呂嬌嬌，晉玲，王艷，張婷，高國香

(甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000)

甘肅是全國中藥材大省，藥用植物資源豐富，共有1 270多種，其中當歸、黨參、黃芪、大黃、甘草、黃芩、板藍根、款冬花、枸杞、柴胡等為甘肅省傳統(tǒng)道地、大宗藥材，受到醫(yī)藥界的廣泛關注[1].藥用植物具有豐富的物種多樣性，為內(nèi)生細菌的篩選提供了廣泛的資源。

當今我國對藥用植物內(nèi)生細菌的研究開發(fā)較少，世界上約有30萬種藥用植物，而我國僅對當歸、半夏、苦參、金銀花、人參、枸杞、沙冬青、長春花等幾十種藥用植物內(nèi)生細菌進行過研究報道，巨大的內(nèi)生細菌資源寶庫尚未被開發(fā)利用[2-5]。

植物內(nèi)生細菌的概念由 Kloepper于1992年首次提出，他指出植物內(nèi)生細菌能存在于植物體內(nèi)，與植物體長期共生，且不會給宿主本身帶來實質(zhì)性的傷害[6].研究報道，許多藥用植物體內(nèi)含有豐富的內(nèi)生細菌資源，不同種類藥用植物之間內(nèi)生細菌的種類存在一定差異，不同部位內(nèi)生菌的數(shù)量、分布、種群及組成也存在差異[7].藥用植物內(nèi)生細菌可以通過固氮、溶磷、分泌生長素等作用促進宿主植物的生長及藥用成分的積累，并在植物抗逆境、抗病原菌等方面發(fā)揮著重要作用[8]。

目前，對藥用植物內(nèi)生細菌的研究與其他植物內(nèi)生細菌的研究有許多相同之處，在農(nóng)業(yè)研究方面，研究者都注重內(nèi)生細菌有益的生物學作用，如病害防治、促生、土壤修復等，通過改良作物中內(nèi)生細菌的種群結(jié)構，使它們穩(wěn)定維持在最佳水平以提高作物生產(chǎn)力[9].本研究對甘肅省13種大宗藥用植物內(nèi)生細菌進行分離，以6種植物病原真菌為指示菌篩選拮抗菌株，并篩選具有固氮、溶磷、產(chǎn)IAA及拮抗能力的內(nèi)生細菌資源，以期為開發(fā)甘肅省藥用植物內(nèi)生細菌資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 13種藥用植物均采自于甘肅省隴西市首陽鎮(zhèn)藥用植物園，地理坐標為N 36°4′31″；E 104°27′4″；海拔1 912 m左右，年平均日照時數(shù)2 312 h，≥0 ℃年積溫為2 581～2 721 ℃，無霜期146 d，年均降水量450 mm，年均氣溫7.7 ℃，地塊平坦，肥力狀況均勻，肥力中等，砂質(zhì)壤土。13種藥用植物分別為當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels，蒙古黃芪Astragalusmembra-naceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao，黨參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.，甘草GlycyrrhizauralensisFisch.，唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.，板藍根IsatisindigoticaFort.，寧夏枸杞LyciumbarbarumL.，柴胡Bupleurumchinensis DC.，款冬TussilagofarfaraL.，黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi，苦參SophoraflavescensAit.，曼陀羅DaturastramoniumL.，羌活NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang。

1.1.2 供試菌株 供試6種病原真菌分別為尖孢鐮刀菌FusariumoxysporumSchlecht，灰葡萄孢菌BotrytiscinereaPers.，腐皮鐮孢菌Fusariumsolani(Mart.)Sacc.，木賊鐮刀菌Fusariumeguiseti(Corda.)Sacc.，葉點霉菌PhyllostictasacrophulariaeSace，束狀炭疽菌ColletotrichumdematiumGrove。

1.1.3 植株標號 當歸(DG)、黃芪(HQ)、黨參(DS)、甘草(GC)、大黃(DH)、板藍根(BLG)、枸杞(GQ)、柴胡(CH)、款冬(KD)、曼陀羅(MTL)、羌活(QH)、苦參(KS)、黃芩(HQin)；用大寫字母 G、J、Y分別表示植株根、莖、葉。

