劉力源，徐雁龍

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110001）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。RCC的發(fā)病率和死亡率逐年上升，預(yù)計(jì)到2040年將有超過30萬人因該病死亡［1］。乳頭狀腎細(xì)胞癌（papillary renal cell carcinoma，pRCC）是RCC第二大亞型，僅次于腎透明細(xì)胞癌，約占RCC的15%～20%［2］。pRCC的治療一直以腎透明細(xì)胞癌為參考，然而，腎癌的每個亞型在預(yù)后和治療方面都有其特異性［3］，因此，研究pRCC患者腫瘤標(biāo)志物具有重要的臨床意義。

己糖激酶（hexokinase，HK）家族催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸是細(xì)胞代謝的第一步，也是限速步驟，哺乳動物組織中有4種HK，分別為HK1、HK2、HK3和HK4［4］。研究［5］表明，HK1和HK2在乳腺癌、甲狀腺癌、腎癌等多種惡性腫瘤組織中顯著上調(diào)，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的糖酵解途徑，最終導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良。HK3的失活顯著影響結(jié)直腸癌糖酵解的激活，進(jìn)而激活結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等下游信號通路，在癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［6］。迄今為止，尚未有關(guān)于HK3在pRCC中的表達(dá)差異與臨床預(yù)后的報(bào)道，本研究通過觀察和分析pRCC癌組織中HK3的表達(dá)情況，旨在探討其與pRCC患者的臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)庫

TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//tcgadata.nci.nih.gov/tcga/）是用于從GDC數(shù)據(jù)門戶檢索和處理數(shù)據(jù)的程序。從pRCC基因表達(dá)芯片中篩選出癌組織290例，健康組織32 例。比較HK3在癌組織與健康組織、不同分期及不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)水平。

1.2 臨床標(biāo)本

選取2017年1月1日至2021年12月31日于我院就診的pRCC患者癌組織和癌旁組織樣本蠟塊共46例，其中，男22例，女24例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)腎癌病理組專家確診為pRCC；（2）診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2012年國際泌尿病理協(xié)會對該病的定義；（3）年齡＞18周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）術(shù)前接受過其他方式治療；（3）嚴(yán)重心肺功能不全。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.3 主要試劑

石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒（北京英文特生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞裂解液（RIPA，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；蛋白酶抑制劑（PSMF，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；HK3抗體（英國Abcam公司，貨號：ab126217）；GAPDH抗體（美國CST公司，貨號：5174）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.4 Western blotting

用組織切片機(jī)從石蠟中切取適量厚度的組織（約10～20 μm），按照試劑盒說明書步驟獲取組織蠟塊總蛋白，離心后加入組織裂解液（RIPA ∶PSMF=100 ∶1）。隨后使用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。制備12% SDS-PAGE凝膠，經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。按照抗體說明書將一抗稀釋相應(yīng)倍數(shù)，將膜與抗體置于4 ℃下孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，室溫下二抗孵育1 h后暗室內(nèi)曝光顯影。用Image J 軟件處理蛋白圖像，GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化對照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism Version 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；組間比較采用student-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)繪制生存曲線并比較生存差異。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HK3在pRCC患者癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

TCGA基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)中，HK3在癌組織中的mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（P＜ 0.001）（圖1A）。此外，分析了HK3的mRNA表達(dá)水平與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果顯示，HK3的轉(zhuǎn)錄水平在Stage 1～3期，以及N0～1期均明顯高于正常組織的表達(dá)水平（圖1B、1C），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。而正常組織與Stage 4期、N2期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與數(shù)據(jù)庫中Stage 4期、N2期患者數(shù)量較少有關(guān)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中pRCC組織及正常腎組織中HK3 mRNA的表達(dá)Fig.1 Expression of HK3 mRNA in pRCC and normal renal tissue from the TCGA database

考慮到基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯后修飾等涉及到許多生物信息學(xué)過程，因此，HK3的轉(zhuǎn)錄水平并不能代表蛋白水平。隨后通過Western blotting檢測了HK3蛋白在癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，HK3的蛋白水平在癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織（P＜ 0.001），見圖2。

