制3 mg/mL 的20-DHP 甲醇溶液，注入半制備高效液相色譜儀，經(jīng)COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ（20ID×250 mm）分離得到20β-DHP。半制備高效液相色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇-水（v：v=85：15），等度洗脫，進(jìn)樣體積為1 mL，流速為3.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為241 nm。根據(jù)檢測(cè)器色譜峰，分別收集流出液。將相應(yīng)流出液合并濃縮、干燥后進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和HPLC 分析。HPLC 色譜條件為：Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm），等度洗脫，流動(dòng)相為甲醇：乙腈：水=35：35：30，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為241 nm，進(jìn)樣體積為10 μL。

圖1 20-DHP的合成路線圖

1.4.2 RESC 的原代提取與培養(yǎng)將大鼠處死后分離子宮內(nèi)膜層組織，剪成碎塊，用含雙抗PBS 清洗，37 ℃下消化液（膠原酶Ⅰ）消化45 min 后用等體積胰酶消化30 min，加入FBS終止消化，輕輕吹打，消化液300 r/min 離心5 min，保留上清液，將上清液2 000 r/min 離心8 min，保留細(xì)胞沉淀。用RESC 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于多聚賴氨酸預(yù)先包被的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，1 h 后更換培養(yǎng)基，每3天換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后備用。

1.4.3 RESC 的免疫熒光鑒定將預(yù)先處理過的玻片放置于培養(yǎng)皿中，接種細(xì)胞于玻片上，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出玻片，用PBS 浸洗、4%的多聚甲醛固定，0.5%TritonX-100 室溫通透20 min，PBS 浸洗后滴加正常山羊血清封閉30 min。吸掉封閉液，滴加一抗（Vimentin，稀釋比為1∶100）4 ℃孵育過夜。次日加熒光標(biāo)記羊抗兔IgG（稀釋比為1∶100）孵育1 h。滴加熒光染料DAPI 避光孵育5 min，洗去多余DAPI 后封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4.4 RESC 的生長(zhǎng)曲線繪制取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞以105個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每組細(xì)胞平行接種5個(gè)復(fù)孔，孵育24 h 后開始計(jì)時(shí)，于6、12、24、36、48、72、96 h 隨機(jī)取出一塊，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩5 min 后測(cè)定554 nm 處吸光度值（A）。以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，每組平均A 為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4.5 20β-DHP 對(duì)RESC 增殖的影響取生長(zhǎng)良好的3～5代細(xì)胞以104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，孵育24 h 后進(jìn)行藥物干預(yù)。試驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組（無細(xì)胞，給予完全培養(yǎng)基）、空白組（有細(xì)胞，給予完全培養(yǎng)基）、P4 陽性對(duì)照組（給予不同濃度的含P4 完全培養(yǎng)基）、20α-DHP 組（給予不同濃度的含20α-DHP 完全培養(yǎng)基）、20β-DHP 組（給予不同濃度的含20β-DHP 完全培養(yǎng)基）。根據(jù)分組給予不同處理，實(shí)驗(yàn)組的濃度范圍均為0～40 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，分別于4、8、12、24 h 取出。每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定554 nm 處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率：