1.2 供試方法

1.2.1 內(nèi)生細菌的分離 對參考文獻[10]分離方法進行改進，分別從根、莖和葉中分離內(nèi)生細菌。消毒方法為：取植株根、莖、葉各1 g，第1步將根、莖、葉均用75%酒精浸泡3 min，無菌水沖洗5次；第2步將根、莖、葉分別用3%次氯酸鈉浸泡7 min、5 min、3 min，無菌水沖洗5次，稀釋至10-1倍組織液，吸取200 μL涂布于NA平板上，每處理3次重復，28 ℃培養(yǎng)72 h。以最后1次沖洗的無菌水涂布平板，作為空白對照。挑取不同形態(tài)的菌落，進行純化，4 ℃低溫保存?zhèn)溆?。計算不同植物組織的菌群密度，計算公式為：

每克植株鮮質(zhì)量所含的活菌數(shù)(cfu/g)=(菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×分離用水量)/(涂板用水量×分離組織質(zhì)量)[11]

1.2.2 藥用植物內(nèi)生細菌促生能力測定

1.2.2.1 內(nèi)生固氮細菌的篩選及穩(wěn)定性測定 采用阿須貝無氮培養(yǎng)法[12]測定固氮能力。將已活化好的菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，菌懸液以1∶50的比例加到Ashby液體培養(yǎng)基中.28 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d。根據(jù)液體培養(yǎng)基渾濁程度初步判斷內(nèi)生細菌的固氮能力。即培養(yǎng)液變渾濁為陽性，具有固氮活性[13]。

對參考文獻[13]篩選固氮菌的方法進行改進，將具有固氮活性的菌株在固體Ashby無氮培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接3～8次，轉(zhuǎn)接3次且生長較好，固氮能力級別為“+”，表示具有較強固氮能力；轉(zhuǎn)接5次且生長較好，固氮能力級別為“++”，表示具有強固氮能力；轉(zhuǎn)接8次且生長較好，固氮能力級別為“+++”，具有穩(wěn)定固氮能力。

1.2.2.2 內(nèi)生溶磷細菌的篩選及測定 采用溶磷圈法定性測定溶磷能力[14-15].將菌株活化后接種于PKO平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，根據(jù)菌株形成的溶磷圈直徑(D)/菌落直徑(d)確定各菌株溶磷能力。將初篩的解磷菌在NA液體培養(yǎng)基中28 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h。用鉬銻抗顯色-紫外分光光度計法在波長530 nm下測定有效磷含量(mg/L)。

1.2.2.3 產(chǎn)IAA內(nèi)生細菌的篩選及能力測定 以Salkowski法測定產(chǎn)吲哚乙酸的能力[16]。將菌株活化后，接種于King氏培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d。通過觀察溶液的顏色變化判斷菌株是否產(chǎn)IAA。

將已篩選出的能產(chǎn)IAA的細菌在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)72 h，立即置于避光條件下，30 min之后測定其OD530值，計算培養(yǎng)液中的IAA含量(mg/L)[17]。

1.2.3 內(nèi)生拮抗細菌抑菌能力的測定 采用平板對峙法篩選內(nèi)生拮抗細菌[18-19].測量抑菌帶寬度、病原菌直徑，并計算其相應的抑菌率，抑制率(%)=(對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑)/(對照病原菌菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析利用SPSS 22.0軟件進行相關數(shù)據(jù)的整理與分析，采用 Duncan’s新復極差法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 13種藥用植物根、莖、葉內(nèi)生細菌的數(shù)量及分布特點

