軒中亞，姜 濤，劉洪波，陳修報，楊 健，

（1.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，中國水產(chǎn)科學研究院長江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評價與資源養(yǎng)護重點實驗室，江蘇無錫 214081）

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）是脊椎動物中一組參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)的基因［1-3］。MHCⅡ基因編碼的MHCⅡ蛋白主要負責細胞外病原體抗原的識別及呈遞給T淋巴細胞［4］；MHC是基因組中多態(tài)性最豐富的區(qū)域之一，一個特點是物種間和物種內(nèi)的基因座拷貝數(shù)的極大差異，從大西洋鱈（Gadus morhua）沒有MHCⅡ基因座到尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）擁 有 超 過10 個 基 因座［5-7］；另一特點是同一物種群體內(nèi)等位基因間的高度多態(tài)性［8-9］。在MHC基因中，多態(tài)性最豐富的為MHCⅡ基因，而多樣化選擇往往作用于在MHCⅡ基因第二個外顯子中決定等位基因特異性的抗原結(jié)合位點，抗原結(jié)合位點正是MHCⅡ最高多態(tài)性的來源［8，10］。

刀鱭（Coilia nasus）是一種溯河洄游性的小型魚類，在河口及近海海域生長，每年春季親魚自海區(qū)進入河口上溯至河流平緩的回水灣或者通江湖泊內(nèi)產(chǎn)卵，在長江流域最遠甚至可上溯至洞庭湖一帶繁殖，繁殖產(chǎn)生的幼魚在淡水中生活一段時間后進入河口或近海區(qū)域生長［11］。一般認為，刀鱭主要是溯河洄游生態(tài)型［11］，然而一些湖泊中也存在著陸封型的刀鱭種群［12］，另外耳石微化學的研究證實了淡水定居型的刀鱭［13］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，實際上刀鱭存在溯河洄游型長頜鱭、淡水定居型長頜鱭、溯河洄游型短頜鱭、淡水定居型短頜鱭以及陸封型湖鱭5種生態(tài)表型［14］。由此可見，刀鱭具有高度的生態(tài)適應(yīng)性，而淡水定居與溯河洄游型刀鱭應(yīng)對的疾病及寄生蟲的對策也截然不同。MHCⅡ由α鏈和β鏈構(gòu)成，其中MHCⅡβ基因的多樣性與外源性抗原（如疾病和寄生蟲）介導(dǎo)的自然選擇具有密切的關(guān)系，這為洄游魚類的局部種群適應(yīng)和分化的研究提供了良好的視角。然而，迄今對于不同生態(tài)型刀鱭的MHCⅡβ基因是否具有多樣化和差異，是否受到選擇作用的影響等問題尚缺乏了解。探索和解決這些問題對厘清刀鱭生態(tài)適應(yīng)性及其背后的不同類型的疾病和寄生蟲的抗性特征將具有重要意義。

本研究首次對洄游型刀鱭的MHCⅡβ基因進行基因序列克隆，獲得其MHCⅡβ基因全長序列，并通過MHCⅡβ基因編碼的氨基酸序列研究該類刀鱭MHCⅡ基因的系統(tǒng)進化，以期為進一步探討洄游型刀鱭MHCⅡ基因多態(tài)性、種群遺傳多樣性、自然選擇類型及適應(yīng)機制（如抗病性等）分析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物為2018年5月在長江鎮(zhèn)江段進行的刀鱭資源調(diào)查中捕撈的3尾刀鱭。上頜骨長度均長于頭長（上頜骨／頭長的比率分別為1.12、1.21和1.09），再經(jīng)耳石微化學確認，全部為溯河洄游型個體，故判定3尾個體為刀鱭的溯河洄游型長頜鱭生態(tài)表型［14］。在漁船上對剛捕離水面的新鮮刀鱭進行取樣。取其腦、鰓、心臟、脾臟、胃、腎臟、肌肉、皮膚、腸、肝臟等組織后，立即浸入RNA保存液，于4℃置放過夜，待組織充分浸潤后再置于干冰中低溫保存，運到實驗室后立即轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存。實驗所用的所有解剖器械和玻璃器皿均經(jīng)180℃烘烤3 h，以滅活RNA酶，使用無RNase的2 mL凍存管存放樣品。

