瞿俊躍，方 舟，2，3，4，5，陳新軍，2，3，4，5

（1.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306；2.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室，上海 201306；3.國家遠洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)開發(fā)重點實驗室，上海 201306；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，上海 201306）

藍點馬鮫（Scomberomorus niphonius），屬鱸形目（Perciformes）鯖科（Scombridae）馬鮫屬，廣泛分布于中國、日本和韓國近海的暖溫性水域中［1-3］。該物種為高度洄游經(jīng)濟性魚種，在近年來氣候事件頻發(fā)且中國近海漁業(yè)資源日益衰退的背景下，藍點馬鮫仍然是少數(shù)維持高產(chǎn)的魚類之一，近5年在我國的年產(chǎn)量保持在30～40萬t之間［4-6］。掌握魚類的生活史，有助于進一步了解不同時期魚類的生境變化情況，進而為漁業(yè)資源可持續(xù)利用和管理提供參考依據(jù)［7］。耳石作為探究魚類生活史過程的優(yōu)良材料之一，具有不易被破壞的外形結(jié)構(gòu)，同時含有豐富的生態(tài)信息，目前已被廣泛用于群體劃分［8-10］、年齡與生長［11-14］、生境反演［15-16］等方面的研究。同時耳石主要由碳酸鈣組成，具有代謝惰性，魚類生活環(huán)境中的相關(guān)元素會永久沉積于耳石中［17-18］。魚類耳石能吸收其所棲息的環(huán)境元素，元素一旦被沉積就很難再被機體吸收，成為記錄魚類生活史足跡的元素指紋。因此，耳石的微化學分析可以重建魚類的生活史歷程或者揭示其特定生活史階段所經(jīng)歷的水環(huán)境變化［19-23］。目前，利用該方法已經(jīng)成功地推測了我國近海小黃魚（Larimichthys polyactis）［24］、棘 頭 梅 童 魚（Collichthys lucidus）［25］、鮸（Miichthys miiuy）［26］等石首魚科魚類在不同時期的生境變化規(guī)律。作為典型的長距離洄游性種類，藍點馬鮫有著顯著的沿岸—外海洄游的特征［2］。已有相關(guān)的研究對黃海藍點馬鮫耳石微化學進行了初步分析，對其生活史情況有了初步了解［15］，然而目前仍集中于關(guān)于耳石中微量元素組成，并僅簡單分析不同時期微量元素的變化情況。藍點馬鮫不同生活史時期所處的棲息環(huán)境和特征有較大的不同［15-16］，研究主要生活史的變化規(guī)律有著重要意義。為此，本研究選取拖網(wǎng)船在長江口鄰近海域所捕獲的藍點馬鮫個體，分析其耳石的微量元素組成，討論不同耳石區(qū)域微量元素的變化，結(jié)合回歸樹分析，初步劃分藍點馬鮫的生活史階段，推測其不同生長階段的生境變化，以期為后續(xù)合理開發(fā)、利用以及養(yǎng)護該重要漁業(yè)資源提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

本研究所用樣本是由底拖網(wǎng)漁船在長江口鄰近海域采集，捕撈作業(yè)海域見圖1。所用的網(wǎng)具為有翼單囊拖網(wǎng)，網(wǎng)具主尺度55 m×26 m，上綱長37 m、下綱長42 m、網(wǎng)目尺寸25 mm。樣本采集以非禁漁期時期每個月采一次，每次保證樣品數(shù)量在20尾左右，時間跨度為2018年9月—2019年2月。

圖1 長江口鄰近海域藍點馬鮫采樣站點Fig.1 Sampling locations of Scomberomorus niphonius in waters adjacent to the Yangtze Estuary

1.2 生物學測定與耳石提取

在實驗室解凍后對藍點馬鮫進行生物學測定，包括叉長（fork length，F(xiàn)L）、體質(zhì)量（body weight，BW）和性別，叉長精確至1 mm，體質(zhì)量精確至1 g。利用鑷子提取出藍點馬鮫的一對矢耳石，并存放于盛有95%乙醇溶液的帶有編號的離心管中保存。

1.3 耳石研磨與微量元素測定

對藍點馬鮫耳石采取橫截面研磨，耳石切片的制作過程包括包埋、切割、研磨和拋光。先將耳石清洗干燥后放入塑料模具中，沿壁緩慢倒入由固化劑與亞克力粉調(diào)配而成的包埋劑來進行耳石包埋，并放置到通風陰涼處待其完全硬化；然后用120、600、1 200和2 500目的防水耐磨砂紙將耳石逐步研磨至核心，研磨過程中需不斷在顯微鏡下觀察，以免磨過核心；最后用氧化鋁水絨布拋光研磨好的切片，再將研磨好的耳石切片進行編號保存。

