孫夢(mèng)笛,劉 暢,馮國(guó)軍,劉大軍,閆志山,楊曉旭

(黑龍江大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080)

0 引 言

菜豆(PhaseolusvulgarisL.)也稱蕓豆，豆科，菜豆屬[1]，是短日照植物，喜溫，不耐凍。如今菜豆在我國(guó)大面積地種植，菜豆的品種資源非常豐富，屬于我國(guó)主要的蔬菜種類(lèi)之一，也是重要的食用豆類(lèi)之一。 菜豆種子萌發(fā)開(kāi)始溫度為8 ℃左右，適宜生長(zhǎng)溫度為20～25 ℃，種子萌發(fā)適應(yīng)的地溫為10～12 ℃[2]。

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)受到低溫的影響，降低植株的出苗率，導(dǎo)致其產(chǎn)量迅速下降。種子的萌發(fā)是其生長(zhǎng)過(guò)程中的重要階段，萌發(fā)過(guò)程所發(fā)生的生化反應(yīng)都需要適宜的溫度，低溫會(huì)導(dǎo)致種子的萌發(fā)受到抑制，貯藏物質(zhì)水解迅速，發(fā)芽率降低,過(guò)氧化物酶的功能減退，破壞了活性氧原有的平衡，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂。因此，研究在低溫脅迫下對(duì)菜豆種子的影響，對(duì)菜豆的生產(chǎn)具有重要的意義[3]。

水楊酸作為一種小分子酚類(lèi)物質(zhì)，也是植物內(nèi)源激素,在植物逆境條件下具有較強(qiáng)的生理作用。對(duì)于低溫的逆境條件，水楊酸能夠進(jìn)一步緩解低溫脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)造成的負(fù)面影響。近年來(lái)，關(guān)于水楊酸在低溫脅迫下的研究表明：經(jīng)外源水楊酸處理的植物抗寒性有所提高，如茄子[4]，玉米[5]，棉花[6]等，但是水楊酸在低溫脅迫條件下對(duì)菜豆種子萌發(fā)的影響少有報(bào)道。本文以低溫敏感的“熱那亞”為試驗(yàn)材料，研究在低溫脅迫條件下，施加外源物質(zhì)水楊酸對(duì)菜豆種子萌發(fā)以及生理生化特征的影響，為菜豆低溫脅迫的有效防御提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選擇低溫敏感型的“熱那亞”菜豆為試驗(yàn)材料，由黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)園藝學(xué)團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)試驗(yàn)

本研究選取低溫敏感型的“熱那亞”品種。選擇大小一致、成熟飽滿的種子，用10%的次氯酸鈉消毒10 min，再用蒸餾水沖洗3～5次，吸干水后置于帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50粒種子。在對(duì)菜豆種子進(jìn)行低溫脅迫實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)低溫處理12 h種子的發(fā)芽率較高，因此設(shè)置3個(gè)處理組，每組進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。①CK：25 ℃+30 mL蒸餾水，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；②LT：4 ℃+30 mL蒸餾水，置于4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h進(jìn)行低溫脅迫處理，再置于25 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；③LT+SA：4 ℃+30 mL，2.5 mg·L-1SA，置于4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h進(jìn)行低溫脅迫處理，再置于25 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

以胚根伸出種皮2 mm作為發(fā)芽標(biāo)志，計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)，第4天測(cè)量胚根胚軸長(zhǎng)度。發(fā)芽勢(shì)=(發(fā)芽初期規(guī)定日期內(nèi)發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%，發(fā)芽率=(發(fā)芽末期規(guī)定日期內(nèi)發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%，發(fā)芽指數(shù)=不同時(shí)間的發(fā)芽數(shù)/對(duì)應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.2.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定方法

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用DPS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，試驗(yàn)圖表均采用Excel軟件繪制。

2 結(jié)果分析

2.1 外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下菜豆種子萌發(fā)的影響

外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下菜豆種子萌發(fā)的影響見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與CK相比，在低溫脅迫下，菜豆種子的發(fā)芽率，發(fā)芽勢(shì)，發(fā)芽指數(shù)分別降低了53.43%，58.74%，61.19%；在低溫下施加水楊酸，與LT相比分別提高了94.13%，113.58%，117.16%；與CK相比，LT+SA處理分別降低了9.59%，11.89%，15.70%。由此表明：在低溫脅迫下，菜豆種子的萌發(fā)受到抑制，但施加外源SA能夠有效緩解低溫對(duì)菜豆種子萌發(fā)的抑制，菜豆種子發(fā)芽率，發(fā)芽勢(shì)，發(fā)芽指數(shù)顯著提高，但未恢復(fù)到常溫組原有的發(fā)芽水平。

表1 外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下菜豆種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of exogenous salicylic acid on Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

2.2 外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下菜豆種子胚軸胚根的影響

外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下菜豆種子胚軸胚根的影響見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，CK和LT處理的胚軸長(zhǎng)差異顯著，但胚根長(zhǎng)差異不顯著，在低溫條件下與CK相比，胚軸，胚根長(zhǎng)分別降低了36.82%，17.68%。因此，低溫脅迫抑制了菜豆種子的生長(zhǎng)。LT+SA組的胚軸和胚根長(zhǎng)與LT相比分別提高了72.93%，28.83%，表明施加外源SA促進(jìn)菜豆種子胚的伸長(zhǎng)。

表2 外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下菜豆種子胚軸胚根的影響Table 2 Effects of exogenous salicylic acid on Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

Note: The averages and standard errors are from 3 independent experiments. Different lowercase letters in each column indicate significant differences at the 0.05 level.