1.4.6 20β-DHP 對(duì)RESC 中PR、PCNA 表達(dá)的影響取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞以5×106個(gè)/孔接種于96 孔板，24 h 后，分為空白組、P4 陽性對(duì)照組、20α-DHP組、20β-DHP 組，各給藥組濃度均為10 μg/mL，干預(yù)時(shí)間分別為12、24 h，采用Trizol法分別提取每組細(xì)胞總RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit 將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，各組取0.2 μL cDNA 配制10 μL 熒光定量反應(yīng)體系，放入PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。記錄CT值，采用2-ΔΔCT法計(jì)算各組基因的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 20β-DHP 的制備及結(jié)構(gòu)表征合成產(chǎn)物20-DHP 的半制備HPLC 圖見圖2。由圖2 可知，20α-DHP、20β-DHP 的保留時(shí)間分別為61.5、75.26 min，二者色譜峰分離度良好。收集色譜峰2對(duì)應(yīng)流出液，濃縮干燥后得20β-DHP。采用紅外光譜（IR）、氫核磁共振譜（Proton Nuclear Magnetic Resonance,1HNMR）、碳核磁共振譜（Carbon Nuclear Magnetic Reso?nance,13C-NMR）、電噴霧質(zhì)譜（Electro-spray Ioniza?tion Mass Spectrum, ESI-MS）對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，數(shù)據(jù)如下：IR ν(KBr) : 3526, 2947, 2870, 1674, 1612 cm-1;1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.73 (d,J= 1.8 Hz,1H, C4-H), 3.74 (dt,J= 9.8, 6.1 Hz, 1H, C20-H), 2.47-0.91 (m, 27H), 1.19 (s, 4H, C19-H), 1.15 (s, 2H, C21-H),0.80 (s, 3H, C18-H);13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ 199.63, 171.49, 123.75, 70.45, 58.32, 55.30, 53.77,42.33, 39.62, 38.60, 35.66, 35.43, 33.94, 32.87, 32.02,25.56, 24.42, 23.72, 20.87, 17.36, 12.40; ESI-MS m/z：317.06([M+H]+,C21H32O2理論值317.25)。在此色譜條件下，制備的20β-DHP色譜峰對(duì)稱性良好，保留時(shí)間為23.2 min，純度為96.27%。

圖2 粗產(chǎn)物20-DHP的半制備HPLC圖。

2.2 原代培養(yǎng)RESC 的鏡下檢測(cè)原代提取的RESC鏡下呈類纖維細(xì)胞形態(tài)，兩頭尖中間稍寬，呈梭形。經(jīng)傳代培養(yǎng)后，RESC呈多角形，見圖3。

圖3 RESC光學(xué)顯微鏡下形態(tài)圖（50×）

2.3 RESC 的免疫熒光染色紅色熒光為基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)Vimentin 陽性，核為藍(lán)色，Image J 軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示細(xì)胞陽性率>90%，表明細(xì)胞純度達(dá)90%以上，RESC的免疫熒光鑒定結(jié)果見圖4。

圖4 RESC免疫熒光圖

2.4 RESC 的生長(zhǎng)曲線繪制RESC 生長(zhǎng)曲線呈S 型，在接種后的前12 h 時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞活力無明顯上升，處于緩慢期。在12～48 h 內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，活力呈指數(shù)升高，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在48 h 后，細(xì)胞生長(zhǎng)活力未見明顯變化，處于平穩(wěn)期，見圖5。

圖5 RESC生長(zhǎng)曲線

2.5 20β-DHP 及其同分異構(gòu)體20α-DHP 對(duì)RESC 增殖的影響與空白組（0 μg/mL）相比，干預(yù)時(shí)間相同時(shí)，不同濃度的P4、20α-DHP、20β-DHP 對(duì)RESC 細(xì)胞增殖的影響不同，在0～10 μg/mL 范圍內(nèi)，P4、20α-DHP、20β-DHP 干預(yù)RESC 后，細(xì)胞存活率幾乎都隨著給藥劑量的增加而升高，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性；相同濃度的P4、20α-DHP、20β-DHP 干預(yù)后不同時(shí)間的RESC 存活率未呈現(xiàn)出規(guī)律性，沒有表現(xiàn)出時(shí)間依賴性。與空白組（0 μg/mL）相比，20α-DHP 和20β-DHP 均表現(xiàn)出類似P4 的促進(jìn)增殖作用，圖6b、6c 中2.5～5 μg/mL20α-DHP 和20β-DHP 給藥8 h 時(shí)RESC 的存活率低于100%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。3 種藥物干預(yù)12 h 時(shí)對(duì)RESC 增殖的促進(jìn)作用最為明顯，給藥時(shí)間延長(zhǎng)到24 h，細(xì)胞存活率略有下降，見圖6。進(jìn)一步分析干預(yù)12 h 和24 h 后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干預(yù)12 h后，P4組在10 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率達(dá)到最高，而20 μg/mL 時(shí)存活率略有下降；20α-DHP和20β-DHP 組最高存活率值均在20 μg/mL 出現(xiàn)；干預(yù)24 h 時(shí)，P4 組最高存活率在10 μg/mL 出現(xiàn)；20α-DHP 干預(yù)后存活率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，在10 μg/mL 時(shí)與空白組相比增殖作用就已經(jīng)具有顯著性差異（P<0.05）；20β-DHP 干預(yù)后峰值在20 μg/mL 出現(xiàn)，見圖7。因此為方便3 種藥物在同一濃度水平上進(jìn)行比較，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇在10 μg/mL進(jìn)行基因水平的考察。