本研究共計選取了研磨后的18枚耳石切片（表1），使用激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry，LA-ICP-MS）來進行耳石打點與微量元素測定。耳石打點采用等距法的方式進行，從核心區(qū)至邊緣區(qū)每100μm取一個樣點，每個耳石長軸平均能獲得7～9個樣點。微區(qū)每個取樣點測定所含的元素，激光剝蝕過程中采用氦氣作載氣、氬氣為補償氣以調(diào)節(jié)靈敏度。每個時間分辨分析數(shù)據(jù)包括大約20 s的空白信號和60 s的樣品信號。具體儀器的操作條件見表2。采用ICPMSDataCal軟件對數(shù)據(jù)進行離線處理（包括對樣品和空白信號的選擇、儀器靈敏度漂移校正、元素含量計算）。

表1 長江口鄰近海域藍點馬鮫信息Tab.1 Information of Scomberomorus niphonius in waters adjacent to the Yangtze Estuary

表2 耳石LA-ICP-MS工作參數(shù)Tab.2 Analytical parameters of LA-ICP-MS for otolith

1.4 數(shù)據(jù)分析

1）基于ICPMSDataCal軟件處理完的數(shù)據(jù)，選擇出均值大于0.1 mol·mol-1的元素，并依據(jù)各元素濃度含量利用隨機森林法（random forest）進行分析，選取相對重要性超過5%的元素。隨機森林是通過自助法（bootstrap）重采樣技術(shù)，從原始訓練樣本集N中重復隨機抽取k個樣本生成新的訓練樣本集合，然后根據(jù)自助樣本集生成k個分類樹組成隨機森林，新數(shù)據(jù)的分類結(jié)果按分類樹投票多少形成的分數(shù)而定。其實質(zhì)是對決策樹算法的一種改進，將多個決策樹合并在一起，每棵樹的建立依賴于一個獨立抽取的樣品，森林中的每棵樹具有相同的分布，分類誤差取決于每一棵樹的分類能力和它們之間的相關(guān)性。然后將上述重要元素通過與Ca的比值進行呈現(xiàn)，并且分別求出它們的最大值、最小值、平均值和標準差。

2）為消除各元素絕對值的誤差，繪制各微量元素與Ca比值在時間序列上的分布模式圖，根據(jù)所打點的位置比較不同生長階段上微量元素沉積的差異。

3）基于相關(guān)重要性較高的微量元素（大于10%），采用多元回歸樹模型（multivariate regression tree model，MRT）來形成多個時間序列聚類，進而劃分出藍點馬鮫不同的生活史階段，再結(jié)合微量元素比值在時間序列上的變化趨勢來大致推測出藍點馬鮫的棲息地分布及其變動。

本文所有統(tǒng)計方法均通過R語言（3.63版本）操作完成，其中模型運用的加載包為randomForest和mvpart［27-28］。

2 結(jié)果與分析

2.1 耳石主要微量元素分析

藍點馬鮫耳石中共檢測出元素14種（濃度大于0.1μmol·mol-1），其中濃度最高的為Ca元素，濃度為（410 858.54±665.55）μmol·mol-1（表3）。耳石各微量元素含量從高到低依次為鈣（Ca）、鈉（Na）、鍶（Sr）、鐵（Fe）、鎂（Mg）、錳（Mn）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎳（Ni）、鋰（Li）、鎘（Cd）、銅（Cu）、鈷（Co）、鉛（Pb）。

表3 藍點馬鮫耳石微量元素含量Tab.3 Trace element concentration in Scomberomorus niphonius otolith （μmol·mol-1）

2.2 元素重要性分析

基于隨機森林法對藍點馬鮫耳石中14種元素含量進行分析，選取重要性較高的微量元素（圖2）。結(jié)果表明，Mg、Na、Ca、Mn、Cu、Sr和Ba的重要性較高且可應用于分析生活史變動的研究中（其相對重要性均大于5%）。其中，Mg的重要性相關(guān)度最高，說明Mg的含量變化可以較好地呈現(xiàn)藍點馬鮫生活史變動特征，Na和Mn次之，說明這些元素對藍點馬鮫生活史影響較大；而Co、Cd、Zn、Ni、Pb、Fe和Li的相對重要性小于5%，說明這些元素對藍點馬鮫生活史的影響較小，因而不用于之后的聚類分析。

圖2 耳石微量元素相對重要性分析Fig.2 Relative importance analysis of trace elements in otoliths

2.3 藍點馬鮫耳石各微量元素比值

對隨機森林篩選出的7種重要微量元素Mg、Na、Ca、Mn、Cu、Sr和Ba的含量進行分析，結(jié)果見表4。計算與Ca比值后發(fā)現(xiàn)，Sr和Na的含量較高，其次為Mg、Mn和Ba，Cu的含量最低（表4）。

