王 源 李微微 李秀婷 王紅安 朱 華孫寶國(guó) 張成楠 許 狂

(1.北京工商大學(xué) 食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心, 北京 100048；2.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院, 北京 100048；3.北京華都釀酒食品有限責(zé)任公司, 北京 102212)

中國(guó)傳統(tǒng)醬香型白酒的生產(chǎn)為典型的多菌種、開(kāi)放式固態(tài)發(fā)酵過(guò)程,由于釀造環(huán)境的影響,醬酒產(chǎn)品呈現(xiàn)出顯著的地域特點(diǎn)[1-2]。 醬香型白酒產(chǎn)區(qū)主要包括貴州、四川、山東、遼寧、北京等省市,其中貴州省是醬香型白酒的聚集產(chǎn)區(qū),產(chǎn)品風(fēng)格主體為“醬香、窖底香、醇甜香”[3]。 研究發(fā)現(xiàn),相較于貴州、四川等南方產(chǎn)區(qū)的醬香型白酒,在山東、遼寧等北方產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)的醬香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)有所不同。韓興林等[4]在北方地區(qū)采用相同的釀造工藝生產(chǎn)醬香型白酒,與南方產(chǎn)區(qū)醬酒相比,酒中的正丙醇、異戊醇、己酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)含量較高,而四甲基吡嗪等物質(zhì)顯著減少。 許多研究已證實(shí),醬香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)主要是在釀造過(guò)程中由微生物代謝產(chǎn)生,而環(huán)境微生物菌群種類及其豐度的差異顯著影響醬香型白酒的風(fēng)味[1]。 貴州省等南方醬酒產(chǎn)區(qū)屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候,雨量充沛、全年氣溫變化小,環(huán)境微生物較豐富,而北京、山東等地氣候?qū)倥瘻貛Ъ撅L(fēng)氣候,雨量集中,全年氣溫變化大,環(huán)境微生物相對(duì)單一[5]。 分析不同地區(qū)醬香型白酒釀造過(guò)程中環(huán)境微生物的功能差異,對(duì)了解其不同產(chǎn)區(qū)酒的品質(zhì)特征差異具有重要的意義。

高溫堆積發(fā)酵是醬香型白酒釀造過(guò)程的核心工藝,也是富集環(huán)境微生物的重要步驟之一[1,4]。 高溫堆積發(fā)酵是使經(jīng)過(guò)蒸煮、攤晾、拌曲后的酒醅堆積在釀酒場(chǎng)地中4 ～5 d,待堆子溫度、香味等理化感官指標(biāo)適宜后,便可將堆積后的酒醅移入窖池中,進(jìn)行密閉的入窖發(fā)酵[5]。 在高溫堆積發(fā)酵過(guò)程中,由于堆子各位點(diǎn)的溫度、水分和氧氣含量等理化條件的不同,導(dǎo)致堆子各位點(diǎn)的微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異,從而對(duì)酒的產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生一定影響。 在實(shí)際生產(chǎn)中,常常采用“倒堆”的方法,即翻倒、移動(dòng)堆子,減少堆子各位點(diǎn)的理化條件的差異,提高堆底、堆心等部位的氧氣含量,促使堆子溫度等條件快速達(dá)標(biāo)[6]。 高溫堆積發(fā)酵的主要目的是富集環(huán)境中的微生物,同時(shí)篩選、培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)微生物,使其產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體物質(zhì),為隨后的入窖發(fā)酵奠定基礎(chǔ)[7]。

目前,較多研究發(fā)現(xiàn),不同地區(qū)的醬香型白酒高溫堆積發(fā)酵過(guò)程中微生物的結(jié)構(gòu)存在明顯差異,由于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化與演替對(duì)于醬酒生產(chǎn)品質(zhì)十分關(guān)鍵,引起許多研究者的高度關(guān)注。 針對(duì)醬酒聚集產(chǎn)區(qū)高溫堆積發(fā)酵細(xì)菌的相關(guān)報(bào)道較多:王琳等[8]對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)一帶多個(gè)醬香型白酒廠房的各個(gè)輪次釀造環(huán)境進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析,發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)；胡小霞等[9]對(duì)赤水河畔醬香型白酒第一輪次堆積中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為Firmicutes；而Dai 等[10]對(duì)貴州某酒企不同輪次堆積過(guò)程進(jìn)行探討,確定其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為Firmicutes 和Proteobacteria。 對(duì)于北方地區(qū)醬香型白酒高溫堆積微生物的研究報(bào)道較少,僅有韓興林等[11]研究了山東青州地區(qū)醬香白酒堆積中的原核微生物,優(yōu)勢(shì)菌屬包括Proteobacteria 菌門(mén)的不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、Firmicutes 菌門(mén)的魏斯氏菌屬(Weissella)等12 種。

