張之，祖麗胡馬·熱合曼，董懷洋

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830017)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是由胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗導(dǎo)致的，以長期高血糖為特征的，由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用引起的代謝紊亂性疾病[1-2]。分泌胰島素的胰島β 細(xì)胞損傷是糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要起因[3-4]。胰島β細(xì)胞在高糖、高脂作用下易出現(xiàn)凋亡壞死，使血糖進(jìn)一步升高，形成惡性循環(huán)[5]。因此尋找抵抗糖毒性、脂毒性保護(hù)胰島β 細(xì)胞的天然藥物成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。尿石素A（Urolithin A，UA）是鞣花酸在腸道菌群作用下的代謝產(chǎn)物，該活性成分入血后發(fā)揮多種藥理活性[6]。據(jù)報(bào)道，尿石素A具有抗衰老、抗炎、抗糖尿病作用[7]，可改善糖尿病模型小鼠肝組織胰島素信號(hào)通路，促進(jìn)Akt磷酸化和Glut2 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入肝細(xì)胞[8]。UA 已被證實(shí)[9]是靶向PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路改善胰腺癌的一種有前途的治療方法。但尿石素A 對(duì)高糖、高脂環(huán)境下胰島β 細(xì)胞形態(tài)活力的影響缺乏詳細(xì)研究，對(duì)糖尿病關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白AMPK 、AKT、mTOR 是否有直接結(jié)合能力尚未見報(bào)道。本研究采用高糖、高脂損傷的MIN6胰島β細(xì)胞模型，探究尿石素A 對(duì)MIN6胰島β 細(xì)胞形態(tài)活力的影響及其作用的劑量、時(shí)間依賴性，通過分子對(duì)接方法預(yù)測UA 對(duì)上述糖尿病重要靶點(diǎn)蛋白的直接結(jié)合力，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器倒置顯微鏡（美國Thermo 公司）；Multiskan GO伯樂全波長酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器公司）。

1.2 試藥細(xì)胞活力試劑盒-8 (CCK-8)（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；UA（湖北齊飛醫(yī)藥化工，批號(hào)：FT19120401）；DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco's modified ea?gle medium,美國HyClone公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與模型建立

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)取小鼠MIN6胰島β細(xì)胞置于含10%胎牛血清、青霉素100 mol/mL、鏈霉素100 μg/mL 和1%β-巰基乙醇的DMEM 培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、貼壁、傳代，備用。

1.3.2 建立模型取對(duì)數(shù)生長期的MIN6 胰島β 細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL，接種于96 孔板，用含25 mmol/L 高糖DMEM 培養(yǎng)液分別誘導(dǎo)12、24、48、72 h，建立糖毒性不同誘導(dǎo)時(shí)間的MIN6胰島β細(xì)胞損傷模型。用含0.5 mmol/L 棕櫚酸的DMEM 培養(yǎng)液分別誘導(dǎo)12、24、48、72 h，建立脂毒性不同誘導(dǎo)時(shí)間的MIN6胰島β 細(xì)胞損傷模型。用含25 mmol/L 葡萄糖和含0.5 mmol/L 棕櫚酸的DMEM 培養(yǎng)液分別誘導(dǎo)12、24、48、72 h，建立高糖高脂毒性不同誘導(dǎo)時(shí)間的MIN6胰島β細(xì)胞損傷模型。

1.4 細(xì)胞分組與給藥取對(duì)數(shù)生長期的MIN6 胰島β細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL，接種于96 孔板。以24 h 為誘導(dǎo)時(shí)間分別建立的高糖、高脂、高糖高脂3種模型，將細(xì)胞分為正常組、高糖模型組、高脂模型組、高糖高脂模型組、UA 組（按照1.4、2.9、5.8、11.5 和23.0 μg/mL 5 個(gè)濃度進(jìn)行UA 藥物干預(yù)），選出UA（11.5 μg/mL）組，在不同誘導(dǎo)時(shí)間12、24、48、72 h 建立3種模型，觀察UA 干預(yù)不同時(shí)間的藥效，分為正常組、高糖模型組、高脂模型組、高糖高脂模型組、高糖+UA 組，高脂+UA 組，高糖高脂+UA 組。正常組用含葡萄糖5.5 mmol/L 的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)；3 種模型組中葡萄糖或/和棕櫚酸濃度見“1.3.2”，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察取生長狀態(tài)良好、細(xì)胞貼壁長滿瓶底的對(duì)數(shù)生長期MIN6 胰島β 細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制備成5×104個(gè)/mL 單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中（100 μL/孔，即每孔5×103個(gè)細(xì)胞），37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h 貼壁后按“1.4”項(xiàng)下細(xì)胞分組進(jìn)行藥物干預(yù)，每組5 個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中孵育36 h，倒置相差顯微鏡下（×100）觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.6 MIN6 細(xì)胞活力檢測按“1.4”項(xiàng)下細(xì)胞分組處理后，每孔加入CCK-8 溶液10 μL，在培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h，采用酶標(biāo)儀波長492 nm測定各孔光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力/%=（OD實(shí)驗(yàn)-OD空白）/（OD正常-OD空白）×100%。