2.3 外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下菜豆種子抗氧化酶活性的影響

低溫脅迫下SA對(duì)菜豆種子抗氧化酶活性的影響見(jiàn)圖1～圖3。由圖1可見(jiàn)，LT組處理的POD活性明顯低于CK組，經(jīng)SA處理的POD活性提高，并且隨著處理時(shí)間的變化逐漸升高，與LT比，POD活性在12、24、36、48 h分別提高101.33%，70.82%，17.28%，20.65%，且差異顯著。

圖1 低溫脅迫下SA對(duì)菜豆種子過(guò)氧化物酶活性的影響Fig.1 Effects of SA on POD activity of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

由圖2可見(jiàn)，在4個(gè)不同的時(shí)間段中，低溫條件CAT活性受到抑制，施加外源SA使CAT活性分別上升了69.84%，33.33%，27.91%，37.78%。并且施加外源SA的CAT活性高于常溫對(duì)照組，在36 h和48 h時(shí)差異顯著。

圖2 低溫脅迫下SA對(duì)菜豆種子過(guò)氧化氫酶活性的影響Fig.2 Effects of SA on CAT activity of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

由圖3可見(jiàn)，在低溫處理下SOD活性降低，與CK相比在36 h顯著降低；與LT相比，SA處理下的SOD活性略微提高，均高于對(duì)照組CK且在12、24、48 h差異顯著。

圖3 低溫脅迫下SA對(duì)菜豆種子超氧化物歧化酶活性的影響Fig.3 Effects of SA on SOD activity of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

由此說(shuō)明施加水楊酸可以通過(guò)提高抗氧化酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)保護(hù)生物膜的目的，進(jìn)一步減少了低溫對(duì)膜系統(tǒng)的傷害，提高菜豆種子的抗寒能力。

2.4 外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下菜豆種子MDA含量和產(chǎn)生速率的影響

MDA是判斷植物膜結(jié)構(gòu)被損害程度的標(biāo)準(zhǔn)之一。低溫脅迫下SA對(duì)菜豆種子丙二醛含量的影響見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，低溫條件明顯提高了菜豆種子的MDA含量，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MDA含量逐漸升高，與CK對(duì)比，分別提高了44.14%，4.64%，19.44%，35.89%，且差異顯著。施加外源水楊酸減少了MDA在低溫下的積累，與LT對(duì)照比在12、24、36、48 h分別降低了13.02%，1.38%，7.89%，9.80%；且在12 h和48 h時(shí)差異顯著，在24 h和36 h時(shí)差異不顯著。

圖4 低溫脅迫下SA對(duì)菜豆種子丙二醛含量的影響Fig.4 Effects of SA on MDA content of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

圖5 低溫脅迫下SA對(duì)菜豆種子產(chǎn)生速率的影響Fig.5 Effects of SA on production rate of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

因此，低溫下外源水楊酸可以降低菜豆在冷脅迫時(shí)自由基和活性氧的含量，避免積累過(guò)多的MDA，緩解了低溫對(duì)膜系統(tǒng)的傷害程度。

2.5 外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下菜豆種子脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

低溫脅迫下SA對(duì)菜豆種子脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖6，圖7。由圖6，圖7可見(jiàn)，在4 ℃低溫對(duì)照組，脯氨酸和可溶性蛋白的含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在36 h達(dá)到最大值，與CK比分別提高了5.77%，6.46%。在低溫下加入外源SA，與LT處理比增加了脯氨酸和可溶性蛋白的積累，其中，脯氨酸在不同的時(shí)間段分別增加了11.85%，6.64%，4.77%，6.24%，可溶性蛋白分別增加13.82%，9.85%，2.41%，13.84%。

圖6 低溫脅迫下SA對(duì)菜豆種子脯氨酸含量的影響Fig.6 Effects of SA on Proline content of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

圖7 低溫脅迫下SA對(duì)菜豆種子可溶性蛋白含量的影響Fig.7 Effects of SA on Soluble protein content of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