北京地區(qū)醬香型白酒的高溫堆積相關(guān)研究鮮有報(bào)道,不僅發(fā)酵過(guò)程中不同階段微生物的群落結(jié)構(gòu)變化不清楚,微生物間的相互作用關(guān)系亦不明晰?；诖?本研究擬采用高通量測(cè)序技術(shù)[12-13],對(duì)北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次高溫堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、演替規(guī)律和相互作用關(guān)系進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析,希望通過(guò)探討北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積生產(chǎn)過(guò)程中微生物變化的特點(diǎn),為科學(xué)揭示北京地區(qū)醬香型白酒釀造過(guò)程微生物特征提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為進(jìn)一步研究醬香型白酒風(fēng)味地域性差異的內(nèi)在機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

酒醅樣品采自北京華都釀酒食品有限公司。 對(duì)第六輪次堆積發(fā)酵的酒醅進(jìn)行采樣,從堆子成型開(kāi)始記為0 h,堆積發(fā)酵總計(jì)持續(xù)84 h,在64 ～66 h 對(duì)堆積的酒醅進(jìn)行“倒堆”操作。 分別在堆積發(fā)酵的不同時(shí)間點(diǎn)(0、24、48、66、72、78、84 h)的堆子上、中、下三層進(jìn)行取樣,每層的取樣位置固定,取樣后儲(chǔ)存于-80 ℃待用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

E.Z. N. A?Soil DNA Kit,美國(guó)Omega Bio-Tek公司；rTaq DNA 聚合酶試劑盒,北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker,寶生物工程(大連)有限公司；引物合成,上海生物工程股份有限公司； Gengreen 染料,上海賽百盛有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermal Cycler 型梯度PCR 儀,美國(guó)Bio-Rad 公司；Zealway G154DW 型高壓蒸汽滅菌鍋,致徽(廈門(mén))儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Sigma 公司；DYY-8C 型電泳儀,北京六一儀器廠；JS-680C 型凝膠成像儀,上海培清科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品總DNA 提取

取酒醅樣品10 g 于50 mL 離心管中,加入30 mL滅菌后的0.1 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)懸浮,加入5 ～7 顆玻璃珠,充分振蕩7 min,400 r/min 離心5 min,吸取上清液。 將沉淀用PBS 洗滌,漩渦振蕩4 min,400 r/min 離心5 min,收集上清液,重復(fù)用PBS 洗滌,直至得到40 ～50 mL 上清液。 將所得液體進(jìn)行12000 r/min 離心5 min,棄上清液,收集沉淀。 總DNA 提取步驟參照E.Z.N.A?Soil DNA Kit操作說(shuō)明。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增

采用16S rRNA 通用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R (5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 高變區(qū)V3 -V4。

PCR 條件為:95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；30 次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min,之后降至4 ℃。

PCR 擴(kuò)增體系包括:5 ×TransStart FastPfu buffer 4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,正向引物(5 μmol/L)0.8 μL,反向引物(5 μmol/L) 0.8 μL,TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.4 μL,模板DNA 10 ng,用ddH2O 補(bǔ)至20 μL。

