王鵬凱，李圣法，劉尊雷，金 艷，姜亞洲，張 輝，張 翼

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306）

魚類在仔稚魚階段游泳能力較弱，海流等物理海洋過程的作用驅(qū)動了仔稚幼魚的輸運和擴散，為不同產(chǎn)卵場仔稚魚的混合和交換提供了機會［1］，從而影響了不同產(chǎn)卵場的仔稚魚群體之間的種群連通性，擴散促進了這些復(fù)合種群的存續(xù)［2］。然而，受限于仔稚魚階段的個體大小和高死亡率，要追蹤魚類從孵化開始的生活史是有難度的。研究發(fā)現(xiàn)耳石微化學(xué)是研究魚類生態(tài)學(xué)的有效工具［2］。耳石在魚類的整個生命周期中不斷生長，其化學(xué)成分保持惰性，棲息環(huán)境的化學(xué)元素經(jīng)過一系列的生理過程被聚合到耳石的碳酸鈣結(jié)構(gòu)中［3］，按時間順序保存了不同生活史階段經(jīng)歷的環(huán)境信息軌跡［4-5］，隨著耳石化學(xué)組成與水化學(xué)之間關(guān)系研究的不斷深入，以及耳石元素分析準確性的不斷提高，耳石微化學(xué)正逐步用于研究魚類群體的起源、種群動態(tài)、洄游分布以及生境連通性［6-11］。耳石核區(qū)的微化學(xué)特征常用于追溯個體的出生來源［2，12-13］，耳石邊緣則可用于反映魚類棲息的生境特征［2，14］。

小黃魚（Larimichthys polyactis）是我國重要的經(jīng)濟魚類，為近底層洄游性魚類，廣泛分布于我國沿海。目前，對黃海南部和東海的小黃魚種群連通性的理解還存在著不少的分歧［15-16］，黃海南部和東海小黃魚群體是否為同一種群、不同群體的混棲、交換等種群連通性問題尚需通過新的技術(shù)手段和方法加以深入研究。近年來，在小黃魚種群結(jié)構(gòu)劃分的研究中已開始探索應(yīng)用耳石微化學(xué)方法［17-19］。

本文利用小黃魚幼魚耳石邊緣的耳石元素分析東海至南黃海近海幼魚棲息海域之間的連通性，并利用小黃魚幼魚耳石近核區(qū)耳石元素評估這些幼魚的出生地來源。以期為小黃魚不同群體的起源、洄游分布和生境連通性研究提供參考。

1 材料方法

1.1 樣本采集與處理

2019年5—6月在黃海南部近岸（射陽、呂四）和東海近岸（舟山、大陳）4個采樣點用仔稚魚網(wǎng)（口徑1.3 m，網(wǎng)目0.5 mm）采集小黃魚幼魚（表1）。小黃魚樣品于-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。魚體解凍后測量體長，解剖取出矢耳石，清洗表面的有機質(zhì)后，室溫下干燥保存待用。耳石切片制作過程參照徐浩等［19］的方法。環(huán)氧樹脂固定包埋耳石后，經(jīng)StruersDiscoplan-TS上切割，用1 200目砂紙精磨至核心暴露，制成厚度約為0.5 mm的耳石薄片。合格的耳石薄片放入超純水中清洗5 min，自然晾干后即可用于耳石微化學(xué)分析。