1.2 DNA和總RNA的提取及cDNA模板的制備

基因組DNA提取使用動物組織基因組DNA提取試劑盒（康為世紀），參照說明書進行操作，DNA提取后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。各組織總RNA提取方法參照Trizol reagent（Invitrogen，美國）說明書，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取出的總RNA的完整性，分光光度計測定RNA濃度。取1μg總RNA樣品，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace-α-TM First Strand cDNA Synthesis Kit（TOYOBO，日本）合成第一鏈cDNA。在無RNA酶的PCR管中加入1μg的總RNA（總RNA濃度400ng·μL-1，共2.5μL），和1μL的100μM的oligo（dT）引物，并加入DEPC處理過的滅菌水8.5μL使混合液最終體積為12μL，將上述混合液于65℃處理5 min，然后在冰上立即冷卻1 min。然后再在反應(yīng)液中依次加入4μL 5X reaction buffer、1μL RiboLock RNase Inhibitor（20 U·μL-1）、2μL 10 mM dNTP mix、1μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase（200 U·μL-1），將其輕輕混勻，并短暫離心后在PCR儀上42℃孵育1 h，之后70℃孵育5 min結(jié)束反應(yīng)。

1.3 MHCⅡβcDNA全長及基因組序列擴增

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，根據(jù)SHEN等［15］公布的轉(zhuǎn)錄組文庫中MHCⅡβ的相對保守序列，設(shè)計引物對擴增中間片段（引物序列見表1，MHCⅡβ partial-F和MHCⅡβpartial-R）。PCR反應(yīng)條件：首先在94℃下預(yù)變性2 min，之后為35個循環(huán)，每個循環(huán)在94℃下變形30 s、55℃下退火30 s、72℃下延伸1 min；最后在72℃下延伸10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。擴增3′端和5′端的巢式引物，根據(jù)已獲得的cDNA中間序列分別設(shè)計（表1）。

表1 MHC基因克隆反應(yīng)引物組合Tab.1 Primer pairs of combination used in cloning

使用SUPERSCRIPT II RT酶和引物MHCⅡβ-race-F1對總RNA進行目的基因第一鏈cDNA的合成，對合成的cDNA進行去RNA處理并進行純化。使用TdT酶和dCTP對純化后的cDNA進行末端加上多聚C，再使用引物MHCⅡβ-race-F2和試劑盒里面帶的橋連鉚釘引物AAP對已經(jīng)加dC尾的cDNA進行PCR第一輪擴增。使用引物MHCⅡβ-race-F3和試劑盒里面帶的橋連通用擴增引物AUAP進行巢式PCR第二輪擴增，將第二輪PCR產(chǎn)物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18T進行連接，轉(zhuǎn)化后對陽性克隆進行測序，得到5′端序列。使用引物MHCⅡβ-race-R1和UPM，以cDNA為模板進行第一輪PCR擴增。將第一輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋50倍，然后用引物MHCⅡβ-race-R2和UPM進行第二輪PCR擴增。將第二輪PCR產(chǎn)物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化后克隆測序，得到3′端序列。

將中間片段、3′-RACE、5′-RACE序列片段進行拼接，根據(jù)拼接獲得的溯河洄游型刀鱭MHCⅡβ基因cDNA序列，在其序列兩端非編碼區(qū)選取保守片斷設(shè)計特異引物MHCⅡβ-ORF-F和MHCⅡβ-ORF-R進行ORF驗證，檢驗拼接所得cDNA全長序列。