1.3.3 Illumina Miseq 測(cè)序

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物,利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit 進(jìn)行純化,Tris-HCl 洗脫,再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。 利用QuantiFluorTM-ST 進(jìn)行檢測(cè)定量。將純化后的擴(kuò)增片段在Illumina MiSeq 平臺(tái)上構(gòu)建文庫(kù),并進(jìn)行測(cè)序,分別對(duì)細(xì)菌V3 -V4 高變區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Fastp 軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控,使用Usearch 軟件,在97%的相似性閾值水平下,對(duì)基因序列進(jìn)行OTU 聚類分析。 利用RDP Classifer 進(jìn)行分類學(xué)注釋分析。 Alpha 多樣性指數(shù)、優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度均采用單因素方差分析(one way analysis of variance,one way ANOVA)結(jié)合最小顯著性差異法(least-significant difference,LSD),分析不同堆積發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)樣品間的差異顯著性(P＜0.05)。通過(guò)Unweighted Unifrac 算法計(jì)算不同樣品間的距離,形成Beta 多樣性計(jì)算矩陣,并利用主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)進(jìn)行可視化展示。 利用Origin 2019b 軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alpha 多樣性分析

為探究北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化,對(duì)21 個(gè)酒醅樣品中原核微生物16S rRNA 基因的V3 -V4 可變區(qū)進(jìn)行序列分析[14-15],獲得了1821920 個(gè)有效基因序列。 OTU 聚類分析結(jié)果表明,堆積發(fā)酵樣品的基因序列聚類成730 個(gè)OTU。 基于OTU 聚類分析結(jié)果,對(duì)不同堆積時(shí)間的樣品進(jìn)行Alpha 多樣性分析,計(jì)算Chao 1 指數(shù)和Shannon 指數(shù),用以反映酒醅樣品中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性[16]。 Chao1 指數(shù)反映酒醅樣品中細(xì)菌群落的豐富度,Chao1 數(shù)值越大代表樣品中的物種數(shù)量越多；Shannon 指數(shù)反映酒醅樣品中細(xì)菌群落的多樣性,Shannon 指數(shù)的數(shù)值越小代表樣品中的細(xì)菌群落豐度的均勻性越差。Alpha 多樣性分析結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1(a)和圖1(c)表明,所有酒醅樣品基于Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)的稀釋曲線均逐漸趨向平緩,說(shuō)明對(duì)酒醅中微生物的多樣性分析已覆蓋樣品中的主要細(xì)菌種類[17]。 由圖1(b)可知,隨第六輪次堆積發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),酒醅樣品的Chao1 指數(shù)除66 h 外均無(wú)顯著性差異,表明第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中酒醅樣品中細(xì)菌種類的數(shù)量總體上無(wú)明顯差異；堆積發(fā)酵時(shí)間達(dá)到66 h 時(shí),酒醅樣品的Chao1指數(shù)顯著升高,這主要?dú)w因于在64 ～66 h 進(jìn)行的“倒堆”操作,富集釀造環(huán)境中的微生物,從而增加了酒醅中細(xì)菌種類的數(shù)量。 由圖1(d)可知,第六輪次堆積發(fā)酵0 h 時(shí),酒醅樣品中細(xì)菌的Shannon 指數(shù)最高,說(shuō)明此時(shí)細(xì)菌群落豐度的均勻性最好；隨堆積發(fā)酵時(shí)間的增加,Shannon 指數(shù)逐漸緩慢下降,在堆積結(jié)束的84 h 處顯著降低,說(shuō)明細(xì)菌群落豐度的均勻性在堆積過(guò)程中呈下降趨勢(shì)。 在第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中,細(xì)菌物種數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定,然而群落豐度出現(xiàn)了不均勻的發(fā)展趨勢(shì)。 胡小霞等[9]研究了貴州產(chǎn)區(qū)醬香型白酒第一輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)Shannon 指數(shù)隨時(shí)間呈下降趨勢(shì),與本研究結(jié)果相似。 這顯示出隨著發(fā)酵的進(jìn)行,較高的堆積溫度促使酒醅中的微生物進(jìn)一步自然篩選,推動(dòng)優(yōu)勢(shì)微生物群落的生長(zhǎng),為隨后入窖發(fā)酵提供特有的微生物基礎(chǔ)。 戴奕杰等[18]研究發(fā)現(xiàn),貴州產(chǎn)區(qū)的醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí),酒醅樣品中細(xì)菌群落的Shannon 指數(shù)為3.41,高于本研究的2.56(84 h)；Chao1 指數(shù)為348.91,高于本研究的326.49(84 h)。 這表明了相較于貴州產(chǎn)區(qū),北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)細(xì)菌群落的種類數(shù)量較少且均勻性較差。

