劉 川，高 妍，張 赫

(北華大學附屬醫(yī)院神經(jīng)科，吉林 吉林 132000)

研究表明PD發(fā)生及發(fā)展與小膠質細胞過度活化而引發(fā)的炎癥反應相關[4]。小膠質細胞是一種免疫細胞，在神經(jīng)系統(tǒng)內發(fā)揮免疫監(jiān)視作用，內環(huán)境變化可誘導小膠質細胞活化，介導白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎性因子的釋放[5]。霍山石斛多糖(Dendrobium huoshanense polysaccharide，DHP)具有廣泛的生物活性，可調節(jié)免疫、抗炎抑菌、降低氧化應激、抗腫瘤等[6]。目前DHP在PD中的作用尚不明確。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin，MPTP)能夠通過破壞小鼠腦黑質中多巴胺能神經(jīng)元功能誘發(fā)典型的PD樣改變[7]。

本實驗通過建立PD小鼠模型，旨在研究DHP對MPTP誘導的PD小鼠模型的運動功能缺陷及神經(jīng)炎癥的影響，從而探討DHP能否作為PD等神經(jīng)退行性疾病新的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

曠場實驗全自動記錄儀(賽昂斯生物科技有限公司)，IL-1β和TNF-αELISA檢測試劑盒(索萊寶科技有限公司)。

1.2 實驗動物

清潔級雄性C57小鼠40只，體質量(23±3)g，購自吉林大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)2010-0005。實驗開始前適應性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級動物房，自由飲水攝食，溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%,人工光照12 h晝夜交替。本實驗嚴格遵循《實驗動物護理和使用指南》。

1.3 小鼠PD模型及實驗分組

小鼠適應性飼養(yǎng)一周后隨機分為5組，對照組，PD模型組，DHP低(25mg/kg)、中(50 mg/kg)、高(100 mg/kg)三個劑量組，每組各8只。參照文獻建立PD模型[8]。PD模型組:C57小鼠于每天上午8點先行灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)3 d，其后于上午8點灌胃等體積生理鹽水并10點腹腔注射MPTP 30 mg/kg，連續(xù)5 d后模型成立，其后4 d上午8點灌胃等體積生理鹽水。DHP各劑量組:每天上午8點先行灌胃各劑量DHP，連續(xù)3 d，其后在上午8點灌胃各劑量DHP，10點注射MPTP 30 mg/kg，連續(xù)5 d，其后4 d上午8點灌胃各劑量DHP；對照組:C57小鼠給予等體積生理鹽水。所有小鼠于第13天進行行為學測試，測試后處死小鼠留取血清進行炎癥因子檢測。

1.4 懸掛實驗

自制一根懸掛麻繩用于小鼠的懸掛實驗。實驗前將小鼠懸掛于一根麻繩上，離地高度30 cm，觀察小鼠后肢抓繩狀況，進行評價。兩后肢均抓繩記3分，一只抓繩記2分，均不抓繩記1分，實驗重復5次取平均值。

1.5 曠場實驗

應用自發(fā)活動觀察系統(tǒng)進行本實驗。分別將每只小鼠以頭部向前的方式置于觀察箱中心位置，分別采集5 min總運動距離、停留中央格時長，同時人工記錄站立次數(shù)。檢測每只小鼠前，用75%酒精對觀察箱進行擦拭，以消除氣味及排泄物影響。

1.6 爬桿實驗

參考Arai[9]方法自制爬桿測試裝置。取直徑1 cm、長度0.5 m的木桿，頂端插入一枚泡沫球，木棍表面纏繞紗布以避免小鼠打滑。將各組小鼠分別置于泡沫球上，以小鼠向下運動為即時起點，運動至小鼠四肢全部著地計時結束，記錄本時長為爬行潛伏期。每只實驗鼠連續(xù)測試5次，取平均值，檢測間隔時長2 min。若出現(xiàn)小鼠掉頭或停止爬行，重新開始本次測試。檢測每只小鼠前，用75%酒精對泡沫球及爬桿進行擦拭，以消除氣味及排泄物影響。

1.7 炎癥水平評價

采集小鼠血液樣本，4 ℃，3000 r/min離心10 min。收集血清，用IL-1β、TNF-α試劑盒分析不同組別小鼠IL-1β和TNF-α的活性水平。所有操作按試劑盒說明書進行，酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

共140例患者用于建模，其中按1∶1的比例隨機分為訓練集和驗證集。訓練集與驗證集的臨床參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義。在總的18個臨床參數(shù)，經(jīng)LASSO算法篩選后，在圖1中交叉驗證誤差最小時的lambda處，得到5個與進展期鼻咽癌患者遠處轉移密切相關的參數(shù)，分別是血清EBV DNA，中性粒細胞計數(shù)/淋巴細胞計數(shù)（NLR），治療前血清VCA-IgA抗體，同步放化療，誘導化療。

1.8 統(tǒng)計學處理

使用SPSS22.0對數(shù)據(jù)進行分析，以均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，組內比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 懸掛實驗結果

對照組小鼠肢體協(xié)調，兩后肢均可抓繩，評分均為3分。PD模型組，DHP低、中劑量治療組小鼠評分分別為(1.89±0.31)分、(1.87±0.24)分和(1.96±0.67)分，與對照組相比評分顯著降低，后肢協(xié)調能力下降明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。高劑量治療組小鼠評分為(2.79±0.23)分，與對照組相比下降不明顯，與模型組比較評分明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 曠場實驗結果

