趙婧邑 郭 燕 馮婷婷 陳 靜 孫欽菊 劉繼棟

(1.廣西大學 輕工與食品工程學院, 廣西 南寧 530004；2.廣西南亞熱帶農業(yè)科學研究所, 廣西 龍州 532415；3.廣西農業(yè)職業(yè)技術大學 食品工程系, 廣西 南寧 530007)

蒜糖醇是一種高值的六碳稀有糖醇,是多種稀有糖轉化的中間體,具有熱量低、降血壓、防便秘等特性,對糖尿病及其并發(fā)癥有明顯的防治作用[1]。當前,蒜糖醇主要從海濱錦葵中提取,然而,蒜糖醇在自然界中存在量極少,產物提取源受產地、季節(jié)、植物提取部位等因素限制,難以滿足日益增長的市場需求[2]。 D-葡萄糖經化學電解還原法可以生產蒜糖醇,但生產過程會消耗大量能源,污染環(huán)境,且副產物多,難以推廣至工業(yè)化生產[3]。 相比之下,生物合成具有反應條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)勢,利用生物技術生產高值化合物已處于新興主導地位。

多酶級聯(lián)是指在一個反應系統(tǒng)中至少有2 個酶催化反應同時進行的合成策略,反應過程中無需對中間產物進行分離,可以直接獲得目標產物[4]。 基于稀有糖轉化(Izumoring)策略,Zhu 等[5]利用級聯(lián)技術建立了D-果糖轉化為蒜糖醇的細胞工廠,100 mmol/L 的果糖為底物可以產生10.62 g/L 的蒜糖醇。 為了進一步降低底物成本,Wen 等[6]通過在胞外固定化葡萄糖異構酶(glucose isomerase, GI),聯(lián)合體外酶催化和靜息細胞生物轉化,以50 g/L葡萄糖為底物生產得到12.7 g/L 蒜糖醇。 然而,酶的純化和固定化步驟繁瑣,催化終點處蒜糖醇產率低下,且存在中間產物傳遞受阻的問題。 與之相比,利用體內多酶級聯(lián)策略構建細胞工廠使催化劑在空間位置上靠得更近,縮短了催化反應底物傳輸?shù)穆窂?有利于提高催化效率[7]。 本研究擬通過在大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)體內構建多酶級聯(lián)表達系統(tǒng),創(chuàng)新性實現(xiàn)D-葡萄糖到蒜糖醇的胞內從頭合成,并對生產條件以及體內級聯(lián)催化系統(tǒng)的結構進行優(yōu)化,旨在為低成本、規(guī)?；a蒜糖醇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

來源于產堿普羅威登斯菌(Providencia alcalifaciens)的核糖醇編碼基因rdh和假絲酵母(Candida boidinii)的甲酸脫氫酶編碼基因fdh,由生工生物工程(上海)股份有限公司經密碼子優(yōu)化后合成,分別連接至表達載體pET -32a( + )。 菌株E. coliDH5α、E. coliBL21(DE3),質粒pACYCDuet -1、pETDuet-1、pRSFDuet-1,攜帶Bacillussp. (NCIM 59)gi基因的表達載體pET32a( +)-gi和攜帶Clostridium bolteae dpe基因的表達載體pET32a( +)-dpe,廣西大學發(fā)酵工程實驗室保存。 PrimeSTAR、限制性核酸內切酶,寶生物工程(大連)有限公司；無縫克隆試劑盒、DNA Marker、NAD+粉末、DNA 連接酶、SDS-PAGE 電泳試劑盒及蛋白Marker,生工生物工程(上海)股份有限公司；2 ×Rapid Taq Master Mix、質粒DNA 提取試劑盒、產物回收試劑盒,南京諾唯贊生物科技有限公司；D-阿洛酮糖標準品、蒜糖醇標準品,上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HPLC 1260 型高效液相色譜儀,美國安捷倫科技公司；JY92-IIN 細胞破碎儀,寧波新芝生物科技股份有限公司；WIX-easyPRO4 型蛋白電泳儀,北京韋克斯科技有限公司；5424R 型高速冷凍離心機,美國艾本德有限公司；ZWYR-2403B 型恒溫震蕩搖床,上海智城分析儀器制造有限公司；ST3100 型精密pH 計,常州奧豪斯儀器有限公司；T100 型PCR儀,上海伯樂生命醫(yī)學產品有限公司；BMJ-160C 型霉菌培養(yǎng)箱,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大腸桿菌培養(yǎng)