由此表明：菜豆種子在低溫冷害下，施加水楊酸促進(jìn)脯氨酸和可溶性蛋白含量的積累，進(jìn)而有效地保護(hù)種子免受低溫的傷害。

3 討 論

由已報(bào)道的實(shí)驗(yàn)研究表明水楊酸常作為一種信號(hào)調(diào)節(jié)因子，不僅參與植物的各種脅迫反應(yīng)，而且還會(huì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，改善植物的生理生化特征[11]。通常水楊酸通過(guò)充當(dāng)抗氧化劑來(lái)清除植物體內(nèi)的活性氧，并且可以激活植物的抗氧化系統(tǒng)來(lái)直接抵御逆境給植物造成的氧化破壞影響[12]。在低溫條件下，植物出現(xiàn)不同的脅迫反應(yīng)，損害生物膜的結(jié)構(gòu)，影響膜的透性，植物生理生化也發(fā)生不同程度的變化。本實(shí)驗(yàn)低溫環(huán)境明顯抑制了菜豆種子的萌發(fā)，施加外源水楊酸能夠抵御低溫冷害對(duì)菜豆種子造成的傷害，增強(qiáng)菜豆種子自身的抗寒特性。這與Diao Q N等[13]試驗(yàn)結(jié)果是一致的。

低溫條件下，會(huì)使細(xì)胞膜受到傷害，發(fā)生膜脂過(guò)氧化反應(yīng)最終產(chǎn)生丙二醛。丙二醛作為判斷植物受到逆境危害程度的重要指標(biāo)之一，與種子的活力密切相關(guān)，一般情況下，MDA的含量高，表明：種子受到一定程度的傷害導(dǎo)致種子發(fā)芽能力降低。在本實(shí)驗(yàn)中，低溫逆境抑制種子的萌發(fā)，種子發(fā)芽率，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)有所下降，而MDA的含量有所上升，這與王宏燕等[14]研究情況相同。通過(guò)外源水楊酸的處理，能夠抑制膜脂過(guò)氧化現(xiàn)象的產(chǎn)生，降低了MDA的含量，以此來(lái)減少低溫逆境對(duì)菜豆種子帶來(lái)的傷害，保持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提高菜豆種子在萌發(fā)階段的抗寒能力。

脯氨酸作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在諸多脅迫環(huán)境中均有表現(xiàn)，同樣在低溫的條件下也積累游離的脯氨酸。在植物體內(nèi)，脯氨酸能夠加強(qiáng)蛋白質(zhì)的水合作用，穩(wěn)定細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)可溶性蛋白的含量的積累，保護(hù)細(xì)胞不受逆境的傷害?？扇苄缘鞍滓彩呛饬恐参锟购詮?qiáng)弱的一種指標(biāo)，其含量的提高表明植物對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)性強(qiáng)，趙萌[15]認(rèn)為可溶性蛋白的含量與植物抗寒的能力呈正相關(guān)。研究中，低溫下的菜豆種子積累少量的脯氨酸和可溶性蛋白，但SA的添加提高了菜豆種子中脯氨酸和可溶性蛋白含量，進(jìn)一步提高了菜豆種子在萌發(fā)過(guò)程中的抗寒性，該結(jié)果在玉米種子[16]，扁稽豆種子[17]上早有報(bào)道。

活性氧在低溫逆境的誘導(dǎo)下產(chǎn)生速率加快，導(dǎo)致種子的萌發(fā)受到抑制，為了防止活性氧帶來(lái)的傷害，種子內(nèi)形成保護(hù)酶系統(tǒng)來(lái)抵抗植物面臨的逆境條件，保護(hù)酶系統(tǒng)主要包含POD，SOD，CAT 3種酶，本實(shí)驗(yàn)與常溫對(duì)照比在低溫下的保護(hù)酶的活性均降低，施加SA后可以提高菜豆種子內(nèi)各個(gè)部位清除活性氧的能力，導(dǎo)致菜豆種子的POD和CAT活性顯著提高，而SOD有略微的提高。

4 結(jié) 論

在低溫逆境下，菜豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)分別降低了53.43%，58.74%，61.19%；通過(guò)外加水楊酸分別提高了94.13%，113.58%，117.16%。與LT對(duì)照比，外源SA的施加減少了膜的損害，使菜豆種子MDA含量在12、24、36、48 h分別降低了13.02%，1.38%，7.89%，9.80%。脯氨酸在不同的時(shí)間段分別增加了11.85%，6.64%，4.77%，6.24%，可溶性蛋白分別增加了13.82%，9.85%，2.41%，13.84%。抗氧化酶作為ROS的清除系統(tǒng)之一，外源SA的處理增強(qiáng)了抗氧化酶對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)，提高抗氧化酶的活性，緩解低溫逆境對(duì)菜豆種子的傷害。由此表明：低溫脅迫打破了菜豆種子內(nèi)部原有的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致氧代謝失調(diào)，積累大量的活性氧及MDA，降低抗氧化酶的活性，使細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，影響菜豆種子的正常萌發(fā)。而水楊酸作為植物生長(zhǎng)過(guò)程中的調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠進(jìn)一步改善菜豆種子在低溫脅迫下的萌發(fā)情況，提高菜豆種子的抗氧化酶活性，同時(shí)減少了MDA和活性氧的積累，保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，維持菜豆種子內(nèi)原有的平衡狀態(tài)，能夠有效抵御低溫脅迫對(duì)菜豆種子帶來(lái)的傷害，使菜豆種子在萌發(fā)過(guò)程中對(duì)低溫環(huán)境產(chǎn)生一定的適應(yīng)能力，提高其抗寒性。