表4 藍點馬鮫耳石微量元素與鈣的比值Tab.4 Ratio of trace elements to Ca in Scomberomorus niphonius otolith

2.4 藍點馬鮫耳石不同區(qū)域元素的組成與差異

藍點馬鮫耳石不同區(qū)域上微量元素變動可反映其不同的生長階段上的特征。各微量元素與Ca的比值在時間序列上有著明顯的變化趨勢，且均呈現(xiàn)非均勻分布（圖3）。耳石Na∶Ca從核心區(qū)至450μm處基本不變，在450～600μm過程中逐漸上升，至600μm之后開始呈現(xiàn)快速下降的趨勢，于1 350μm處達到最低值；耳石Mg∶Ca從核心區(qū)至450μm呈現(xiàn)快速下降的趨勢，450μm～1 350μm下降速度減緩，1 350μm過后存在小幅度上升的趨勢；耳石Mn∶Ca從核心區(qū)開始至600μm呈現(xiàn)小幅上升趨勢，至600μm處之后出現(xiàn)明顯的下降趨勢；耳石Cu∶Ca從核心區(qū)至450μm呈現(xiàn)小幅上升的趨勢，450～1 350μm呈現(xiàn)階梯下降的趨勢，1 350μm之后存在小幅回升的趨勢；耳石Sr∶Ca從核心區(qū)至150μm處呈現(xiàn)顯著降低，至150～600μm處基本保持不變，600μm之后呈現(xiàn)波動變化；耳石Ba∶Ca從核心區(qū)至150μm呈現(xiàn)上升的趨勢，150～450μm處呈現(xiàn)下降趨勢，450～750μm呈現(xiàn)小幅度回升，750～1 200μm呈現(xiàn)明顯的快速下降趨勢，1 200 μm之后小幅提升。

圖3 耳石微量元素與Ca比值在時間序列上的變化趨勢Fig.3 Change trend of the ratio of otolith trace elements to Ca in time series

2.5 多元時間序列上的聚類

根據(jù)上述分析，選擇相關(guān)重要性高的元素（＞10%），采用多元回歸模型來對藍點馬鮫耳石的微量元素（即對應不同的生長階段）進行聚類分析。結(jié)果顯示，從耳石核心至邊緣一共存在4個分割點，分別為150μm、450μm、750μm和1 200μm，與此同時形成了5個聚類，每個聚類里也存在不同數(shù)量的節(jié)點（圖4），其中重要元素比值在不同聚類中存在一定的差異和可參考的生物學特征指標（圖5，表5）。聚類1可代表藍點馬鮫生長的早期階段，Na∶Ca值和Mg∶Ca值從核心至150μm含量存在小幅下降，而Mn∶Ca值存在小幅上升；聚類2中除了Mg∶Ca外其他的微量元素比值的變化趨勢不大，Mg∶Ca存在大幅的下降；聚類3中微量元素比值的變化趨勢相較聚類2略微有所差異，Na∶Ca值呈現(xiàn)小幅增長，Mg∶Ca值呈現(xiàn)小幅下降趨勢，Mn∶Ca值呈現(xiàn)大幅下降；聚類4的生長階段持續(xù)時間較長，其中3個重要元素的比值變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢；聚類5中3個重要元素比值變化趨勢各不相同，Mg∶Ca值略有上升，Mn∶Ca值不斷下降，降至最低，Na∶Ca值在降到最低后略有上升。

圖4 藍點馬鮫耳石微量元素在時間序列上的聚類Fig.4 Cluster of Scomberomorus niphonius otolith trace elements in time series

圖5 藍點馬鮫耳石重要微量元素在對應的不同生活史階段上的變動Fig.5 Change of important otolith trace elements of Scomberomorus niphonius at different life history stages

表5 每個聚類對應的重要元素的含量Tab.5 Concentration of important trace elements corresponding to each cluster