內(nèi)生細菌數(shù)量如圖1所示，13種藥用植物的根、莖、葉中均有內(nèi)生細菌共分離到439株，其中在甘草、當歸中分離種類較多，分別為59株和50株，枸杞、大黃中分離較少，分別為17株和16株；內(nèi)生細菌的分布依次為根(48.06%)>莖(29.38%)>葉(22.56%)，且根、莖、葉中內(nèi)生細菌數(shù)量差異顯著(P<0.05).內(nèi)生細菌菌群密度如圖2所示，13種藥用植物內(nèi)生細菌的菌群密度差異顯著(P<0.05)，菌群密度為4.60×104～1.33×105cfu/g，且根、莖、葉內(nèi)生細菌數(shù)量差異顯著(P<0.05)。甘草根菌群密度最大為5.58×104cfu/g，大黃葉菌群密度最小為0.80×104cfu/g。不同組織中，根中菌群密度最大為2.18×104～5.58×104cfu/g；莖次之為1.58×104～4.38×104cfu/g，葉中最小為0.80×104～3.48×104cfu/g。

圖1 13種藥用植物根、莖、葉中內(nèi)生細菌種類

圖2 13種藥用植物根、莖、葉中內(nèi)生細菌菌群密度

2.2 藥用植物內(nèi)生細菌促生能力

2.2.1 固氮細菌的篩選及穩(wěn)定性測定 從分離439株內(nèi)生細菌中，初步篩選出184株固氮細菌，固氮內(nèi)生細菌在植物組織的分離頻率依次為：根(24.42%)>葉(12.8%)>莖(7.52%)，根、莖分離的固氮菌株數(shù)量差異顯著(P<0.05)，葉分離的固氮菌株數(shù)量差異不顯著(P>0.05)。13種藥用植物中，8種藥用植物內(nèi)生固氮細菌在各植物組織的分離數(shù)量依次為根>莖>葉，其余5種植物固氮細菌在各植物組織的分離數(shù)量依次為根>葉>莖；其中，款冬分離的固氮菌株最多，為19株，大黃分離的固氮菌株最少，為9株(表1)。

根據(jù)初步篩選出的184株具固氮活性的菌株在Ashby無氮固體培養(yǎng)基上生長情況，對固氮能力進一步進行測定。篩選出具有強固氮能力的菌株50株，轉(zhuǎn)接3次且生長較好；具有較強固氮能力的菌株49株，轉(zhuǎn)接5次且生長較好；具有穩(wěn)定固氮能力的菌株43株，轉(zhuǎn)接8次且生長較好(表1)。

表1 13種藥用植物固氮細菌的分離數(shù)及分離頻率

2.2.2 溶磷細菌的篩選及測定 如圖3所示，48株內(nèi)生細菌能夠在PKO培養(yǎng)基形成透明圈，對無機磷有良好的溶解效果，且差異顯著(P<0.05)。48株磷細菌中，有81%分離于植株根部，18%分離于植株葉部，僅有1%分離于植株莖部；具有穩(wěn)定溶磷能力的菌株有19株，強溶磷能力的菌株21株，具較強溶磷能力的菌株有8株；有23株溶磷細菌兼具固氮能力，D/d在2.5～3.5之間溶無機磷量在23.17～49.37 mg/L，D/d在1.5～2.5之間溶無機磷量在10.01～25.72 mg/L；D/d在1.0～1.5之間溶無機磷量在2.85～8.66 mg/L。各溶磷菌株間的溶磷量差異顯著(P<0.05)。且溶磷圈比值和溶無機磷量相關性顯著(P<0.05)，即溶磷圈比值越大，溶無機磷量越多，溶磷能力越強(表2)。

表2 具溶磷能力的菌株

圖3 48株溶磷菌株在PKO無機磷培養(yǎng)基上的生長狀況

287株內(nèi)生細菌發(fā)酵上清液與salkowskis試劑混合后，顏色發(fā)生變化，占所用菌株的58.10%。但大部分內(nèi)生菌發(fā)酵液與salkowskis混合顯色后顏色較淺，分泌量較低。與對照10.0 mg/L，IAA顯色后的粉紅色相比，篩選出44株顯色較深的內(nèi)生細菌進一步用于定量測定，包括顯色為粉紅色。與10.0 mg/L顯色相當?shù)膬?nèi)生細菌有29株，顯色反應為紅色的10株；以及顯色為紫紅色的5株。各菌株用King培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)12 d，各菌株產(chǎn)IAA的能力差異顯著(P<0.05)。測試的44株菌株中，分泌量在5.49～56.38 mg/L。其中，分泌量在40 mg/L以上的菌株有5株，分別為DSG7、DSG3、DHG4、DGG4、BLGG7、DGG7；分泌量在20～40 mg/L之間的菌株有8株，分別為BLGY4、KSG4、HQG9、DHY7、KDY5、HQinG8、MTOG3；分泌量在20 mg/L以下菌株有31株(表3)。