LB 培養(yǎng)基配置(g/L):酵母提取物5、氯化鈉10、蛋白胨10。 調pH 值為7,121 ℃滅菌20 min 后用于E. coli的培養(yǎng)。E. coli抗性篩選時,氯霉素、氨芐青霉素和卡那霉素的終質量濃度分別為50、100、50 μg/mL。

1.3.2 重組表達菌株的構建

核酸序列測定、引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成,以質粒pET-32a( +)-gi、pET-32a( +)-dpe、pET-32a( +)-rdh和pET-32a( +)-fdh為模板,采用相應的引物(表1)對目的基因進行PCR 擴增,將目的基因依次連接至表達載體pACYCDuet-1、pETDuet-1、pET-32(a) +、pRSFDuet - 1, 以 構 建 重 組 載 體 pAgidpe、 pEfdhrdh、32fdhlrdh和pRgidpe,并轉于克隆菌株E. coliDH5α進行驗證。 將驗證正確的目的重組載體共轉于重組菌E. coliBL21(DE3),通過雙抗篩選陽性轉化子,驗證正確即得到雙質粒共表達重組菌。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.3.3 重組菌株蛋白表達測定

將表達菌株接種至含有相應抗生素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)后的菌液以1%接種量接種至裝有50 mL LB培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中,于37 ℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)2 ～3 h 至OD600為0.6 ～0.8,加入終濃度為1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG),于20 ℃、200 r/min 誘導24 h。收集誘導后的菌體,重懸后超聲破碎細胞,細胞破碎儀的工作條件為功率400 W 工作2 s,間歇3 s,總時間15 min。 將破壁后的菌體懸濁液于4 ℃、8000 r/min 條件下離心20 min,取上清液進行SDSPAGE 鑒定。

1.3.4 酶活測定

以25 g/L D-葡萄糖、D-果糖作為催化底物,加入200 μL GI、D-阿洛酮3-差向異構酶(D-psicose 3-epimerase,DPEase) 粗酶液及1 mmol/L 的Co2+,40 ℃、pH 值8.0 催化10 min 后,立即沸水浴10 min終止反應；以25 g/L D-阿洛酮糖作為催化底物,加入200 μL 核糖醇脫氫酶(ribitol dehydrogenase,RDH) 粗 酶 液、1 mmol/L 的Co2+及0.03 g/L 的NADH,40 ℃、pH 值8.0 催化10 min 后,立即沸水浴10 min 終止反應；以100 mmol/L 甲酸鈉作為催化底物,加入200 μL 甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase,FDH)粗酶液及1 mmol/L 的NAD+,40 ℃、pH 值8.0 催化2 min 后,立即沸水浴10 min 終止反應。 GI、DPEase、RDH 和FDH 酶活定義為單位時間內,標準條件下生成1 μmol 目標產物所需的酶量。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

為優(yōu)化細胞產酶條件,200 r/min 條件下,分別改 變 IPTG 終 濃 度(0.25、 0.50、 0.75、 1.00、1.25 mmol/L)、發(fā)酵溫度(15、20、25、30、35 ℃)和誘導時間(6、12、18、24、30 h)。 誘導結束后分別測定發(fā)酵終點的OD600與全細胞催化活性。