表1 小黃魚幼魚采集樣品信息Tab.1 Sampling details of Larimichthys polyactis juveniles

1.2 耳石元素指紋分析

采用激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（LA-ICP-MS）對耳石元素進行分析。激光剝蝕進樣系統(tǒng)采用NWR-213儀器（New Wave Research，F(xiàn)remont，美國），電感耦合等離子體質(zhì)譜系統(tǒng)采用Thermo X SeriesⅡICPMS儀器（Thermo Fisher Scientific）。每批樣品包括4個耳石切片和1個NIST612標(biāo)樣（National Institute of Standards and Technology，美國）、1個碳酸鹽標(biāo)樣MACS-3（United States Geological Survey，美國）。元素分析參照徐浩等［19］的研究方法，詳細步驟為：測試過程按NIST612—MACS-3—耳 石 樣 品—NIST612—MACS-3的順序循環(huán)進行，其中NIST612用于校正ICP-MS元素分析過程中儀器的漂移。激光剝蝕出的樣品通過Ar和He混合氣體送入ICP-MS進行元素分析，He氣流量控制在0.8 L·min-1。在無任何樣品條件下對Ar、He混合氣體進行LAICP-MS測試，重復(fù)10次，3倍空白標(biāo)準偏差所對應(yīng)的濃度即為各元素檢測限水平。LA-ICP-MS對小黃魚耳石核區(qū)和邊緣區(qū)域檢測和識別出有效元素：Sr、Ba、Mn、Mg、Ca。測定的各元素值以其濃度與Ca2＋濃度比值表示。樣品分析采用多測點激光剝蝕技術(shù)：耳石核心區(qū)剝蝕點位于耳石原基附近，耳石邊緣位置剝蝕點緊靠耳石邊緣（圖1）。每個激光剝蝕點直徑40μm，采樣深度15 μm，時間15 s。

圖1 小黃魚耳石核區(qū)和邊緣多點激光剝蝕定位Fig.1 Photographs showing the checking and edge of the multiple laser ablations on an otolith section of Larimichthys polyactis

1.3 元素指紋數(shù)據(jù)處理

小黃魚耳石近核區(qū)和邊緣元素比值數(shù)據(jù)的地理差異檢驗使用非參數(shù)檢驗方法，該方法無需考慮數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)和方差齊性的假設(shè)條件。選用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗方法分析單個元素比值地理上的總體差異顯著性，對總體差異顯著的元素比值再用Dunn多重比較檢驗分析兩兩采樣點間的顯著性差異［2］。Kruskal-Wallis檢驗使用R語言stat包中的kruskal.test（）函數(shù)，Dunn多重比較檢驗使用pairwiseComparisons包中的parwise_comparisons（）函數(shù)，并結(jié)合ggplot2包和ggsignif包繪制箱形圖及顯著性圖示。

小黃魚耳石近核區(qū)和邊緣元素比值的采樣點間差異的多元檢驗使用非參數(shù)置換方差分析（PERMANOVA）和主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）方法評估和圖示采樣點間的空間關(guān)系［20］。元素比值進行開四次方轉(zhuǎn)換，以平衡數(shù)據(jù)對相異性值的貢獻，基于歐氏距離計算采樣點間的相異性矩陣，PERMANOVA采用9 999次隨機重復(fù)的無限制置換進行分析，當(dāng)呈顯著性差異時，再進行采樣點間的兩兩多重比較以確認均值差異的來源。PERMANOVA分析使用R語言vegen包中的adonis2（）函數(shù)，采樣點間的兩兩多重比較使用pairwiseAdonis包中的pairwise.adonis2（）函數(shù)，應(yīng)用vegan包中的cmdscale（）函數(shù)進行PCoA模型擬合，并用venfit（）函數(shù)計算每個元素比值的方向和強度，使用ggplot2包繪制PCoA結(jié)果圖和每個有樣點的95%置信橢圓。

應(yīng)用隨機森林（RF）分類方法評估小黃魚幼魚耳石邊緣元素比值的空間特征，以判斷采樣點間的空間判別效果［2］。RF方法已廣泛應(yīng)用于耳石元素比值的研究中，與其他分類方法相比，RF并不需要元素比值數(shù)據(jù)符合某種分布假設(shè)，且判別效果優(yōu)于其他方法［21-22］。隨機選擇75%的小黃魚幼魚樣本的耳石邊緣元素比值構(gòu)建和訓(xùn)練每個可能的RF分類器。剩余25%的樣本用于檢驗預(yù)測未知耳石邊緣元素比值來源的總體可靠性，用分類準確率和真實技巧統(tǒng)計量（TSS）評價模型的預(yù)測精度，準確率表示樣本正確地重分類到其采樣點的總數(shù)，而TSS也解釋了真實的負面預(yù)測。TSS的范圍為-1到＋1，其中＋1代表對給定棲息地存在或缺失的100%的正確預(yù)測，0表示隨機預(yù)測，-1表示100%的錯誤預(yù)測。最后，通過計算將全局基尼指數(shù)（Gini index，GI）從最優(yōu)分類器中去除后的平均下降量來評價各元素對空間分辨的貢獻。GI的范圍從0（所有元素的貢獻率都均等）到100（當(dāng)單個元素貢獻率達到100%）。當(dāng)一個元素從分類器中去除時，GI的降低越高，說明該元素對識別的重要性越大［2，23-24］。