圖1 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的Alpha 多樣性分析Fig.1 Alpha diversity analysis of bacterial community in the sixth heap fermentation process of sauce-flavor Baijiu produced in Beijing

2.2 細(xì)菌群落組成分析

為了探尋第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌多樣性變化的原因,本研究進(jìn)一步分析了第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中不同堆積發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)的酒醅樣品在門(mén)水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異,分析結(jié)果如圖2。

第六輪次堆積發(fā)酵樣品中所檢出的細(xì)菌群落歸屬于8 個(gè)門(mén)。 將相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌門(mén)定義為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén),由圖2 可知,樣品中的Firmicutes、Actinobacteria 和Proteobacteria 為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。 其中,Firmicutes 相對(duì)豐度最高,為89.34%(24 h) ～96.15%(72 h)。 王歡等[19]分析了貴州省產(chǎn)區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵中細(xì)菌群落組成,發(fā)現(xiàn)第六輪次的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Firmicutes、 Actinobacteria 和Proteobacteria,其中Firmicutes 相對(duì)豐度為75%左右。戴奕杰等[18]研究了同樣來(lái)源于貴州省產(chǎn)區(qū)的醬香型白酒,發(fā)現(xiàn)在第六輪次堆積發(fā)酵中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)包括Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria 和Bacteroidetes 等,其中Firmicutes 相對(duì)豐度約42%,Proteobacteria 相對(duì)豐度約46%。 由此可見(jiàn),北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度占優(yōu)勢(shì)的菌門(mén)與其他產(chǎn)區(qū)相同,但Firmicutes 的相對(duì)豐度較高,而Proteobacteria 的相對(duì)豐度較少。

圖2 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌在門(mén)水平上的群落組成Fig.2 Bacterial community structure at phylum level in the sixth heap fermentation process of sauce-flavor Baijiu produced in Beijing

在屬水平上,第六輪次堆積發(fā)酵樣品中所檢出的細(xì)菌群落歸屬于362 個(gè)屬(圖3)。 各個(gè)堆積發(fā)酵時(shí)間共有及各自獨(dú)有的菌屬數(shù)量如圖3(a),堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌在屬水平上的群落組成如圖3(b)。

由圖3(a)可知,7 個(gè)堆積發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的酒醅樣品中共有的細(xì)菌屬為106 個(gè)。 將相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌屬定義為優(yōu)勢(shì)菌屬,由圖3(b)可知,樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬共有14 個(gè):乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、慢生芽孢桿菌屬(Lentibacillus)、克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)、海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、norank_f_Sporolactobacillaceae、魏斯氏菌屬(Weissella)、norank_f_Actinopolysporaceae、 unclassified_f_Bacillaceae、棒狀桿菌屬(Corynebacterium_1)。 這些細(xì)菌屬也是其他產(chǎn)區(qū)醬香型白酒堆積發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬[19-25]。

圖3 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌在屬水平上的共有菌屬及群落組成Fig.3 Common bacterial genera and community structure at genus level in the sixth heap fermentation process of sauce-flavor Baijiu produced in Beijing

相較于其他產(chǎn)區(qū),北京地區(qū)醬香型白酒堆積發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬雖然與其他產(chǎn)區(qū)的菌屬組成相似,但是相對(duì)豐度存在明顯差異。 王歡等[19]研究發(fā)現(xiàn),貴州省醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度最高的細(xì)菌屬是Acinetobacter,占全部細(xì)菌屬的60%；而在北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中,Acinetobacter的相對(duì)豐度不足1%[圖3(b)]。研究表明,Acinetobacter在貴州省產(chǎn)區(qū)的釀酒環(huán)境和大曲中較豐富,在堆積發(fā)酵過(guò)程中從環(huán)境進(jìn)入酒醅參與醬香型白酒的釀造[20]。戴奕杰等[18]研究發(fā)現(xiàn),貴州省產(chǎn)區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)相對(duì)豐度較高,而在北京地區(qū)第六輪次堆積發(fā)酵中其相對(duì)豐度小于1%。Escherichia-Shigella是一種典型的環(huán)境微生物,貴州省產(chǎn)區(qū)較高的環(huán)境溫度與空氣濕度為其生長(zhǎng)提供了良好的生長(zhǎng)條件,而北京地區(qū)較低的環(huán)境溫度和濕度可能造成其生長(zhǎng)緩慢[21]。

