田 璐，黃奕雯，黃種持

(1.福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院，福建省海洋生物技術(shù)重點實驗室，福建 福州 350002；2.福建省漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003)

失憶性貝類毒素(Amnesic shellfish poisoning，ASP)是由多列擬菱形藻(Pseudo-nitzschiaseudonitzsehia)分泌產(chǎn)生的毒素，其引起中毒的成分是軟骨藻酸(Domoic acid，DA)[1]。部分浮游植物產(chǎn)生的有毒次生代謝物“藻毒素”，也可以沿食物鏈傳遞并在貝類體內(nèi)積累，稱為“貝毒”。人類食用含有大量貝毒的水產(chǎn)品后會引起中毒，甚至死亡[2]。1987年底，加拿大暴發(fā)了一種急性疾病，其特征是食用養(yǎng)殖貽貝的人出現(xiàn)胃腸道癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)異常，事后研究表明引起中毒的活性成分為DA，是一種強有力的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[3]。DA的存在可能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬區(qū)和丘腦區(qū)與記憶有關(guān)區(qū)域的損傷，從而導(dǎo)致記憶的喪失。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，攝入15～20 mg DA的人群未受其影響；攝入量為60～110 mg時會引起中度胃腸道癥狀；攝入量為295 mg時表現(xiàn)出各種嚴重癥狀，可見DA的毒性具有劑量效應(yīng)[4]。對貝體內(nèi)DA的食用安全性進行研究，發(fā)現(xiàn)人類通過膳食可耐受的最大限量為20 mg/kg，因此美國FDA將DA列為嚴重危害人類健康的四種主要海洋生物毒素之一，加拿大首先制定了DA的安全限量標準為20 μg/g貝肉[5]，歐盟和美國安全標準為20 mg/kg貝肉組織[6]。

福建是貝類養(yǎng)殖大省，貝類質(zhì)量安全和百姓健康與海洋經(jīng)濟的發(fā)展息息相關(guān)。近年來，由于沿海特殊的海灣環(huán)境、氣候條件，以及人類開發(fā)活動的加劇，導(dǎo)致福建近岸海域環(huán)境不斷惡化，赤潮災(zāi)害頻發(fā)，而赤潮毒素通過食物鏈傳遞富集至貝類體內(nèi)，進而危害人類健康。加之養(yǎng)殖貝類品種繁多，生物特性各異，導(dǎo)致貝毒風(fēng)險隱患復(fù)雜難控，食用貝類造成的中毒事件時有發(fā)生。在這種形勢下，對貝類毒素的分析研究越來越重要。迄今為止，我國國家和行業(yè)共頒布的有關(guān)檢測失憶性貝類毒素的標準有GB/T 5009.198—2003《貝類 記憶喪失性貝類毒素軟骨藻酸的測定》、SN/T 1070—2002 《進出口貝類中記憶喪失性貝類毒素檢驗方法》、SN/T 1867—2007 《進出口貝類中軟骨藻酸的檢測方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和SN/T 2663—2010《貝類中失憶性貝類毒素檢驗方法 酶聯(lián)免疫吸附法》。這四個標準已被2016年頒布的GB 5009.198—2016《食品安全國家標準 貝類中失憶性貝類毒素的測定》[7]所替代。

檢測DA的主要方法有小鼠生物法(MBA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、毛細管電泳法、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)等[8-12]。Quilliam M A等證明了電噴霧電離-質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù)在檢測貝類中DA和其他水產(chǎn)品毒素方面的潛力[13]，除此之外目前已經(jīng)提出了各種反相/電噴霧電離-質(zhì)譜(RPLC/ESI-MS)技術(shù)檢測DA[14-15]。Ciminiello P等提出了一種基于親水作用液相色譜-質(zhì)譜(HILIC/MS)檢測貝類中DA 的新方法，此方法采用多反應(yīng)監(jiān)測采集模式(MRM)，在陽性和陰性實驗中DA的最低檢測水平分別為63和190 ng/g[16]。Blay P等使用臺式Orbitrap系統(tǒng)進行液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)篩選貝類中常見的多種生物毒素，利用親水作用色譜(HILIC)可在4 min內(nèi)分離DA等毒素，檢出限為3.4～14 μg/L[17]。國內(nèi)有學(xué)者用液相色譜串聯(lián)電噴霧離子阱質(zhì)譜法測定貝類中DA[18]，通過QuEChERS技術(shù)結(jié)合液相色譜-高分辨質(zhì)譜測定貝類中DA[19]，將免疫親和柱凈化技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測雙殼類水產(chǎn)中DA[20]。由于受儀器設(shè)備的限制，國家還未頒布使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)檢測貝類中失憶性貝類毒素的標準。因此，本研究擬應(yīng)用HPLC-MS/MS技術(shù)，參照GB 5009.198—2016《食品安全國家標準 貝類中失憶性貝類毒素的測定》要求，建立貝類體內(nèi)DA殘留的檢測方法，為提高我國貝類體內(nèi)DA的檢測技術(shù)水平和促進水產(chǎn)品質(zhì)量安全管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS-8050高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；3-30Ks高速冷凍離心機，德國Sigma公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；Milli-Q Integral 5 超純水一體化智能系統(tǒng)，美國Millipore公司；超聲波清洗器，德國Wiggens公司；渦旋振蕩器，德國IKA公司。