1.7 UA 與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接從PDB 數(shù)據(jù)（https://www.rcsb.org/）下載度值最大的蛋白激酶B（AKT）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mTOR）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的3D 結(jié)構(gòu)（*PDB 格式），從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取化合物的2D結(jié)構(gòu)（*sdf 格式），利用Pymol 軟件對(duì)上述受體蛋白進(jìn)行去水、去有機(jī)小分子配體等操作。 采用AutoDock4.2.6 對(duì)接軟件對(duì)核心化合物配體和受體進(jìn)行加氫、加電子并分別保存為*PDBQT 格式。運(yùn)行Vina 對(duì)接，受體為剛性大分子，配體為柔性小分子，計(jì)算活性化合物與靶點(diǎn)蛋白的最優(yōu)結(jié)合能。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 7軟件繪圖，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，方差齊組間比較采用單因素ANOVA 分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 UA 對(duì)高糖、高脂、高糖高脂環(huán)境下MIN6 胰島β細(xì)胞形態(tài)的影響正常組MIN6胰島β細(xì)胞形態(tài)正常，粘附良好，呈不規(guī)則長尾梭形或瓦片狀，邊緣清晰；高糖、高脂或高糖脂模型組細(xì)胞大部分長尾和角不可見或縮成團(tuán)，黏附性降低，可見大量懸浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片，細(xì)胞數(shù)量減少；UA 組細(xì)胞黏附性有顯著恢復(fù)，大部分細(xì)胞重新長出長尾和角，懸浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片明顯減少，見圖1-3。

圖1 UA對(duì)高糖環(huán)境下MIN6胰島β細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2 不同濃度UA對(duì)糖脂毒性損傷的MIN6胰島β細(xì)胞活力影響與正常組比較，高糖模型組干預(yù)24 h 后細(xì)胞活力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與高糖模型組比較，UA（23.0 μg/mL）組干預(yù)24 h 后細(xì)胞活力顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與正常組比較，高脂模型組干預(yù)24 h 后細(xì)胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與高脂模型組比較，UA（5.8、11.5 μg/mL）組干預(yù)24 h 細(xì)胞活力顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與正常組比較，高糖高脂模型組干預(yù)24 h 后細(xì)胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與高糖高脂模型組比較，UA（1.4、2.9 μg/mL）組干預(yù)24 h 后細(xì)胞活力異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），UA（5.8、11.5、23.0 μg/mL）組干預(yù)24 h后細(xì)胞活力顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

圖2 UA對(duì)高脂環(huán)境下MIN6胰島β細(xì)胞形態(tài)的影響

圖3 UA對(duì)高糖高脂環(huán)境下MIN6細(xì)胞形態(tài)的影響

表1 UA不同濃度干預(yù)對(duì)糖脂毒性損傷的MIN6胰島β細(xì)胞活力影響（±s,n=3）

表1 UA不同濃度干預(yù)對(duì)糖脂毒性損傷的MIN6胰島β細(xì)胞活力影響（±s,n=3）

注:與正常組比較, *P<0.05, **P<0.01;與模型組比較,#P<0.05, ##P<0.01。

細(xì)胞活力/%組別劑量/（μg/mL）正常組模型組UA組高糖高脂環(huán)境99.98±1.92 48.21±3.04**46.85±4.09 53.33±2.74 59.87±4.49##68.32±2.87##59.25±3.02##--1.4 2.9 5.8 11.5 23.0高糖環(huán)境99.97±3.27 58.40±2.81**64.41±4.66 63.15±2.68 58.09±3.52 62.52±2.76 72.50±4.30##高脂環(huán)境99.96±3.12 50.80±4.22**55.28±2.54 54.64±3.50 60.73±3.37##68.16±2.93##58.94±2.99

2.3 UA 干預(yù)不同時(shí)間對(duì)糖脂毒性損傷MIN6 胰島β細(xì)胞活力的影響與正常組比較，高糖模型組干預(yù)12 h 后細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），高糖模型組干預(yù)24、48、72 h 后細(xì)胞活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與高糖模型組比較，高糖＋UA組干預(yù)12、24、48、72 h 后細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與正常組比較，高脂模型組干預(yù)12、24、48、72 h 后細(xì)胞活力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與高脂模型組比較，高脂＋UA 組干預(yù)24 h 后細(xì)胞活力顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與正常組比較，高糖高脂模型組干預(yù)12、24、48、72 h 后細(xì)胞活力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與高糖高脂模型組比較，高糖高脂+UA 組干預(yù)12、72 h后細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高糖高脂+UA組干預(yù)24、48 h后細(xì)胞活力顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2。