與對照組相比，PD模型組小鼠總活動距離和站立次數(shù)明顯減少(P<0.01)，中央格停留時長增加(P<0.01)；與模型組相比，DHP治療組小鼠的水平和垂直運動能力增強，總活動距離延長，站立次數(shù)增多，中央格停留時間延長，隨著DHP用藥劑量加大，小鼠運動能力逐漸增強。其中DHP高劑量小鼠總活動距離比PD模型組小鼠增加了45.40%，站立次數(shù)增加65.92%，中央格停留時長減少了35.59%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表1。

表 1 小鼠曠場實驗結果

2.3 爬桿實驗結果

對照組小鼠下滑時間為(5.98±0.31)s，小鼠下滑動作敏捷平順。PD模型組小鼠動作不協(xié)調，下滑過程中出現(xiàn)卡頓，時長為(10.01±1.2)s，與對照組相比增加了67.39%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。DHP治療后緩解了小鼠動作遲緩癥狀，DHP低、中、高劑量組小鼠下滑潛伏期分別為(9.11±0.28)s、(8.48±0.76)s和(6.19±0.35)s，表現(xiàn)為隨著DHP劑量增加小鼠下滑潛伏期縮短，其中DHP高劑量組下滑時長與模型組相比縮短了38.16%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4 DHP對MPTP誘導的PD小鼠炎癥水平的影響

ELISA結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清中IL-1β(P<0.05)和TNF-α(P<0.01)的含量顯著增加；而與模型組相比，DHP處理后，炎癥因子水平降低，且隨著DHP劑量增加，炎癥因子水平降低更為明顯，其中DHP中、高劑量組小鼠血清中的IL-1β、TNF-α與模型組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見圖1。

與對照組相比**P<0.01,與模型組相比##P<0.01圖 1 DHP對MPTP誘導的PD小鼠血清中IL-1β和TNF-α的影響

3 討 論

PD已成為全球發(fā)病率占第2位的神經(jīng)退行性疾病，老年人口受威脅人數(shù)占比1%[10]。而目前臨床治療用藥并不能從根本上減少疾病的發(fā)生及減緩病

情進展，且副作用較多，因此探索更為有效的藥物具有重要意義。本研究旨在研究DHP對MPTP誘導的PD小鼠模型是否具有神經(jīng)保護作用及其可能的作用機制。結果顯示，與PD模型組相比DHP高劑量組小鼠的運動協(xié)調能力得到明顯改善，炎癥水平顯著降低，說明DHP能夠改善PD小鼠癥狀，可作為PD等神經(jīng)退行性疾病新的藥物進行進一步探索。

藥理學研究表明，DHP具有廣泛的生物活性[11]。文獻報道[12]，DHP在二甲苯致小鼠腫脹模型和急、慢性小鼠炎癥模型中具有抗炎消腫作用，降低了血液中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平；在雞蛋液誘導的大鼠足腫脹模型中，DHP能夠緩解足腫脹度；Ge等[13]通過香煙煙霧誘導的小鼠肺炎模型研究發(fā)現(xiàn)，DHP在降低血液炎癥因子TNF-α和IL-1β水平及其信號通路NF-κB和MAPK相關蛋白的磷酸化水平中發(fā)揮關鍵作用。

懸掛實驗是對運動協(xié)調能力進行評價的重要方法。本研究中MPTP損傷了小鼠的協(xié)調能力，經(jīng)過25及50 mg/kg劑量DHP治療效果改善不明顯；但經(jīng)100 mg/kg劑量DHP治療后，小鼠后肢協(xié)調運動情況有顯著改善。提示100 mg/kg劑量DHP可緩解MPTP誘導的PD小鼠后肢運動障礙情況。曠場實驗是評估小鼠的焦慮情緒水平及觀測小鼠的自發(fā)活動常用實驗。本研究中，100 mg/kg劑量DHP可顯著降低PD模型小鼠的中央格停留時長，增加總活動距離和站立次數(shù)，說明DHP對MPTP誘導的PD小鼠水平及垂直自發(fā)運動能力障礙有所改善，對焦慮情緒有緩解作用。爬桿實驗是對四肢綜合運動能力檢測的一種方法，本研究結果中，模型組下滑潛伏期明顯延長，下滑中卡頓現(xiàn)象頻繁，而經(jīng)100 mg/kg劑量DHP治療后癥狀得到了明顯的改善，提示DHP對MPTP誘導的PD小鼠四肢協(xié)調運動障礙有治療作用。

研究證實，PD發(fā)病與多巴胺能神經(jīng)元病變密切相關，其作用機制包含氧化應激和炎癥反應等[14]。腦內小膠質細胞過度激活而引發(fā)了炎癥反應，釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子[15]。機體炎癥狀態(tài)下，外周免疫細胞可通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[16]，并通過旁分泌和內分泌信號干擾導致神經(jīng)炎癥，從而進一步加重了神經(jīng)退行性變的發(fā)生及發(fā)展[17]。IL-1β和TNF-α是早期急性炎癥標志因子，常用于炎癥反應指標。TNF-α由小膠質細胞分泌，可誘導NO、谷氨酸等神經(jīng)毒物的釋放，促進炎性因子釋放，放大炎癥反應，并可干預Ca2+離子平衡，從而加速多巴胺能神經(jīng)元的損傷，加重PD病癥狀。常慶慶等[18]報道，PD患者外周血及腦脊液中TNF-α水平明顯高于一般人群。項鑫等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PD大鼠外周血中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子水平明顯升高。本研究中，PD模型組小鼠外周血中IL-1β和TNF-α水平明顯升高，而經(jīng)DHP治療干預后有所下降，提示DHP對MPTP誘導的PD小鼠炎癥反應有緩解作用。

綜上所述，DHP可改善MPTP誘導引發(fā)的小鼠PD樣癥狀，減輕運動缺陷表現(xiàn)，降低炎癥反應，對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用，其機制可能與DHP的抗炎作用相關。