大量文獻(xiàn)已報(bào)道,醬香型白酒堆積發(fā)酵過(guò)程中部分優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的動(dòng)態(tài)變化有明顯差異[11,22-23]。對(duì)比分析7 個(gè)堆積發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的酒醅樣品中細(xì)菌群落組成,可以發(fā)現(xiàn),優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬Lentibacillus、Lactobacillus的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)存在明顯差異,將兩菌屬單獨(dú)進(jìn)行顯著性差異分析,結(jié)果如圖4。 由圖4(a)可知,Lentibacillus相對(duì)豐度先升高后降低,在堆積發(fā)酵開(kāi)始時(shí)(0 h)為16.58%,在發(fā)酵48 h 時(shí)達(dá)到最高值26.99%；“倒堆”操作后,其相對(duì)豐度顯著下降,在堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)(84 h)為10.70%。Lentibacillus主要來(lái)源于大曲,其在醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的作用尚不清楚[20]。 由圖4(b)可知,Lactobacillus相對(duì)豐度總體呈上升趨勢(shì),在“倒堆”操作前(0 ～48 h),其相對(duì)豐度占比為8.99% ～17.75%；在“倒堆”操作后(66 ～84 h),其相對(duì)豐度顯著升高,為40.58%(72 h) ～57.04%(78 h)。 Zhang 等[24]研究發(fā)現(xiàn),堆積發(fā)酵過(guò)程中酒醅的溫度不同可以影響Lactobacillus的生長(zhǎng)代謝,進(jìn)而影響整體的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律。Lentibacillus、Lactobacillus相對(duì)豐度的變化直接導(dǎo)致了酒醅樣品中細(xì)菌群落豐度均勻性的變化,而這可能主要?dú)w因于堆積發(fā)酵過(guò)程中溫度等環(huán)境條件的改變。 在貴州省等醬香型白酒的主要產(chǎn)區(qū),遇到環(huán)境氣溫較低的月份,堆子容易出現(xiàn)升溫不正常或不升溫的現(xiàn)象,因此常采用“倒堆”操作,從而有效平衡堆子內(nèi)溫度、酸度、氧氣濃度等環(huán)境條件,改善堆積發(fā)酵狀況[6]；北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵在10月份,此時(shí)環(huán)境氣溫較低,堆子升溫緩慢,因此同樣采用“倒堆”操作以起到促使堆子升溫和均衡位點(diǎn)的作用。

圖4 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中Lentibacillus 和Lactobacillus 的相對(duì)豐度變化Fig.4 Changes in relative abundance of Lentibacillus and Lactobacillus in the sixth heap fermentation process of sauce-flavor Baijiu produced in Beijing

北京地區(qū)與其他醬香型白酒產(chǎn)區(qū)釀酒環(huán)境條件和堆積發(fā)酵工藝的不同,共同造成了各地堆積發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬演替變化的差異。

2.3 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

為進(jìn)一步探究北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,聚焦堆積發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度較高的細(xì)菌屬,分別計(jì)算兩兩細(xì)菌屬間的Spearman 相關(guān)系數(shù),繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖5。 由圖5 可知,第六輪次堆積發(fā)酵的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖包含44 個(gè)細(xì)菌屬間的正相關(guān)關(guān)系,17個(gè)負(fù)相關(guān)關(guān)系。 相關(guān)性分析表明,大多數(shù)細(xì)菌屬之間呈正相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。

圖5 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Correlation network of bacterial communities in the sixth heap fermentation process of sauce-flavor Baijiu produced in Beijing

