張晨曦，葛 暢，叢 珊，王靈銳，文清慧，羅 劍，羅 莉

(新疆醫(yī)科大學 1第一附屬醫(yī)院風濕免疫科，2第一臨床醫(yī)學院，烏魯木齊 830054)

類風濕關節(jié)炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其病理基礎為侵蝕性滑膜炎癥、骨和關節(jié)軟骨進行性破壞，最終導致關節(jié)畸形功能障礙[1]。RA 全球發(fā)病率約為0.5%～1%，我國RA患者約有500 萬人，其中女性患病率較高[2-3]。樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）、T 細胞介導的自身免疫活化異常在RA 的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用。DCs是體內(nèi)抗原呈遞能力最強的抗原提呈細胞（Antigen presenting cell，APC），具有誘導初始型T 淋巴細胞分化，激活免疫應答和誘導免疫耐受能力[4]。RA 患者滑膜組織中成熟的DCs呈高表達，可通過高表達的共刺激分子和MHC-II 分子誘導CD4＋T 細胞活化介導炎癥反應[5]。因此抑制DCs 成熟，誘導免疫耐受可緩解RA 病情。 白喉烏頭（Aconitum leucostomum Worosch.）是毛莨科烏頭屬的多年生草本植物產(chǎn)于新疆北部地區(qū)，常以根部入藥，具有祛風除濕、溫經(jīng)止痛的功效[6]。單體1（Delvestidine）和單體4（氨茴酰牛扁堿）是白喉烏頭發(fā)揮抗RA 作用的主要活性成分[7]。研究表明，白喉烏頭能夠減輕膠原誘導關節(jié)炎（Colla?gen induced arthritis，CIA）大鼠關節(jié)腫脹度，減少炎性細胞浸潤，緩解CIA大鼠關節(jié)癥狀[8]，但其作用機制尚不明確。本研究通過建立CIA大鼠模型，分析檢測白喉烏頭對CD11c＋DCs 表面MHC-II 分子表達的影響，進一步探究白喉烏頭治療RA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物60 只SPF 級雄性SD 大鼠，6～8 周齡，體重（200±20）g，購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心[動物許可證號：SYXK（新）2016-0001]。所有大鼠在23℃～25℃，55%～60%濕度環(huán)境中，保持正常晝夜節(jié)律，自由進食和飲水，適應性喂養(yǎng)1 周后進行后續(xù)實驗。

1.2 試劑與儀器白喉烏頭總生物堿（辰光生物科技公司，HA001011）、單體1：Delvestidine（辰光生物科技公司，HB001005）、單體4：氨茴酰牛扁堿（辰光生物科技公司，HA001017），雷公藤多苷片（遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥公司，Z42021212），牛II型膠原（美國Chondrex公司，20022），完全弗氏佐劑（美國Sigma 公司，F(xiàn)5881），重組Anti-CD11c 抗體（美國abcam 公司，ab52632），Anti-MHC ClassII 抗體（美國abcam 公司，ab55152），ELISA 試劑盒（聯(lián)科生物技術有限公司），酶標儀（美國Thermo 公司，VL0LA0D2），光學顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，CX43），數(shù)顯游標卡尺（日本Mitutoyo公司，500-180-30）。

1.3 方法

1.3.1 制備CIA 大鼠模型將2 mg/mL 的牛II 型膠原溶于0.05 mol/L 的冰乙酸中，得到終濃度為4 mg/mL的牛II 型膠原乙酸溶液，4℃過夜，充分溶解，加入等體積完全弗氏佐劑充分乳化[9]。于大鼠左足跖部、尾根部及皮背部皮下注射牛II 型膠原乳劑（0.3mL/只）進行初次免疫，1 周后，將上述膠原乳劑同部位進行加強免疫。

1.3.2 分組及干預措施將所有大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、陽性藥組（雷公藤多苷組）、總生物堿組、單體1 組、單體4 組，每組各10 只，除正常組外，其余組大鼠建立CIA 大鼠模型，初次免疫3 周后（即加強免疫2周后），參照文獻[10]進行灌胃，總生物堿組給予45 mg·kg-1·d-1的總生物堿灌胃，單體1組給予98 mg·kg-1·d-1的單體1 灌胃，單體4 組給予98 mg·kg-1·d-1的單體4灌胃，陽性藥組給予1 mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷片灌胃，正常組給予2 mL/d 的生理鹽水灌胃，模型組給予2 mL/d 的生理鹽水灌胃。藥物干預劑量依據(jù)查閱白喉烏頭毒理學資料及相關文獻，通過半數(shù)致死量計算出適宜給藥濃度[8,11]，且經(jīng)預實驗證實。