1.3.6 蒜糖醇合成條件優(yōu)化及全細胞催化活性測定

為優(yōu)化多酶級聯(lián)系統(tǒng)催化效率,將終質量濃度25 g/L 的葡萄糖、1 mmol/L 的Co2+、不同質量濃度的甲酸鈉(0.5、1.0、3.0、5.0、7.0 g/L)和不同終質量濃度的全細胞(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/mL)加入至50 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖體系中,改變緩沖體系pH 值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)和反應溫度(30、35、40、45、50 ℃),反應30 min 后煮沸10 min 終止反應。 葡萄糖、果糖、阿洛酮糖及蒜糖醇的檢測采用Carbomix Pb-NP 色譜柱(7.8 mm ×300 mm,10 μm)和1260 RID (G1362A)檢測器,柱溫78 ℃,流動相為超純水,流速為0.5 mL/min,單次樣品分析采集時間為40 min[6]。 全細胞催化活性定義為1 g 干細胞單位時間內催化合成蒜糖醇的量,將最高全細胞催化活性定義為相對酶活100%。 細胞質量濃度(CB)按式(1)計算[8],單位g/L。

1.3.7 糖蜜預處理

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均測定3 次,采用Origin 9 處理數(shù)據(jù),Adobe Illustrator 2020 處理圖片。

2 結果與分析

2.1 上下游酶系表達載體與蒜糖醇細胞工廠的基礎構建結果

為建立一種經濟、綠色、高效的合成蒜糖醇的方法,實現(xiàn)葡萄糖生成蒜糖醇,分別對GI、DPEase、RDH 及FDH 4 種酶轉化能力進行驗證。 將分別攜帶4 種酶編碼基因的BL21(DE3)/pET32a( +)系列重組菌進行誘導表達后,進行SDS-PAGE 分析和酶活測定,測定結果見圖1。 由圖1(a)可知,泳道1 ～4 分別在Snapgene 軟件預測結果的相應位置處(63.0、52.2、43.9、58.2 kDa)有明顯的條帶,分別對應GI、DPEase、RDH 和FDH 蛋白。 以BL21(DE3)/pET32a( +)為對照菌株進行吸光度和酶活測定,結果見表2。 4 種酶均顯示出相應的催化活性,說明已成功實現(xiàn)GI、DPEase、RDH 和FDH 在E. coliBL21(DE3)的可溶性表達,且四酶級聯(lián)系統(tǒng)有催化葡萄糖生產蒜糖醇的潛力。

表2 GI、DPEase、RDH、FDH 在大腸桿菌中的酶活Tab.2 Enzymatic activities of GI, DPEase, RDH and FDH in E. coli

按照1.3.1 構建蒜糖醇基礎細胞工廠BL21(DE3)/pAgidpe-pEfdhrdh,其SDS-PAGE 結果見圖1(b)。圖1(b)結果顯示,與對照相比,泳道1 和2分別在預測結果處顯示明顯蛋白條帶(46.9、34.7、26.4、42.1 kDa),對應GI、DPEase、RDH 及FDH 蛋白,表明四酶體系在表達宿主E. coliBL21(DE3)中同時成功表達,蒜糖醇基礎細胞工廠構建成功。

圖1 重組大腸桿菌表達產物的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression products of recombinant E. coli

2.2 基礎細胞工廠發(fā)酵條件優(yōu)化結果

基礎細胞工廠發(fā)酵條件優(yōu)化結果見圖2。 用乳糖操縱子作為啟動子進行蛋白質表達時需要誘導物進行誘導,IPTG 是一種作用極強的誘導劑,在結構上與乳糖相似,不被細菌代謝而十分穩(wěn)定[9]。 IPTG濃度對菌體的生長和產酶水平有著顯著的影響。 由圖2(a)可知,重組菌的生物量隨著IPTG 濃度的增加而下降,當IPTG 濃度為1.25 mmol/L 時,重組菌OD600驟降至1.25,可能是由于高濃度的IPTG 對大腸桿菌細胞產生了明顯的毒性,抑制了細胞的生長。然而,隨著IPTG 濃度在0.25 ～1.00 mmol/L 升高,由于單位菌體產酶量逐漸增加,全細胞催化活性逐漸提升,當IPTG 濃度為1.00 mmol/L 時,催化活性達到最大值。 因此,最終確定IPTG 的優(yōu)化誘導濃度為1.00 mmol/L。