圖2 HK3在pRCC組織及正常腎組織中的蛋白表達(dá)情況Fig.2 Protein expression of HK3 in pRCC and normal renal tissue

2.2 HK3表達(dá)與pRCC患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)HK3蛋白表達(dá)的中位數(shù)將臨床癌組織樣本分為高表達(dá)組與低表達(dá)組。結(jié)果顯示，pRCC癌組織中HK3的表達(dá)水平與該腫瘤的T分期、Fuhrman核分級明顯相關(guān)（P＜ 0.01）；而與患者的性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞ 0.05），見表1。

表1 HK3表達(dá)與pRCC患者的臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.1 Relationship between HK3 expression and clinical pathological features in pRCC ［n（%）］

2.3 HK3在pRCC組織中的表達(dá)與生存預(yù)后的關(guān)系

通過電話隨訪和我院復(fù)查資料匯總等方式獲得患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存的信息。截至2022年3月1日，疾病進(jìn)展患者14例，死亡患者12例，存活29例，失訪5例。Kaplan-Meier曲線提示HK3高表達(dá)組的無病生存期（disease-free survival，DFS）及總體生存期（overall survival，OS）均低于低表達(dá)組（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 不同HK3表達(dá)水平的患者的生存曲線Fig.3 Survival curves for patients with different HK3 expression levels

3 討論

糖酵解是正常組織在低氧條件下發(fā)生的自然過程。在氧氣充足的惡性腫瘤區(qū)域也可以觀察到糖酵解。這種現(xiàn)象稱為“有氧糖酵解”或“沃伯格效應(yīng)［7］。糖酵解可以為癌細(xì)胞提供ATP，從而促進(jìn)其生長和代謝。因此，糖酵解可能是惡性腫瘤的一個潛在的預(yù)后指標(biāo)［8］。

HK的功能主要是催化葡萄糖代謝的第一步，使葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸［9］。HK在腫瘤細(xì)胞糖酵解等多種生物過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，對HK家族基因在不同類型癌癥中的作用仍缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識［10］。HK3是糖酵解的關(guān)鍵基因，主要分布于骨髓、肺和脾臟［11］。HK3和環(huán)加氧酶-2可能通過糖酵解和花生四烯酸代謝在小兒急性淋巴細(xì)胞白血病及其預(yù)后中發(fā)揮重要作用，可能成為治療該病的潛在靶點(diǎn)［12］。此外，HK3表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致中性粒細(xì)胞分化和活性顯著降低［13］。

研究［14］報(bào)道，HK3在腎透明細(xì)胞癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且參與調(diào)節(jié)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞免疫微環(huán)境與免疫逃逸。另有研究［15］顯示在非小細(xì)胞肺癌中，HK3與免疫浸潤相關(guān)，并可以作為預(yù)測非小細(xì)胞肺癌免疫治療的反應(yīng)程度。本研究結(jié)果顯示，通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析與蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在pRCC患者中，HK3的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平明顯高表達(dá)于癌旁健康組織，提示HK3可能促進(jìn)pRCC的發(fā)生發(fā)展。此結(jié)果與HK3在結(jié)腸癌中高表達(dá)結(jié)果一致［16］。為進(jìn)一步明確HK3的表達(dá)對pRCC的影響，本研究分析了腫瘤患者HK3的表達(dá)與其臨床特征的關(guān)系，結(jié)果表明HK3的表達(dá)水平與腫瘤的T分期、Fuhrman核分級明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而與患者的性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。隨后，根據(jù)隨訪結(jié)果分析顯示，HK3高表達(dá)組的DFS及OS均低于低表達(dá)組（P＜ 0.05）。這一結(jié)果提示HK3的高表達(dá)可能與pRCC的發(fā)展有關(guān)，可以作為pRCC的輔助指標(biāo)。

綜上所述，pRCC患者腫瘤組織中HK3蛋白水平高表達(dá)可能會促進(jìn)患者的病程發(fā)展。HK3可能成為pRCC的鑒別診斷及預(yù)后評價指標(biāo)，是潛在的腫瘤標(biāo)志物。為進(jìn)一步研究HK3在pRCC的生物學(xué)功能提供依據(jù)，對指導(dǎo)臨床治療及預(yù)后預(yù)測有一定的參考意義。