表3 分泌IAA較強的內(nèi)生細菌

2.3 內(nèi)生拮抗細菌抑菌能力的測定

共篩選出16株具有抑菌能力的菌株，占所用菌株的3.64%.內(nèi)生細菌的抑菌活性在18.74%～53.01%(表4)。如圖4所示，菌株DSG3、DSY6、KDG5對尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌3種病原真菌均有不同程度的抑菌作用，未篩選出對束狀炭疽菌、灰葡萄孢菌和葉點霉菌有抑菌活性的菌株。KSG7對尖孢鐮刀菌的抑菌能力最強，抑菌率為53.01%，DSY6對腐皮鐮刀菌的抑菌能力最強，抑菌率為39.87%，QHG9對木賊鐮刀菌的抑菌能力最強，抑菌率為45.28%.DSG3、CHG4、KDG5、KDG4這4株拮抗細菌兼具固氮、溶磷及產(chǎn)IAA的促生功能。

A，B，C分別為KDG5對尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌的抑制作用；D,E,F分別為DSG3對3種病原菌的抑制作用；G、H、I分別為DSY6對3種病原菌的抑制作用；J、K、L分別為3種病原菌的對照。

表4 拮抗內(nèi)生細菌對植物病原真菌的抑制活性

供試6種病原真菌分別為尖孢鐮刀菌FusariumoxysporumSchlecht.、灰葡萄孢菌BotrytiscinereaPers.、腐皮鐮孢菌FusariumsolaniMart.、木賊鐮刀菌Fusariumeguiseti(Corda)Sacc.、葉點霉菌PhyllostictasacrophulariaeSace.、束狀炭疽菌ColletotrichumdematiumGrove。

3 討論

本研究對甘肅省13種藥用植物內(nèi)生細菌的數(shù)量、分布特征、促生特性(固氮、溶磷、產(chǎn)IAA)及抑菌活性進行了測定與分析。發(fā)現(xiàn)13種藥用植物中共有439株藥內(nèi)生細菌，其分布情況為根>莖>葉，該分布情況與多個研究結(jié)果一致。文獻報道大多數(shù)植物內(nèi)生細菌的數(shù)量分布規(guī)律總體為：地下組織遠高于地上組織，以根中最多，是內(nèi)生細菌最適宜定殖的部位；其次是莖和葉片，生殖器官花、果實、種子中最少[20]。如張立新[21]等從番茄中共分離出 59株內(nèi)生細菌，其中，根部分離出41株，莖中分離出18株，葉中分離出11株。羅明報道[22]，根中內(nèi)生細菌的菌群密度約為8×103～9.9×106cfu/g；莖中為2×102～2.1×107cfu/g；葉片內(nèi)為l×102～9.9×106cfu/g，本次從13種藥用植物中分離得到的內(nèi)生細菌里面，根中菌群密度最大，為2.18×104～5.58×104cfu/g；莖次之，為1.58×104～4.38×104cfu/g，葉中最小，為0.80×104～3.48×104cfu/g。在不同部位分布的內(nèi)生細菌種類和數(shù)量有較大差異，可能是因為近根系營養(yǎng)物質(zhì)豐富，有利于內(nèi)生細菌的生長繁殖[23]。