圖2 不同發(fā)酵條件對重組細胞生物量和催化活性的影響Fig.2 Effect of different fermentation conditions on biomass and catalytic activities of recombinant strains

誘導溫度對菌體生長、質粒穩(wěn)定性和外源蛋白合成等都有重要影響[10]。 大腸桿菌最適生長溫度為37 ℃,然而一方面,過高的誘導溫度會導致胞內蛋白質合成速率過快,進一步導致蛋白質因無法正確折疊而形成無活性的包涵體,因此在對重組菌進行誘導表達時常控制誘導溫度在35 ℃以下；另一方面,溫度過低會影響重組菌的生長繁殖。 因此,確定最佳誘導溫度對平衡細胞產活性酶和重組菌的生物量至關重要。 由圖2(b)可知,當誘導溫度高于25 ℃時,全細胞催化活性明顯下降,可能是由于誘導溫度的升高導致胞內包涵體蛋白量增加。 綜合實驗結果,確定20 ℃為優(yōu)化誘導溫度。

盡可能在短時間內達到最高的催化活性對工業(yè)生產有良好的指導意義。 由圖2(c)可知,隨著誘導時間的延長,菌體量和催化活性逐漸升高,誘導18 h后,催化活性基本趨于穩(wěn)定,24 h 后催化活性無明顯增加,且細胞密度有所降低,可能是由于IPTG 長時間在胞內不能被菌體代謝,對細胞產生了毒害作用。最終確定優(yōu)化誘導時間為24 h。

2.3 靜息細胞催化條件優(yōu)化結果

多酶級聯(lián)系統(tǒng)中,各個元件酶都有其最適的催化條件,協(xié)調這些催化條件才能使得整個催化系統(tǒng)發(fā)揮出整體最大的催化效率。 在多酶級聯(lián)系統(tǒng)的溫度閾值范圍內,提高溫度可以促進級聯(lián)反應向生成產物方向推進,然而超過閾值后,溫度的升高會影響蛋白酶的折疊,破壞蛋白酶大分子的三維結構,導致酶失去活性[11]。 全細胞催化條件優(yōu)化結果見圖3。由圖3(a)可知,全細胞催化活性隨溫度升高而逐漸增加,當溫度達到40 ℃時達到最大值；隨著溫度繼續(xù)升高,活性顯著下降,當催化溫度為50 ℃時,催化活性只有最大值的51.94%。 因此,確定40 ℃為優(yōu)化催化溫度。

pH 值通過影響蛋白質的空間構型、穩(wěn)定性以及底物的解離狀態(tài)影響多酶級聯(lián)系統(tǒng)的催化效率[12]。由圖3(b)可知,pH 值7.0 ～9.0 時,當pH 值小于8.0 時,催化活性隨著pH 值的增加而升高；在pH值為8.0 時,催化活性達到最大；然而當pH 值繼續(xù)升高時,活性呈現(xiàn)下降趨勢,證明過低或過高的pH值均不利于級聯(lián)反應的進行。 因此,合成蒜糖醇的優(yōu)化pH 值為8.0。

2018 International training workshop on environment friendly and safety of household care chemical products convered 10 59