應(yīng)用無監(jiān)督的隨機森林（RF）聚類方法［25］分析小黃魚耳石近核區(qū)元素比值以得到其可能的出生地來源，該方法分為兩步［2，26］：第一步是忽略采樣點信息，從不同元素的實際邊際分布的乘積中隨機取樣，創(chuàng)建人造數(shù)據(jù)集。接著，RF用于區(qū)分觀測的人造數(shù)據(jù)（用作分類因子）觀測，生成相似性矩陣（similarity matrix），定義為兩個個體最終在樹的同一終端節(jié)點的頻率。第二步，計算相異性矩陣（dissimilarity matrix），計算公式為：

將相異性矩陣代入基于中心點（partitioning around medoid，PAM）聚類確定聚類數(shù)和分組，PAM聚類使用fpc包中的pamk（）函數(shù)確定最佳的聚類數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小黃魚幼魚耳石邊緣元素比值的地理差異比較

小黃魚幼魚耳石邊緣元素比值的Kruskal-Wallis檢驗結(jié)果顯示，4種元素比值的地理差異都非常顯著（表2）。兩兩采樣點間的Dunn多重比較顯示（表3），Sr∶Ca呈顯著性差異的點對為射陽與呂四、呂四與舟山及呂四與大陳（圖2-A）；Ba∶Ca呈顯著差異的點對只有射陽與呂四及射陽與舟山（圖2-B）；Mg∶Ca呈顯著差異的點對為呂四與射陽、呂四與舟山及呂四與大陳（圖2-C）；Mn∶Ca呈顯著差異的點對為射陽與呂四、射陽與舟山、呂四與大陳及舟山與大陳（圖2-D）。

圖2 小黃魚幼魚耳石邊緣元素比值的地理差異比較Fig.2 Comparison about otolith edge microchemistry of juvenile Larimichthys polyactis among sampling locations

PERMANOVA檢驗顯示，小黃魚幼魚耳石邊緣元素比值在4個采樣點間呈現(xiàn)極顯著的地理差異（F3，80＝13.37，P＜0.001）；兩兩采樣點間的多重PERMANOVA檢驗顯示，除了呂四與舟山采樣點間不顯著外，其他采樣點兩兩間呈顯著差異，射陽與呂四（F1，29＝20.99，P＜0.001），射陽與舟山（F1，47＝35.46，P＜0.001）、射陽與大陳（F1，32＝6.77，P＜0.01）、呂四與大陳（F1，33＝7.68，P＜0.01）和舟山與大陳（F1，51＝10.38，P＜0.001）。PCoA的結(jié)果顯示（圖3），第1主軸和第2主軸的累積貢獻率達95.43%，小黃魚幼魚耳石邊緣元素比值呈現(xiàn)較明顯的空間差異，呂四和舟山小黃魚樣本位置相對較近，射陽小黃魚樣本的空間位置與其他取樣點相對較遠。

圖3 小黃魚幼魚耳石邊緣元素比值的空間PCoA排序圖Fig.3 PCoA plot comparing otolith edge microchemistry of juvenile Larimichthys polyactis

小黃魚幼魚耳石邊緣元素比值的RF分類的總分類準確度為63%，各采樣點的分類準確度在50%～75%之間（表4），其中射陽和舟山小黃魚幼魚耳石邊緣元素比值重新分配的準確度＞60%，呂四和大陳為50%。TSS統(tǒng)計值均大于0，最高為射陽（0.67），最低為大陳（0.37）。各元素對采樣點分類準確度的貢獻率差異很大，4種元素比值的平均基尼系數(shù)下降（mean decrease of Gini index）變化不大（11.01～11.96），其中Mn比值的重要性最高（11.96），其次為Ba比值（11.61）和Mg比值（11.50），Sr比值的重要性最低（11.01）。