3 討論

3.1 主要微量元素變化規(guī)律

本研究對14個相對穩(wěn)定的微量元素進行了重要性分析，篩選出了7個重要微量元素，分別為Mg、Na、Ca、Mn、Cu、Sr和Ba。其中Ca元素含量最高。魚類耳石中含有30多種元素，其中的C、Ca、O構(gòu)成耳石的基質(zhì)碳酸鈣（CaCO3），其余大多為微量和痕量元素［24］。耳石中元素主要來源于魚類生活的水環(huán)境和食物，同時受發(fā)育階段和生理因素等多方面影響［26］，是一個復雜的生物地化過程（biogeochemical process）。水體元素被吸收進入耳石的過程中，當流經(jīng)水環(huán)境-血液、血液-血液結(jié)合蛋白、血液-淋巴液、淋巴液-耳石等4個界面時［29-30］，元素間親和力和化學行為對耳石中的元素含量起著決定性作用。Sr元素相對含量較高可能是由于Sr是Ca的同族元素，離子半徑與Ca接近，軟酸離子易進入耳石晶格中，在碳酸鈣的沉積過程中Sr離子置換Ca離子進入耳石晶格［31］。Cu元素相對重要是由于軟酸離子與血漿蛋白結(jié)合會形成穩(wěn)定的有機化合物，其中70%～100% 的Cu結(jié)合在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上［32］，盡管這些蛋白結(jié)合物容易排出體外，但由于其較高的含量和穩(wěn)定性，一定程度上能促使軟酸離子進入耳石的晶體結(jié)構(gòu)［32-33］。本研究中重要微量元素與PAN等［15］對黃海海域藍點馬鮫微量元素的研究有所不同。重要微量元素存在差異與東海和黃海的海洋環(huán)境存在關(guān)聯(lián)，長江沖淡水帶來了大量的陸源污染，因而可能是導致重金屬元素Mn和Cu含量偏高的潛在原因［34］。

3.2 不同生長階段耳石微量元素與生活史特征

藍點馬鮫具洄游性，會在產(chǎn)卵場、索餌場和越冬場之間做長距離的季節(jié)性洄游。耳石中微量元素對生境“履歷”、洄游模式等研究具有針對性和客觀性，即使僅有少量標本依舊可以反演魚類自然棲息生境的動態(tài)變化過程［35-37］。本研究對不同生長階段耳石微量元素進行了分析。在大多數(shù)洄游魚類耳石中Sr∶Ca值可以反映其生活史處于淡水、半咸水和海水時期的生長環(huán)境［38］，從而較為準確而直觀地“回溯”生活史“履歷”，“重建”其自然棲息環(huán)境，且Sr元素表征海域及個體棲息環(huán)境的鹽度和溫度變化，也是個體新陳代謝的重要營養(yǎng)元素［39-40］，但在長江口鄰近海域藍點馬鮫耳石微量元素中，Sr∶Ca相對沒有規(guī)律且含量顯著低于同海域的小黃魚、棘頭梅童魚、鮸和銀鯧（Pampus argentus）［24-26］，這可能是由環(huán)境溫度或者某些特殊生理作用影響所導致，因而藍點馬鮫耳石Sr∶Ca不適合作為其生境履歷的指標。

本研究表明，Mg∶Ca、Na∶Ca和Mn∶Ca元素含量在不同生活史階段存在一定的區(qū)別，可以作為生境履歷的指標，并基于這3種微量元素對藍點馬鮫生活史進行了回歸樹聚類，結(jié)果表明，藍點馬鮫可能存在5個生活史階段。已有研究表明，溫度對耳石Mg元素值具有一定的影響，因而Mg在各生活史階段間存在顯著性差異，可以代表棲息環(huán)境的變動，孵化期耳石中的Mg∶Ca顯著高于其他階段，可能是由于Mg含量與耳石原基碳酸鈣晶體存在形式有關(guān)［41］，且藍點馬鮫產(chǎn)卵場大多聚集在中國沿岸海域，產(chǎn)卵月份為4—6月，海表溫度相對較高，但9月—次年2月藍點馬鮫開始索餌洄游和越冬洄游，向離岸的深層海域洄游，棲息環(huán)境海溫較低；在產(chǎn)卵階段，Mg∶Ca比值有一個小幅度的回升，可能是由于3—5月藍點馬鮫開始產(chǎn)卵洄游，重新向海溫偏高的近岸淺層水洄游導致的。而Mn元素指示著陸源污染物的含量以及對個體生長發(fā)育的影響，生長階段初期，東海的長江口是藍點馬鮫重要的產(chǎn)卵場之一，Mn∶Ca較高可能與長江口陸源污染較高存在關(guān)聯(lián)［42］。

綜上所述，Mg∶Ca、Na∶Ca和Mn∶Ca比值存在差異，這與自身生理機制的調(diào)控和生活史不同階段海域的水環(huán)境變化有關(guān)，并且Mg∶Ca、Na∶Ca和Mn∶Ca可作為構(gòu)建藍點馬鮫生境履歷的潛在標志。今后的研究中，應該更多考慮將不同時期的環(huán)境因子與微量元素相結(jié)合，從海洋環(huán)境變化的角度更準確地判斷藍點馬鮫的生活史變化。