1.4 序列分析與進化樹的構(gòu)建

DNAtools 6.0軟件預(yù)測MHCⅡβ基因的開放讀碼框，并翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列；在開放型網(wǎng)站NCBI（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）上比對核苷酸同源性；MHCⅡβ基因編碼的蛋白質(zhì)的分子式、相對分子質(zhì)量、等電點等基本信息使用網(wǎng)站工具Prot-Param tool（http：／／www.expasy.org／）進行分析；預(yù)測跨膜區(qū)位置使用在線軟件TMHMM （http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／），預(yù)測信號肽位置使用在線軟件SignalP（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）。采用蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及注釋平臺（http：／／smart.embl-heidelberg.de／）進行結(jié)構(gòu)域分析，通過Swiss Model對MHCⅡβ蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。

蛋白序列的多重比對使用Clustal X 1.8軟件；與NCBI上下載的其他脊椎動物的MHCⅡβ蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，不同MHCⅡβ蛋白序列的物種及登陸號為：智人（Homo sapiens，AAH24269）、小家鼠（Mus musculus，P18469）、駝背非鯽（Cyphotilapia frontosa，AAA49157）、斑馬魚（Danio rerio，AAA50043）、三刺魚（Gasterosteus aculeatus，AAU01920）、半 滑 舌 鰨（Cynoglossus semilaevis，ACZ69608）、虹 鱒 （Oncorhynchus mykiss，AAD53032）、大黃魚（Larimichthys crocea，ABV48908）、青鳉（Oryzias latipes，BAA94279）、鯉（Cyprinus carpio，CAA88847）、斜 帶 石 斑 魚（Epinephelus coioides，ACU46020）、圓 斑 星 鰈（Verasper variegatus，ADB43564）、大 西 洋 鮭（Salmo salar，CAA49725）、大 西 洋 鯡（Clupea harengus，XP_012688403）、舌齒鱸（Dicentrarchus labrax，CAJ34344）。進化樹由MEGA軟件構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 溯河洄游型刀鱭MHCⅡβcDNA全長及序列分析

根據(jù)SHEN等［15］公布的刀鱭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得長度為821 bp的刀鱭MHCⅡβ基因片段，根據(jù)這以基因片段的序列設(shè)計特異性引物進行驗證。驗證得到長度為689 bp的核心序列片段。在核心序列片段上設(shè)計的RACE引物MHCⅡβ partial-F和MHCⅡβpartial-R擴增分別擴增出了長度約為295 bp的3′片段，和長度約為188 bp的5′片段，將刀鱭MHCⅡβ中間片段，3′片段和5′片段序列根據(jù)核苷酸序列的重疊部分堿基序列進行拼接，獲得了刀鱭MHCⅡβ的全長cDNA為917 bp，其中，5′非編碼區(qū)長度為23 bp，開放讀碼框（open reading frame，ORF）765 bp，3′非編碼區(qū)長度為129 bp（圖1）。經(jīng)BLAST比對后發(fā)現(xiàn)刀鱭的MHCⅡβ基因序列與大西洋鯡MHCⅡβ基因相似性達84.20%。根據(jù)ProtParam預(yù)測，刀鱭MHCⅡβ基因編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為28 710.88，等電點為6.53，蛋白分子式為C1309H2006N334O375S9，總平均疏水指數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.189。經(jīng)過SignalP分析發(fā)現(xiàn)22-23 號氨基酸為信號肽序列。TMHMM預(yù)測的跨膜區(qū)為220-241號氨基酸。應(yīng)用SMART軟件對MHCⅡβ蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示MHCⅡβ蛋白由1個MHCⅡβ結(jié)構(gòu)域（從第32個氨基酸開始到第107個氨基酸結(jié)束）、1個IGc1免疫球蛋白（從第132個氨基酸開始到第203個氨基酸結(jié)束）及一個跨膜區(qū)（從第220個氨基酸開始到第241個氨基酸結(jié)束）組成（圖2-a）。通過Swiss Model對MHCⅡβ蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測的結(jié)果見圖2-b。