表4 小黃魚幼魚耳石邊緣元素比值隨機森林分類的準確度（%）和真實技巧統(tǒng)計量TSSTab.4 Classification accuracy（%）and true skill statistics（TSS）of random forest classification for the otolith edge of juvenile Larimichthys polyactis

2.2 小黃魚幼魚耳石近核區(qū)元素比值的地理差異比較

4個采樣點小黃魚幼魚耳石近核區(qū)4種元素比值的Kruskal-Wallis檢驗結(jié)果顯示，除了Mn∶Ca外（圖4-D），其他元素比值呈現(xiàn)顯著性的地理差異。對3種Kruskal-Wallis檢驗呈顯著性的元素比值進行采樣點兩兩間Dunn多重比較顯示（表5），Sr∶Ca呈現(xiàn)顯著性差異的采樣點對為：射陽與呂四、呂四與大陳及呂四與舟山（圖4-A）；Ba∶Ca為射陽與舟山、射陽與大陳、呂四與舟山及呂四與大陳（圖4-B）；Mg∶Ca為呂四與舟山、呂四與大陳（圖4-C）。

圖4 采樣點間小黃魚幼魚耳石近核區(qū)元素比值比較Fig.4 Comparison about otolith near-core microchemistry of juvenile Larimichthys polyactis among sampling locations

表5 小黃魚幼魚耳石近核區(qū)采樣點間元素比值的Dunn多重比較Tab.5 Dunn’s multiple comparison of otolith near-core microchemistry of juvenile Larimichthys polyactis

PERMANOVA檢驗顯示，小黃魚幼魚耳石近核區(qū)4種元素比值在4個采樣點間呈現(xiàn)極顯著的地理差異（F3，80＝11.79，P＜0.001）；兩兩采樣點間的多重PERMANOVA檢驗顯示，射陽與呂四間差異不顯著（F1，29＝1.58，P＝0.20＞0.05），舟山與大陳間差異顯著（F1，51＝4.12，P＝0.02＜0.05），其他采樣點間差異極顯著（射陽與舟山：F1，47＝18.98，P＝1×10-4＜0.001，射陽與大陳：F1，32＝12.47，P＝1×10-4＜0.001，呂四與舟山：F1，45＝17.28，P＝1×10-4＜0.001）。PCoA的結(jié)果顯示（圖5），第1主軸和第2主軸的累積貢獻率達88.56%，小黃魚幼魚耳石元素比值呈現(xiàn)較明顯的空間差異，射陽和呂四小黃魚樣本位置相對較近，舟山和東引島小黃魚樣本的空間位置相對較近。

圖5 小黃魚幼魚耳石近核區(qū)元素比值的PCoA排序圖Fig.5 PCoA plot comparing otolith near-core microchemistry of juvenile Larimichthys polyactis

2.3 小黃魚幼魚出生地來源

根據(jù)RF聚類分析結(jié)果顯示，4個采樣點小黃魚幼魚耳石近核心區(qū)元素比值大致可分為2個聚群（圖6，A和B），大陳采樣點73.68%的個體屬于A，26.32%的個體屬于B；舟山采樣點82.35%的個體屬于A，17.65%的個體屬于B；呂四采樣點的所有個體均屬于B，射陽20%的個體屬于A，80%的個體屬于B。由此可看出，東海近岸的兩個采樣點主要屬于A，黃海南部的兩個采樣點主要屬于B（圖6）。從兩個聚群的元素比值來看，A群的元素比值中除了Mg比值均值高于B群外，Sr、Ba、Mn的平均比值低于B群（表6）。

圖6 RF聚類確定的各采樣點小黃魚幼魚可能來源的餅圖Fig.6 Pie charts representing the contribution of natal sources of Larimichthys polyactis identified by RF clustering

表6 RF分類確定的2個聚類組的耳石近核區(qū)元素比值（均值±方差）Tab.6 Mean element value for two natal clusters identified by RF clustering（mean±SD）