相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中的高相關(guān)性關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)是指與一定數(shù)量的其他微生物均有相關(guān)性的微生物[9],又稱hubs,其數(shù)量和種類可在一定程度上反映微環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[25]。 在圖5 中,共發(fā)現(xiàn)17個(gè)hubs,其中,相對(duì)豐度較高的Lactobacillus和Lentibacillus菌屬(圖4),在相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中與多個(gè)菌屬存在負(fù)相關(guān)性關(guān)系；Lactobacillus作為核心負(fù)相關(guān)性hubs 之一,與10 個(gè)細(xì)菌屬間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系,表明Lactobacillus對(duì)部分細(xì)菌屬有顯著的抑制作用,這一結(jié)果與胡小霞等[9]、Wang 等[23]和Wang 等[26]的研究結(jié)果相似。 在堆積發(fā)酵過(guò)程中,Lactobacillus通過(guò)代謝可發(fā)酵性糖產(chǎn)生大量乳酸、乙酸等酸性物質(zhì),顯著降低酒醅的pH 值,進(jìn)而抑制不耐酸微生物的生長(zhǎng)[23]。 這可能是Lactobacillus在“倒堆”操作后相對(duì)豐度顯著升高的原因之一。 由圖5 還可發(fā)現(xiàn),Lentibacillus作為核心正相關(guān)性hubs 之一,與7 個(gè)細(xì)菌屬呈正相關(guān)關(guān)系,這可能是Lentibacillus在“倒堆”操作前相對(duì)豐度較高的原因之一,其內(nèi)在機(jī)理有待進(jìn)一步研究。 另外,Staphylococcus與Saccharopolyspora作為核心正相關(guān)性hubs,分別與9 個(gè)、8 個(gè)細(xì)菌屬間存在正相關(guān)關(guān)系。 這些微生物間的相互作用關(guān)系構(gòu)成了發(fā)酵過(guò)程中的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制,維持了整個(gè)發(fā)酵體系的自然穩(wěn)態(tài)發(fā)展和動(dòng)態(tài)平衡[9]。

2.4 Beta 多樣性分析

北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中,樣品細(xì)菌群落的Beta 多樣性分析結(jié)果如圖6。

圖6 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的Beta 多樣性分析Fig.6 Beta diversity analysis of bacterial community in the sixth heap fermentation process of sauce-flavor Baijiu produced in Beijing

由圖6 發(fā)現(xiàn),“倒堆”操作后(66、72、78、84 h)相較于“倒堆”操作前(0、24、48 h)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著的差異。 優(yōu)勢(shì)菌屬Lentibacillus和Lactobacillus在倒堆前后的變化最為明顯[圖4(a)和圖4(b)],Lentibacillus從“倒堆”前的26.99%(48 h)下降到19.51%(66 h)；Lactobacillus從“倒堆”前的15.31%(48 h)上升到了43.91%(66 h)；。 隨著堆積發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),堆子不同位置的溫度、酸度和氧氣濃度等出現(xiàn)明顯差異,通過(guò)“倒堆”操作可以有效平衡這些環(huán)境條件的差異,促進(jìn)優(yōu)勢(shì)菌群的演替[6]。 袁再順[27]研究發(fā)現(xiàn),貴州省產(chǎn)區(qū)醬香型白酒在“倒堆”前后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化,與本研究結(jié)論相反,這可能與具體操作工藝差異有關(guān),具體原因有待進(jìn)一步比較研究。

3 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序方法分析了北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化。 研究結(jié)果表明:

1)在細(xì)菌菌群種類數(shù)量上,堆積發(fā)酵前后無(wú)明顯變化,相較于其他產(chǎn)區(qū),北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)細(xì)菌菌群種類數(shù)量較少；

2)堆積發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)按相對(duì)豐度從 高 到 低 排 序 為Firmicutes、 Actinobacteria、 Proteobacteria,相較于其他產(chǎn)區(qū),北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中Firmicutes 相對(duì)豐度較高,占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),而Proteobacteria 的相對(duì)豐度較少；

3)堆積發(fā)酵過(guò)程中共有14 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬,其中,優(yōu)勢(shì)菌屬Lactobacillus相對(duì)豐度從17.75%(0 h)上升至51.31% (84 h),Lentibacillus相對(duì)豐度從16.58%(0 h)下降至10.70%(84 h),相較于其他產(chǎn)區(qū),北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過(guò)程中Acinetobacter等相對(duì)豐度較低。

希望本研究可為了解北京地區(qū)醬香型白酒釀造過(guò)程中細(xì)菌群落演替提供數(shù)據(jù)支撐,為探究不同產(chǎn)區(qū)白酒釀造的特征差異提供科學(xué)基礎(chǔ)。