表2 UA干預(yù)不同時(shí)間對(duì)糖脂毒性損傷的MIN6胰島β細(xì)胞活力影響（±s,n=3）

表2 UA干預(yù)不同時(shí)間對(duì)糖脂毒性損傷的MIN6胰島β細(xì)胞活力影響（±s,n=3）

注:與正常組比較, *P<0.05, **P<0.01;與相對(duì)應(yīng)的模型組比較,#P<0.05, ##P<0.01。

細(xì)胞活力/%組別正常組高糖模型組高糖+UA組高脂模型組高脂+UA組高糖高脂模型組高糖高脂+UA組72 h 99.99±6.33 16.75±1.03**18.39±1.43 13.07±1.81**17.51±0.92 10.02±1.23**15.61±1.44 12 h 99.99±6.61 93.81±5.09 100.73±5.08 73.15±3.52**77.17±2.40 82.63±4.19**84.37±3.62 24 h 100.00±3.82 51.45±3.55**52.12±2.82 49.34±2.35**58.66±2.34##42.55±3.67**60.31±2.36##48 h 99.99±2.46 27.70±2.59**28.56±1.99 27.01±1.79**30.57±2.27 24.16±0.84**32.32±2.32##

2.4 UA 與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接對(duì)接評(píng)分均高于6，說明UA 與AKT、mTOR、AMPK 這些糖尿病核心靶點(diǎn)均具有良好的直接結(jié)合活性，見表3、圖4。

表3 UA與糖尿病靶點(diǎn)蛋白對(duì)接結(jié)果

圖4 UA與糖尿病核心靶點(diǎn)蛋白AKT1、mTOR、AMPK亞基對(duì)接圖

3 討論

高血糖和高血脂在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著非常重要的作用，可引起糖毒性、脂毒性反應(yīng)[10]，使得胰島β 細(xì)胞受到損傷，增加胰島β 細(xì)胞的凋亡，降低胰島β 細(xì)胞胰島素的分泌，引起胰島素抵抗，而胰島素抵抗又加重高血糖癥[11]。脂毒性是指血液中的游離脂肪酸含量超過脂肪組織的貯存能力，而各組織對(duì)游離脂肪酸的氧化能力降低，結(jié)果過剩的游離脂肪酸在非脂肪組織中以甘油三酯的形式沉積，導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞的凋亡和損傷[12]。Toney 等[13]研究證明UA 通過增強(qiáng)線粒體功能和生物合成來改善胰島素抵抗，并減輕肝臟中TG的積累，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞中M1/M2 極化。Tuohetaerbaike 等[14]利用2 型糖尿病小鼠模型研究UA 的抗糖尿病作用，結(jié)果表明UA 能顯著降低血糖血脂，并通過誘導(dǎo)自噬及調(diào)節(jié)AKT/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)糖尿病小鼠的胰腺保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，與正常MIN6胰島β細(xì)胞比較，單獨(dú)高糖、單獨(dú)高脂或高糖聯(lián)合高脂環(huán)境下MIN6 胰島β細(xì)胞損傷明顯：細(xì)胞碎片化、細(xì)胞皺縮、細(xì)胞數(shù)量明顯減少。MIN6胰島β 細(xì)胞對(duì)單獨(dú)高脂毒性比單獨(dú)高糖毒性更敏感，高糖干預(yù)12 h MIN6 胰島β 細(xì)胞活力下降不明顯，而高脂干預(yù)12 h 的MIN6 胰島β 細(xì)胞活力顯著下降為原來的70%左右。隨著高糖或棕櫚酸干預(yù)時(shí)間延長，MIN6 胰島β 細(xì)胞活力呈現(xiàn)時(shí)間依賴性逐步下降，高糖干預(yù)72 h MIN6 細(xì)胞活力下降為正常組的16%左右，高脂干預(yù)72 h,MIN6 細(xì)胞活力下降為正常組的13%左右，高糖聯(lián)合高脂作用72 h,MIN6 胰島β 細(xì)胞活力顯著下降為原來的10%左右,顯示出高糖高脂對(duì)MIN6胰島β細(xì)胞的協(xié)同毒性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尿石素A 干預(yù)顯著降低MIN6 胰島β 細(xì)胞損傷，改善細(xì)胞活力，尤其在高糖高脂環(huán)境下保護(hù)作用更顯著。課題組前期研究證明了尿石素A 對(duì)糖尿病小鼠胰腺的保護(hù)作用[15-16]，本實(shí)驗(yàn)從體外進(jìn)一步證明了尿石素A 對(duì)胰島β 細(xì)胞的保護(hù)作用。進(jìn)一步的分子DOCK 分析顯示尿石素A 藥物分子對(duì)蛋白AKT、mTOR、AMPK 有良好的結(jié)合能，揭示其保護(hù)胰島β 細(xì)胞的機(jī)制可能與直接靶向結(jié)合作用于糖尿病重要靶點(diǎn)蛋白AMPK、AKT、mTOR有關(guān)。