3 討論

3.1 群體空間連通性分析方法比較

研究表明，不同的數(shù)據(jù)分析方法會影響到耳石元素的分類準確度，隨機森林（RF）對于不同類型數(shù)據(jù)的分析性能要好于線性判別函數(shù)分析（LDFA）、二次判別函數(shù)分析（QDFA）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）等方法，而且對數(shù)據(jù)的分布假設(shè)要求不高［22，27］。因為無需確定采集樣本出生源基準，幼魚耳石元素?zé)o監(jiān)督聚類學(xué)習(xí)方法似乎非常適合于仔稚魚擴散的研究，該聚類方法不能直接提供關(guān)于不同幼魚來源位置的信息，但能夠推斷出這些幼魚出生源的數(shù)量［26］，比如在北海，應(yīng)用該聚類方法確定了海玉筋魚（Ammodytes marinus）的4個出生源［13］。同時，無監(jiān)督的RF聚類方法對于連續(xù)多元數(shù)據(jù)的要求以及分布假設(shè)均比較寬泛，很適合應(yīng)用于耳石微化學(xué)數(shù)據(jù)的分析。GIBB等［26］認為，雖然有監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法也很好，但是獲得具有代表性的出生源基準的難度很大，為了獲取某種魚的出生源基準樣本就必須開展大規(guī)模的專業(yè)調(diào)查。因此要在接下來的研究中確定小黃魚仔稚魚的出生源，評估環(huán)境對早期生活史階段的擴散、移動距離和范圍的影響，為定量確定不同產(chǎn)卵場對小黃魚資源補充的貢獻以及小黃魚種群的洄游提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 小黃魚幼魚群體的空間連通性

采樣點間小黃魚幼魚耳石邊緣元素的分類準確度（63%）與徐浩等［19］使用耳石核區(qū)元素的差別成功率（70.6%）較為相似，不同海域不同種類耳石邊緣元素的空間分類準確度變化較大，耳石微化學(xué)分類準確性一般處于中等水平（60% ～80%），如北海海玉筋魚為48.8%［13］～80%［26］，大西洋圓鯖（Scomber colias）為80%［11］，大西洋棘白鯧（Chaetodipterus faber）為76%［10］，葡萄牙沿海細鱗綠鰭魚（Chelidonichthys lucerna）為73%［8］，北海鰨（Solea solea）為79%［24］等。本研究中隨機森林分析的結(jié)果顯示，采樣點間小黃魚個體分配準確度范圍為50%～75%，且分配準確度較低的都出現(xiàn)在相近的采樣點上，比如射陽小黃魚樣品中有33.3%的樣品被分配到呂四采樣點，舟山采樣點有25%的樣品被分配至大陳采樣點。空間上不相鄰的采樣點間的分配準確度均較高，比如射陽與舟山、大陳采樣點之間均不存在著交叉的現(xiàn)象，這表明了不同海域小黃魚幼魚的擴散、移動范圍是有限的，隨著空間距離的增加，不同海域小黃魚幼魚群體間空間連通性越來越表現(xiàn)出相互隔離的趨勢。從耳石邊緣各元素比值對小黃魚幼魚RF分類準確度的貢獻來看，Mn∶Ca的重要性最高，其次為Ba∶Ca，而Sr∶Ca的重要性最低，這表明小黃魚幼魚空間差異主要由Mn∶Ca、Ba∶Ca等元素比值所驅(qū)動。

耳石中Mn為Ca的可替換元素，也是基質(zhì)蛋白輔助因子，反映了環(huán)境（濃度和鹽度）和生理（個體發(fā)生和生長）的歷史［28］，但環(huán)境因素的影響還不清楚［10］。溶解態(tài)的Mn在水環(huán)境中迅速沉淀，導(dǎo)致海洋沉積物中Mn的濃度比海水中高出幾個數(shù)量級，沉積物在海流的作用下重新懸?。?0］，可能成為小黃魚幼魚的餌料。因此，Mn∶Ca的空間差異不一定表示海水化學(xué)組成的不同，可能反映的是小黃魚幼魚攝食生境的異質(zhì)性。耳石邊緣Ba∶Ca的空間差異可能歸因于環(huán)境水體中Ba濃度的不同，Ba等微量元素滲入耳石的比例與周圍環(huán)境濃度成正比［28］，近岸海域Ba濃度的影響因素包括了陸地徑流、流域地質(zhì)、水體污染、潮汐變化、河口的混合作用以及地下水的輸入等［7，10］。