圖1 溯河洄游型刀鱭MHCⅡβ基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 MHCⅡβgene sequence and derived amino acid sequences in anadromous Coilia nasus

圖2 溯河洄游型刀鱭MHCⅡβ蛋白的二級結(jié)構(gòu)（a）和三級結(jié)構(gòu)（b）示意圖Fig.2 Schematic diagram of the secondary structure（a）and tertiary structure（b）of MHCⅡβin anadromous Coilia nasus

2.2 同源性及系統(tǒng)進化樹分析

對本研究溯河洄游型刀鱭MHCⅡβ氨基酸序列和其他一些硬骨魚類、哺乳動物（鼠和人）的MHCⅡβ氨基酸序列進行比對，同源性分析顯示，刀鱭MHCⅡβ氨基酸序列與同屬于鯡形目的大西洋鯡的同源性最高，為71.79%；與鱸形目的斜帶石斑魚、駝背非鯽、大黃魚的同源性分別為56.69%、58.27%、57.09%，與刺魚目的三刺魚的同源性為52.36%，與鰈形目的半滑舌鰨的同源性為55.12%，與鳉形目的青鳉的同源性為53.94%，與鮭形目的大西洋鮭的同源性為58.66%，與智人及小家鼠的同源性較低，僅為32.09%和33.46%。

由MEGA 7.0軟件基于MHCⅡβ氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示（圖3），刀鱭的MHCⅡβ氨基酸序列與同屬于鯡形目的大西洋鯡進化關(guān)系最近，與鱸形目的舌齒鱸、駝背非鯽、斜帶石斑魚、大黃魚，鳉形目的青鳉，鰈形目的圓斑星鰈、半滑舌鰨、刺魚目的三刺魚共同構(gòu)成了一個支系；而鮭形目的大西洋鮭、虹鱒以及鯉形目的斑馬魚、鯉等形成了另一個支系，與刀鱭MHCⅡβ氨基酸序列的進化關(guān)系較遠。硬骨魚類與智人及小家鼠形成了兩個不同的大的分支，進化關(guān)系最遠（圖3）。

圖3 基于鄰接法構(gòu)建的溯河洄游型刀鱭MHCⅡβ與其他脊椎動物的進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of MHCⅡβin anadromous Coilia nasus and other vertebrates by neighbor-joining method

3 討論

主要組織相容性復(fù)合體 （major histocompatibility complex，MHC）在脊椎動物適應(yīng)性免疫過程中負責抗原識別及抗原遞呈。另外，除了與抗病性相關(guān)外，MHC還被認為與性選擇和配偶選擇具有重要聯(lián)系［16-17］。同時，由于MHC是基因組中多態(tài)性最豐富的區(qū)域之一，MHCⅡ又是MHC基因中遺傳多樣性最豐富的區(qū)域，因此也被當做一種分子標記，廣泛用于物種內(nèi)種群遺傳多樣性和遺傳分化評估［9，18-19］，受到分子育種和分子生態(tài)學研究的重視［20-21］。

全基因序列的克隆和序列結(jié)構(gòu)分析是對基因進行功能分析的基礎(chǔ)。目前，水產(chǎn)動物MHCⅡ基因的克隆與序列分析已有廣泛報道，現(xiàn)已得到多種魚類MHCⅡ類基因cDNA全長［22-24］。本研究使用Race技術(shù)首次克隆了洄游型刀鱭MHCⅡβ基因的cDNA全長，結(jié)果顯示洄游型刀鱭MHCⅡβ基因全長917 bp，開放閱讀框長度為765 bp，編碼254個氨基酸。通過軟件分析，預(yù)測了洄游型刀鱭MHCⅡβ基因編碼蛋白的二級及三級結(jié)構(gòu)（圖2），顯示刀鱭MHCⅡβ蛋白的三維模型具有兩個不同的典型結(jié)構(gòu)域，這與尼羅羅非魚、長吻鮠（Leiocassis longirostris）、舌齒鱸等具有相似的模型結(jié)構(gòu)［25-27］，表明了刀鱭MHCⅡβ蛋白在抗原呈遞性等功能上與其他魚類MHCⅡβ蛋白的相似性。同源性分析和分子系統(tǒng)進化分析的結(jié)果顯示，洄游型刀鱭MHCⅡβ氨基酸序列和同屬于鯡形目的大西洋鯡（Clupea harengus）同源性最高，刀鱭與硬骨魚類的同源性高于與哺乳類的同源性；在進化樹上刀鱭與大西洋鯡相鄰，并且與其他硬骨魚類聚在一起，而與哺乳類處于不同的兩枝，這與刀鱭的分類地位相符。