在單位體積內,全細胞催化活性與菌體質量濃度成正比,然而,轉化效率不會隨著菌體質量濃度的增加而持續(xù)增加,為平衡經濟性與高效性,需確定最高轉化效率時的菌體質量濃度。 由圖3(c)可知,當?shù)孜镔|量濃度固定為25 g/L,催化體系中細胞質量濃度在0.01 ～0.05 g/mL 時,催化活性隨菌體質量濃度的增加而顯著提高；隨著菌體質量濃度的繼續(xù)增加,催化活性趨于穩(wěn)定。 最終確定在25 g/L 的底物條件下,催化體系中優(yōu)化菌體質量濃度為0.05 g/mL。

在多酶級聯(lián)系統(tǒng)中,甲酸鈉作為輔底物參與了下游酶系中的氧化還原反應模塊,因此甲酸鈉的質量濃度對蒜糖醇的生成率也有一定的影響,因此探究了甲酸鈉添加量對全細胞催化活性的影響。 由圖3(d)可知,除輔底物終質量濃度為1.0 g/L 外,全細胞催化活性隨甲酸鈉質量濃度的增加而提升；當甲酸鈉的質量濃度為5.0 g/L 時,全細胞催化活性最高；繼續(xù)提高甲酸鈉質量濃度,催化活性無明顯變化。 因此,確定甲酸鈉的優(yōu)化質量濃度為5.0 g/L。

采用優(yōu)化催化條件對基礎細胞工廠BL21(DE3)/pAgidpe-pEfdhrdh的轉化能力進行驗證,結果見圖4。 0 ～12 h 內,催化體系內蒜糖醇產量明顯增多；12 ～15 h,體系內蒜糖醇的合成速率下降,蒜糖醇產量趨于穩(wěn)定。 在催化終點處,體系內剩余4.95 g/L 葡萄糖,轉化率為80.20%,并有19.33 g/L蒜糖醇生成,產率達77.32%。 因此,本研究構建的多酶級聯(lián)系統(tǒng)能夠正常催化D-葡萄糖合成蒜糖醇。然而,反應過程仍存在細胞催化活性低,反應前期中間產物有大量積累的問題,且催化終點處仍有底物D-葡萄糖未被轉化。 因此需要進一步優(yōu)化表達體系,從而提高全細胞多酶級聯(lián)系統(tǒng)的催化效率。

圖4 BL21(DE3)/pAgidpe-pEfdhrdh 催化D-葡萄糖生成蒜糖醇Fig.4 Biosynthesis of allitol from D-glucose by BL21(DE3)/pAgidpe-pEfdhrdh

2.4 體內多酶級聯(lián)系統(tǒng)優(yōu)化結果

2.4.1 上游基因質?？截悢?shù)提升結果

大腸桿菌雙表達框質粒pACYCDuet -1、pETDuet-1 和pRSFDuet-1 的基因拷貝數(shù)分別為10、40和100[13]。 為提升底物的轉化率,需提高上游酶系的表達量。 本研究選擇了高拷貝載體pRSFDuet-1作為表達載體骨架進行上游酶系的構建。 將重組質粒pRgidpe和pEfdhrdh共轉化于表達菌株E. coliBL21(DE3),經Kan 與Amp 雙抗性篩選陽性轉化子,得到蒜糖醇細胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-pEfdhrdh,構建示意圖見圖5(a)。 細胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-pEfdhrdh的SDS-PAGE 結果見圖5(b)。由圖5(b)可知,與對照組相比,泳道3 在46.9、34.7、26.4、42.1 kDa 處顯示明顯的蛋白條帶,分別與GI、DPEase、RDH 和FDH 蛋白質的預測結果大小一致,表明四酶體系在表達宿主E. coliBL21(DE3)中同時成功表達。

圖5 細胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-pEfdhrdh 構建示意圖和SDS-PAGE 分析Fig.5 Schematics and SDS-PAGE analysis of cell factory BL21(DE3)/pRgidpe-pEfdhrdh