魚類耳石不同位點的元素比值與其所棲息環(huán)境的化學(xué)組成的相關(guān)性較高［3，28］，耳石邊緣的化學(xué)元素往往反映了采樣時棲息海域的海水化學(xué)組成［2，29］，在河口、沿海海域由于流域水質(zhì)的局部變化，水化學(xué)組分常存在著廣泛的空間變化（如潛在的地質(zhì)、沉淀物、徑流、微生物過程、人為影響、以及不同組成成分水團混合）［3，7］。東海和黃海南部沿海小黃魚幼魚耳石邊緣4種元素比值除了呂四與舟山采樣點差異不顯著外，其他采樣點間均存在顯著差異。小黃魚幼魚耳石邊緣元素比值的差異性反映了小黃魚幼魚采樣海域海水化學(xué)組成的差異性，舟山和呂四采樣點位于長江口的南北側(cè)，它們均受到“長江口沖淡水雙向擴展”的影響［30］，這兩個采樣點小黃魚耳石邊緣的元素比值具有更高的相似性（圖3）；而其他兩個采樣點距離較遠，影響射陽和大陳采樣點附近海域的流系不同，可能導(dǎo)致這兩個海域的化學(xué)組成差異性較高，從而使棲息在這兩個海域的小黃魚幼魚耳石邊緣化學(xué)元素具有較大的差異性。

3.3 小黃魚幼魚出生源

確定產(chǎn)卵場出生源對育幼和索餌群體的貢獻將有助于更好理解種群結(jié)構(gòu)動態(tài)［24］，海洋魚類仔稚魚的死亡率很高，很難追蹤到幼魚階段的所有可能仔魚來源，因此一些研究通過對仔稚魚生活史階段形成耳石的化學(xué)組成進行聚類分析，進而推斷仔魚來源的數(shù)量［2，26］。當(dāng)受精卵在孵化過程中，海水中的Sr、Ba等化學(xué)元素被吸收整合到魚類胚胎耳石中（即孵化前區(qū)域），從而胚胎耳石中產(chǎn)生反映出生地環(huán)境的化學(xué)特征［12，31］。依據(jù)小黃魚幼魚耳石近核區(qū)的4種元素比值的RF分類結(jié)果，4個采樣點的小黃魚幼魚樣品主要來自兩個類型產(chǎn)卵場，分別為東海近岸（A）和南黃海近岸（B）的產(chǎn)卵場，這也證實了東海近岸、黃海南部近岸存在著兩個小黃魚種群的產(chǎn)卵場［15］。由于小黃魚產(chǎn)卵地（出生源）準確海域尚不清楚，目前尚無法確定聚類在多大程度上反映不同的出生源［26］。

東海近海（A）的小黃魚耳石近核區(qū)的Sr∶Ca、Ba∶Ca和Mn∶Ca低于黃海南部近海（B），Mg∶Ca則高于黃海南部（表6）。小黃魚幼魚耳石近核區(qū)的元素比值中除了Mn∶Ca無空間差異外，其他元素比值表現(xiàn)出不同程度的空間差異。采樣點之間的Ba∶Ca空間差異性最大，主要是Ba驅(qū)動了小黃魚出生源的空間差異。多數(shù)情況下，耳石上的Sr、Ba 豐度與鹽度等水環(huán)境因子相關(guān)［3，28，32-33］，Mg則與魚類生長發(fā)育相關(guān)［28］，表明了東海近海和黃海南部小黃魚產(chǎn)卵場的化學(xué)組成存在不同，這也就證實了兩個海域都存在著自身的小黃魚產(chǎn)卵種群［3，7，34］。兩個產(chǎn)卵場個體的多種元素也存在明顯差異，說明兩個產(chǎn)卵場出生的小黃魚基本上都是在本海域生長發(fā)育，并逐漸向產(chǎn)卵場海域附近的育幼場和索餌場擴散洄游［15］。