MHCⅡβ基因上的外源性抗原（如疾病和寄生蟲）介導(dǎo)的選擇可能會導(dǎo)致局部種群適應(yīng)和種群分化，例如CRISPO等［28］對加拿大西部亞伯達省的3個吻鱥（Rhinichthys cataractae）種群的研究發(fā)現(xiàn)，盡管微衛(wèi)星標記在不同的采樣地間沒有體現(xiàn)出種群結(jié)構(gòu)化和距離隔離模式，但是發(fā)現(xiàn)了MHCⅡβ基因經(jīng)受平衡選擇的證據(jù)，因為這些種群中的MHCⅡβ基因的非同義突變相對于中性期望較高。并且，MHCⅡβ基因的平衡選擇主要發(fā)生在同一河流的上下游之間而非不同河流之間，因此推測上下游種群平衡選擇的差異可能是由不同的病原體群落驅(qū)動的，以使不同種群能夠適應(yīng)不同的環(huán)境條件。另外，MARTíNEZ等［29］發(fā)現(xiàn)在洄游型和上游隔離的定居型虹鱒（Oncorhynchus mykiss）之間1個與MHCⅡ基因關(guān)聯(lián)的微衛(wèi)星位點上存在歧化選擇。LARSON等［30］發(fā)現(xiàn)紅大麻哈魚（Oncorhynchus nerka）不同產(chǎn)卵生態(tài)類型間MHC的差異是中性標記的30倍，中性遺傳結(jié)構(gòu)較低、空間距離接近，表明不同產(chǎn)卵生態(tài)類型間的基因交流豐富，在這種情況下MHC高度的遺傳分化可能是由強烈的選擇壓力保持的；并且發(fā)現(xiàn)MHC的分化水平不是隨著地理范圍的增大而增加，反而可能是由病原體群落或病原體毒性在精細的地理范圍內(nèi)的差異導(dǎo)致的。然而，寄生蟲／病原體介導(dǎo)的選擇并不是影響魚類MHC多樣性的唯一變量。SEIFERTOVá等［31］發(fā)現(xiàn)在歐洲圓鰭雅羅魚（Squalius cephalus）中寄生蟲介導(dǎo)的選擇并不是影響其MHCⅡβ多樣性的唯一變量，中性進化進程也是跨種群MHCⅡβ基因多樣性的重要驅(qū)動力。

對于刀鱭而言，目前的研究已經(jīng)表明，洄游型刀鱭在被陸封到太湖、巢湖、洪澤湖和駱馬湖等4個不同的湖泊里之后形成了快速的、平行的淡水環(huán)境適應(yīng)的基因組機制［32］。ZONG等［32］認為刀鱭染色體LG6和LG22上的兩個染色體倒位區(qū)很可能與陸封型刀鱭的平行淡水適應(yīng)有關(guān)，并且基因富集分析富集到的注釋涉及多種生物過程，如滲透調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、生長成熟、運動等過程。其中注釋到的關(guān)于免疫調(diào)解的基因是否與MHC基因的作用途徑相關(guān)，洄游型與陸封型刀鱭之間MHCⅡβ基因是否具有遺傳差異，以及是否經(jīng)歷過自然選擇等問題，仍需要進一步的研究。