2.4.2 下游酶系的融合表達結果

蛋白質融合可以在多酶活性中心位點間形成底物通 道, 甘 氨酸 G 和 絲 氨 酸 S 的 GS 組 合(GGGGS)n可以通過改變n的大小實現(xiàn)結構域之間距離的放大和減小[14]。 為減少中間產物的積累,將輔酶循環(huán)系統(tǒng)中的RDH 和FDH 通過柔性linker(GGGGS)3進行連接,在縮短兩蛋白質空間距離的同時,實現(xiàn)結構域的分離,保證RDH 和FDH 的單獨活性,構建示意圖見圖6(a)。 將重組質粒pRgidpe與32fdhlrdh共轉化于表達菌株E. coliBL21(DE3),經Kan 與Amp 雙抗性篩選陽性轉化子,得到蒜糖醇細胞工廠 BL21 (DE3)/ pRgidpe-32fdhlrdh,其SDS - PAGE 結果見圖6 (b)。 由圖6(b)可知,與對照組相比,泳道6 在預測結果46.9、34.7、85.1 kDa 處顯示明顯的蛋白質條帶,表明多酶體系在表達宿主E. coliBL21(DE3)中同時成功表達。

圖6 細胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-32fdhlrdh構建示意圖和SDS-PAGE 分析Fig.6 Schematics and SDS-PAGE analysis of cell factory BL21(DE3)/pRgidpe-32fdhlrdh

2.5 重組大腸桿菌全細胞合成蒜糖醇結果

在優(yōu)化催化條件下,分別對BL21 (DE3)/pRgidpe- pEfdhrdh和 BL21 ( DE3)/pRgidpe-32fdhlrdh多酶級聯(lián)催化系統(tǒng)的反應特性進行研究,反應進程產物變化見圖7。 由圖7(a)可知,與基礎細胞工廠BL21(DE3)/pAgidpe-pEfdhrdh相比,在相同的反應條件下,0.05 g/mL 細胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-pEfdhrdh對底物D-葡萄糖的利用率有所提升,催化終點葡萄糖的殘?zhí)橇拷抵?.05 g/L,蒜糖醇的產量達到20.27 g/L,然而在反應前期中間產物仍有明顯積累。 由圖7(b)可知,進一步融合表達下游酶系后,0.05 g/mL 細胞工廠BL21(DE3)/pRgidpe-32fdhlrdh催化進程顯示,反應達到終點的時間由12 h 縮短至9 h。 反應前期中間產物的質量濃度明顯降低,反應終點處D-葡萄糖殘留量進一步下降至3.70 g/L,蒜糖醇的產量達到21.12 g/L。 相較于Wen 等[6]的研究,本研究利用更低質量濃度的葡萄糖(25 g/L)為底物,以全細胞為催化劑,將蒜糖醇的產量提升了66.28%。

圖7 不同細胞工廠催化D-葡萄糖生物合成蒜糖醇Fig.7 Biosynthesis of allitol from D-glucose by different cell factories

廢糖蜜是制糖過程中在進行末端糖膏分離時的主要副產物,價格低廉,含有豐富的糖類物質,現(xiàn)已作為一種廉價碳源被廣泛用于發(fā)酵行業(yè)。 微波硫酸法可以有效地將糖蜜中的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。 預處理后的糖蜜樣品中含有(1.17 ±0.63) g/L蔗糖、(116.97 ± 0.29) g/L 葡萄糖和(110.10 ±1.37) g/L 果糖。 為探究pRgidpe-32fdhlrdh菌株的工業(yè)適用性,在優(yōu)化條件下,取220 μL 糖蜜樣品作為唯一碳源進行催化實驗,結果見圖8。 由圖8 可知,催化終點處生成37.62 g/L 蒜糖醇,證明pRgidpe-32fdhlrdh是利用糖蜜生產蒜糖醇的潛力菌株。