藥用植物內(nèi)生細菌可通過自身的固氮、溶磷及產(chǎn)IAA直接促進植物生長.張潔等[24]從半夏中分離到的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌通過固氮和溶磷作用向植物提供營養(yǎng)成分，從而促進植株的生長發(fā)育.Pan和 Vessey[25]報道指出，一些內(nèi)生細菌能分泌生長素能促進植物生長的化學物質(zhì)來促進植物生長.內(nèi)生細菌也可以通過對不同植物病原菌的拮抗作用間接的促進植物生長.范曉靜等[26]從銀杏中分離到一株對植物病原真菌抑菌效果較好，且具有較廣拮抗譜的解淀粉芽孢桿菌，檢測表明該菌所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)具有較強的抗菌效果，為我國新型生物源農(nóng)藥的研制提供了參考菌源。

本研究初篩得到較高比例的固氮菌184株，但只是對內(nèi)生細菌有無固氮能力作了初步判斷，沒有進一步測定固氮酶活性，因此結(jié)果可靠性不強.固氮酶活性是衡量生物固氮效率的重要指標之一.除了體外固氮能力的測定，還應該將固氮菌回接到植物體內(nèi)研究其促生效應，為進一步篩選高效固氮菌奠定基礎.近年來，國內(nèi)外研究者對各類植物中的固氮菌及其固氮能力進行了研究，發(fā)現(xiàn)許多植物中都存在較高比例的固氮菌。例如，從尼瓦拉野生稻中共分離到57株內(nèi)生細菌，其中44株為內(nèi)生固氮菌，固氮酶活性在5.79～899.72 nmol/(mL·h)之間[27]。

將439株內(nèi)生細菌用溶磷圈法初步篩選溶磷菌株，48株內(nèi)生細菌能夠在PKO無機磷培養(yǎng)基形成透明圈，對無機磷有良好的溶解效果。溶磷圈大小可能與其生長時間有關，也與其分泌代謝物的種類、釋放速度以及代謝物在平板上的蔓延速度等有關[28]。溶磷量在2.85～49.37 mg/L之間，說明藥用植物內(nèi)生細菌對無機磷的溶解能力較強。

另外，菌株的溶磷機理也非常復雜，如分泌質(zhì)子、有機酸和其他物質(zhì)的數(shù)量和種類，其次，與難溶性磷酸鹽的結(jié)構和組成成分有關系，本研究各菌株的溶磷機理有待進一步研究[29].

很多植株內(nèi)生細菌都具有分泌IAA能力，分泌量差異較大。Malik等[30]用比色法測定了巴基斯坦鹽堿地小麥等植物的內(nèi)生細菌分泌IAA能力，其在5.11～35.90 mg/L之間。本研究各菌株產(chǎn)IAA能力進行定性和定量測定結(jié)果基本一致，各菌株分泌量在5.49～56.38 mg/L，略高于Malik的測定結(jié)果。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與與菌株種類、生理和生態(tài)特性及培養(yǎng)條件等因素有關.篩選 IAA分泌內(nèi)生細菌時，不應只把菌株分泌 IAA的量作為簡單的衡量指標，而應與測定菌株對植物的實際促生效果等方法相結(jié)合，以便篩選到適合進一步開發(fā)利用的促生菌資源[31]。

4 結(jié)論

選用甘肅省8種常見的植物病原菌進行抑菌試驗。從13種藥用植物中共篩選出16株具有抑菌能力的菌株，占所用菌株的3.64%。具有抑菌活性菌株的抑菌率在18.74%～53.01%之間，這為藥用植物病害的生物防治提供了一定的理論依據(jù)。內(nèi)生菌細通過產(chǎn)生抗生素類、水解酶類、生物堿類以及與病原微生物競爭營養(yǎng)物質(zhì)的方式來控制植物病害，本研究分離得到的抗性菌株究竟是哪類物質(zhì)起作用及如何提高其抑菌活性還需進一步的研究[32]。綜合以上研究結(jié)果，DSG3、CHG4、KDG5、KDG4這4株拮抗細菌兼具固氮、溶磷及產(chǎn)IAA功能，豐富了植物促生細菌資源，為進一步研發(fā)單一或復合微生物菌肥奠定了基礎，具有良好的開發(fā)潛力和應用前景。