圖6 不同藥物濃度干預(yù)不同時(shí)間后RESC的增殖情況

圖7 不同藥物干預(yù)12、24 h后RESC的增殖情況

2.6 20β-DHP 及其同分異構(gòu)體20α-DHP 對(duì)RESC 中PR、PCNA 表達(dá)的影響藥物干預(yù)12 h 時(shí)，與空白組相比，3 種藥物對(duì)PCNA 基因表達(dá)量均有明顯的上調(diào)作用，對(duì)PR基因表達(dá)量有顯著的下調(diào)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。藥物干預(yù)24 h 時(shí)，20α-DHP 與P4 對(duì)PR、PCNA 基因表達(dá)量的影響趨勢(shì)與干預(yù)12 h 時(shí)類似，與空白組相比，20β-DHP 對(duì)PR基因表達(dá)的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與P4組相比，20α-DHP 干預(yù)12、24 h 時(shí)對(duì)RESC 中PR、PC?NA 表達(dá)呈現(xiàn)相同的調(diào)節(jié)作用，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖8。

圖8 不同藥物干預(yù)對(duì)RESC中PR、PCNA 基因表達(dá)量的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜是天然孕激素黃體酮主要的靶器官，也是各種雌性激素作用的靶器官[9]，主要由基質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞組成[10]?；|(zhì)細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，其在上皮細(xì)胞的發(fā)育、生長(zhǎng)和維持功能方面發(fā)揮著重要的作用，原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)可為研究子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的生理功能及卵巢激素對(duì)子宮內(nèi)膜作用奠定基礎(chǔ)[11]。目前未見分離培養(yǎng)來自大鼠的原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的報(bào)道，本研究通過酶消化法、差速離心法分離得大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，并通過免疫熒光鑒定、生長(zhǎng)曲線繪制確證其種類及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)特性，結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的RESC 活力良好，能夠滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需要。

黃體酮能夠誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖[12]，其對(duì)靶細(xì)胞的（基因組、非基因組）作用通過結(jié)合孕酮受體（PR）發(fā)揮作用[13-14]，而對(duì)于其代謝產(chǎn)物20α-DHP及其同分異構(gòu)體20β-DHP的作用鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果表明，與黃體酮相比，20β-DHP（實(shí)驗(yàn)室制備，純度為96.27%）在12 h 內(nèi)具有類似的促進(jìn)RESC 增殖、下調(diào)PR 表達(dá)的孕激素樣作用，但孕激素樣作用受時(shí)間的影響，24 h 表現(xiàn)與12 h 有所差別；其同分異構(gòu)體20α-DHP 對(duì)RESC 增殖及PR 表達(dá)的作用與黃體酮無明顯差異。PCNA 是一種僅在增殖細(xì)胞中合成與表達(dá)的多肽（36 kDa），是DNA 多聚酶δ 的一種輔助蛋白[15]，其含量能夠反映細(xì)胞增殖的程度[16]。本研究結(jié)果表明，與黃體酮類似，20β-DHP 及其同分異構(gòu)體20α-DHP 均能上調(diào)PCNA 的表達(dá)，與MTT 試驗(yàn)的結(jié)果（三種化合物均能促進(jìn)RESC 的增殖）一致。本研究以黃體酮為對(duì)照，初步探討了20β-DHP 及其同分異構(gòu)體20α-DHP 對(duì)RESC 的促增殖作用，及其對(duì)PR和PCNA 表達(dá)的影響，后續(xù)有待深入探究?jī)煞N同分異構(gòu)體對(duì)PR 和PCNA 表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制，為開發(fā)利用20α-DHP和20β-DHP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。