圖8 葡萄糖和蒜糖醇HPLC 檢測結果Fig.8 HPLC detection results of glucose and allitol

3 討 論

隨著稀有糖的需求量不斷提升,開發(fā)一種高效、廉價的蒜糖醇生產方法已成為近年來的研究熱點。與以純酶或粗酶參與的體外級聯(lián)方式相比,體內多酶級聯(lián)系統(tǒng)采用全細胞方式催化整個反應,無需復雜的蛋白質純化步驟[15]。 同時,由于微生物可以將酶與惡劣的外環(huán)境隔離,使酶在內環(huán)境中保持更穩(wěn)定的催化活力[16]。 構建完成的細胞工廠可以通過發(fā)酵培養(yǎng)快速大量獲得,對于多酶級聯(lián)系統(tǒng)的工業(yè)規(guī)?；瘧镁哂兄匾囊饬x。 本研究構建了攜帶GI、DPEase、RDH 和FDH 編碼基因的重組大腸桿菌,成功實現(xiàn)以葡萄糖為底物合成蒜糖醇。 然而,在優(yōu)化反應條件下,仍存在細胞催化活性低,反應時間長的問題。

外源基因的表達量通常隨質?？截悢?shù)的增加而提高,因此,質粒拷貝數(shù)的變化影響了目標產物的得率[17]。 有研究使用高拷貝質粒使得目標酶在微生物宿主中充分表達,然而進一步研究發(fā)現(xiàn),由于所表達蛋白質的性質差異,工程菌所攜帶的質粒拷貝數(shù)與蛋白質表達量不一定成比例關系,高拷貝質粒會增加細胞的代謝壓力,且導致蛋白質的錯誤折疊[18-19]。 因此,進一步了解質?？截悢?shù)對蒜糖醇合成酶系的影響,對于提高葡萄糖的利用率,進而增加目標產物的產率是十分必要的。 本研究結果表明:質?？截悢?shù)的提高使得葡萄糖轉化率升高,即使用高拷貝數(shù)質粒有效提高了上游酶系的胞內表達量,該結果與何成等[20]的研究結果相似。

在多酶級聯(lián)催化系統(tǒng)中,縮短蛋白酶之間的距離可以促進中間產物的轉運,減少中間產物的積累[21]。 通過基因融合引入linker 連接肽將多酶組裝形成復合體,可以拉近蛋白酶活性中心之間的空間距離,形成相應的底物通道,是一種高效、經濟的提高多酶催化效率和輔因子再回收的組裝策略[22]。 Jeon 等[23]將乙醇脫氫酶(ADH)和單加氧酶(BVMOs)進行融合,構建了從長鏈仲醇到酯的大腸桿菌轉化平臺,相較于游離表達2 個酶,融合蛋白ADH-Gly-BVMO 的表達使細胞催化效率提高了40%。 然而也有研究表明,不同組分和長度的連接肽可能會導致蛋白質在胞內錯誤折疊,使其催化活力損失[24]。 本研究結果表明:融合酶維持了結構域靈活性和2 個親代酶功能的特性,有效促進了中間產物的轉運和輔因子的循環(huán),進而解決了反應前期中間產物大量積累的問題,縮短了反應到達終點的時間。

4 結論

本研究以大腸桿菌為底盤細胞,利用GI、DPEase 和RDH 催化葡萄糖生成蒜糖醇,并偶聯(lián)FDH 進行輔酶再生,成功實現(xiàn)了利用微生物細胞工廠以廉價底物合成高值化合物蒜糖醇的目的。通過上游酶系拷貝數(shù)的提升與下游酶系的融合表達,在促進了葡萄糖轉化的同時,也減少了反應前期中間產物的積累,縮短了反應達到催化終點的時間,進一步提升了蒜糖醇的產量與全細胞催化活性。 本研究旨在為蒜糖醇的工業(yè)生產建立一種簡單、經濟和生態(tài)友好型的生物合成方法,為有效提高制糖工業(yè)的經濟效益和廢糖蜜的進一步綜合利用提供途徑。