1.3.3 各組大鼠關節(jié)腫脹度、關節(jié)炎指數(shù)評分游標卡尺分別測量造模前后第3、4、5、6、7 周大鼠左后足踝關節(jié)直徑，由2 名工作年限5 年以上，具有副研究員以上職稱的專業(yè)動物實驗人員同時測量，取兩者平均值。關節(jié)腫脹度（%）=（給藥后每周關節(jié)直徑-造模前關節(jié)直徑）/造模前關節(jié)直徑×100%；關節(jié)炎指數(shù)評分（Arthritis index，AI）是評定CIA 大鼠模型造模成功與否的標準，AI評分標準[12]：無關節(jié)紅腫為0 分，小趾關節(jié)輕度腫脹為1 分，趾骨關節(jié)及足趾紅腫為2分，踝關節(jié)以下均紅腫為3 分，包含踝關節(jié)在內(nèi)的全部足趾腫脹為4 分。AI 評分≥6 分提示CIA 大鼠造模成功，分值越高代表致炎效果越充分，關節(jié)炎模型建立越成功。

1.3.4 組織病理學檢測給藥4周后處死所有大鼠，取各組大鼠踝關節(jié)，置于4%多聚甲醛溶液，固定24 h，置于10%EDTA 脫鈣液中脫鈣4 周，待針刺關節(jié)無阻力或阻力很小時，即完成脫鈣。標本脫水浸蠟、包埋、切片，蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色，置于顯微鏡下觀察踝關節(jié)滑膜病理形態(tài)（×100）。

1.3.5 ELISA 法檢測血清炎癥因子水平腹主動脈采集血液，室溫靜置20 min，待血液自然凝固，離心取上清液，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書進行操作，分別檢測各組大鼠血清炎癥因子白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、腫瘤壞死因子-α（Tumor ne?crosis factor-α，TNF-α）的光密度（OD）值。

1.3.6 免疫熒光雙重染色檢測踝關節(jié)滑膜組織中DCs踝關節(jié)滑膜石蠟切片，烤片、脫蠟、抗原修復，加入0.3%牛血清蛋白，室溫孵育，封閉30 min。于切片關節(jié)滑膜部位依次加入一抗，4℃孵育過夜，加入二抗，避光，37℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）熒光染液，孵育5 min，封片，置于熒光顯微鏡下觀察（×200）。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠關節(jié)腫脹度、關節(jié)炎指數(shù)評分比較初次免疫第3 周，各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)AI 評分≥6 分，CIA模型造模成功。灌胃4周后，與正常組大鼠比較，模型組大鼠關節(jié)腫脹度顯著升高，AI 評分顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組、總生物堿組、單體1 組、單體4 組大鼠初次免疫后第6 周、第7 周關節(jié)腫脹度顯著改善，AI 評分顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（圖1）。

圖1 各組大鼠關節(jié)腫脹度、關節(jié)炎指數(shù)評分比較

2.2 各組大鼠踝關節(jié)組織病理學結果HE 染色結果顯示，正常組大鼠滑膜細胞排列規(guī)則，表面光滑，關節(jié)滑膜邊界清晰，無炎性細胞浸潤，無血管增生；模型組大鼠滑膜細胞排列紊亂，層數(shù)明顯增多，細胞間纖維結締組織增生、水腫和有大量炎性細胞（單核細胞、多核細胞、淋巴細胞等）浸潤，滑膜毛細血管增生，擴張的腔內(nèi)充滿紅細胞；陽性藥組、總生物堿組、單體1 組及單體4 組大鼠滑膜組織結構排列較模型組整齊，可見不同程度炎癥細胞浸潤，且均較模型組減少，可見少量毛細血管增生充血（圖2）。

圖2 各組大鼠踝關節(jié)組織病理學結果（×100）

2.3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α 表達水平比較與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均顯著升高，IL-4、IL-10 水平均顯著下降（P<0.05～0.01）；與模型組比較，陽性藥組、總生物堿組、單體1 組和單體4 組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均顯著下降，IL-4、IL-10水平均顯著升高（P<0.05～0.01）（圖3）。

圖3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α表達水平比較

2.4 CD11c+DCs 表面MHC-II 分子在CIA 大鼠踝關節(jié)滑膜組織中的表達情況免疫熒光雙重染色結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠中CD11c+DCs 表面MHC-II 分子表達量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組、總生物堿組、單體4 組大鼠中CD11c+DCs 表面MHC-II 分子表達量降低（P<0.05～0.01）。其中，總生物堿組、單體4 組大鼠CD11c+DCs表面MHC-II 分子表達量與陽性藥組大鼠差異性較小，單體1 組大鼠CD11c+DCs 表面MHC-II 分子表達量較模型組大鼠降低，但差異無統(tǒng)計學意義（圖4、表1）。

表1 各組大鼠CD11c+DCs表面MHC-II分子表達情況（±s，個/HPF）

表1 各組大鼠CD11c+DCs表面MHC-II分子表達情況（±s，個/HPF）

注：與正常組比較，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別正常組模型組陽性藥組總生物堿組單體1組單體4組共定位雙陽性細胞計數(shù)26.78±10.06 55.22±13.35##34.00±6.73**33.11±13.20**45.33±4.69 42.11±7.42*

圖4 CD11c+DCs表面MHC-II分子在CIA大鼠關節(jié)滑膜組織中的表達情況

3 討論

RA 是一種復雜免疫途徑介導的慢性炎癥性疾病，在RA 中DCs 調節(jié)T 細胞活化功能發(fā)揮著重要作用[13]。DCs 是目前發(fā)現(xiàn)機體功能最強的抗原呈遞細胞，其基本功能是識別、攝取、處理加工及提呈抗原，并直接激活初始型CD4＋T 細胞刺激基礎免疫應答，誘導輔助型T 細胞1（Th1）和輔助型T 細胞2（Th2）細胞分化。DCs 按照成熟活化狀態(tài)可分為成熟DCs（mDCs）和未成熟DCs（imDCs），正常生理狀態(tài)下大多DCs 處于未成熟狀態(tài)，分布在外周組織和淋巴結中，具有強大的抗原攝取能力，維持外周免疫耐受。CD11c是DCs經(jīng)典的標記分子，可表達于mDCs和im?DCs表面，本課題組前期研究表明，在RA患者關節(jié)液中CD11c+mDCs 聚集，關節(jié)液內(nèi)成熟DCs 含量與RA患者疾病活動度、炎癥反應呈正相關[14]，這表明RA患者關節(jié)炎癥誘發(fā)DCs 成熟并使其聚集于炎癥部位。李夢圓等[5]研究同樣表明，RA 患者滑膜液中CD11c+mDCs 含量顯著升高，分泌大量炎癥因子誘發(fā)炎癥反應。此外，免疫炎癥狀態(tài)下，抗原刺激imDCs遷移至炎癥部位獲得成熟表型，使mDCs 表面MHC-Ⅱ分子（DCs 成熟標記物）大量表達[15]，分泌促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等，進一步促進DCs 成熟，增強其抗原遞呈能力，激活機體免疫應答。同時，受IL-10等抑制因子的影響，mDCs能夠抑制T細胞功能并介導免疫耐受[16]。因此通過抑制DCs 活化與成熟，影響T 細胞相關炎性因子釋放是緩解關節(jié)炎癥的有效途徑。

本研究證實模型組大鼠關節(jié)滑膜組織中CD11c＋DCs 表面MHC-II 分子高表達，說明mDCs 在滑膜組織聚集誘發(fā)炎癥反應。初次免疫第3 周開始灌胃給藥4周后，總生物堿組、單體1組及單體4組大鼠關節(jié)滑膜組織中CD11c＋DCs 表面MHC-II 分子表達量均下降，這與Wang 等[17]研究結果一致。提示白喉烏頭能夠降低CD11c＋DCs 表面MHC-II 分子表達，即下調mDCs 含量。同時本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 水平明顯升高，IL-4、IL-10 水平明顯下降，初次免疫第3 周開始灌胃給藥4 周后，陽性藥組、總生物堿組、單體1 組及單體4組大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著下降，IL-4、IL-10 水平顯著升高。這提示灌胃給藥后，滑膜組織中CD11c＋DCs 表面MHC-II 分子表達量下降，即mDCs 表達量降低，致使炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 釋放減少，抑炎因子IL-4、IL-10 升高誘導免疫耐受。

綜上所述，白喉烏頭可能通過抑制CD11c+DCs表面MHC-II 分子表達，抑制DCs 分化與成熟，調節(jié)相關炎癥因子的釋放，改善CIA大鼠模型的關節(jié)癥狀及炎癥，為白喉烏頭緩解類風濕關節(jié)炎作用機制提供了實驗依據(jù)。