軟骨藻酸標準品(DA，332±11 μmol/L)、SAX 固相萃取柱(200 mg，6 mL)、甲酸：分析純，上海安譜實驗科技股份有限公司；MAX固相萃取柱(60 mg，3 mL)，美國Waters公司；甲醇、乙腈：色譜純，MERCK公司。

1.2 樣品處理

1.2.1 樣品制備

用清水將貝類樣品外表徹底洗凈，切斷閉殼肌，開殼，用水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來物。將閉殼肌和連接在膠合部的組織分開，取出貝肉，瀝水5 min，檢出碎殼等雜物，將貝肉均質(zhì)，備用。

1.2.2 樣品提取

稱取5 g(精確到0.01 g)試樣于50 mL離心管中，加入50%甲醇溶液12 mL，渦旋混勻1 min，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心5 min，移出上清液。殘渣再用5 mL 50%甲醇溶液重復(fù)提取兩次，合并上清液，以50%甲醇溶液定容至25 mL，混勻。再以10 000 r/min離心5 min，取上清液，待凈化。

1.2.3 樣品凈化

準確吸取提取液5 mL于預(yù)先活化好的SAX小柱中，控制流出液速度約為每秒1滴，然后用5 mL 10%乙腈溶液淋洗，棄去流出液，用4 mL 0.3%甲酸水溶液洗脫，收集洗脫液，用0.3%甲酸水溶液稀釋至4 mL(相當于1 g試樣)，混勻后經(jīng)0.22 μm針筒過濾器過濾，濾液供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.4 空白基質(zhì)液

選取空白試樣，按照“1.2.1～1.2.3”步驟，得到空白基質(zhì)液。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；霧化氣流量3 L/min；加熱氣流量10 L/min；接口溫度300℃；脫溶劑溫度526℃；DL溫度250℃；加熱塊溫度400℃；干燥氣流量10 L/min。

1.4 液相色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18超高壓液相色譜柱(2.1×50 mm，1.7 μm)；流速0.3 mL/min；柱溫30℃；進樣量1 μL。在相同梯度洗脫條件下，分別考察流動相A為甲醇溶液、流動相B為2 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(含0.1%甲酸)和流動相A為0.1%甲酸水溶液、流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液對DA響應(yīng)信號的影響，梯度洗脫見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.5 凈化條件及洗脫液選擇

分別考察MAX(60 mg，3 mL)和SAX(200 mg，6 mL)兩種固相萃取柱的凈化效果，以及分別考察0.3%甲酸溶液、1.0%甲酸溶液和5.0%甲酸甲醇溶液從固相萃取柱洗脫DA的效果。將MAX固相萃取柱依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，SAX固相萃取柱依次用6 mL甲醇、3 mL水和3 mL50%甲醇溶液活化。在一定體積的 100 μg/L DA標準溶液中加入4倍體積的50%甲醇溶液渦旋混合，準確吸取5 mL混合液，加入預(yù)先活化好的MAX和SAX固相萃取柱中，控制流出液速度約為每秒1滴，然后用5 mL 10%乙腈溶液淋洗，棄去流出液，用4 mL不同洗脫液洗脫，收集洗脫液，經(jīng)0.22 μm針筒過濾器過濾，濾液供HPLC-MS/MS測定。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍和檢出限

采用HPLC-MS/MS分析測定時，生物樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)或外源性物質(zhì)會影響分析物的離子化或去溶劑化過程，使分析物的質(zhì)譜響應(yīng)增加或降低，從而產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)[21]。本研究采用計算公式如下：

基質(zhì)效應(yīng)(%)=

當基質(zhì)效應(yīng)在-20%～20%之間為弱基質(zhì)效應(yīng)；在-50%～-20%和20%～50%為中等基質(zhì)效應(yīng)；超過-50%或50%為強基質(zhì)效應(yīng)[22]。

用空白基質(zhì)液稀釋DA并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0 μg/L的基質(zhì)-DA標準系列工作液，利用線性回歸分析計算DA線性范圍。

方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)通常分別按3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比所對應(yīng)的樣品濃度來確定[23]。

1.7 準確度和精密度

取DA標準溶液加入到5 g空白樣品中，使添加水平相當于5.0、12.5、50.0 μg/kg，按“1.2.2～1.2.3”步驟進行樣品處理，每個水平平行測定6次，連續(xù)測定6 d，計算回收率及日內(nèi)、日間相對標準偏差(RSD)。

1.8 方法應(yīng)用

利用本文建立的HPLC-MS/MS法對福州、寧德和莆田3個福建省沿海重點養(yǎng)殖區(qū)的136個貝類(包括牡蠣、縊蟶、貽貝、花蛤、鮑、扇貝6種貝類)樣品進行DA檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

軟骨藻酸分子式為C15H21NO6，含有氨基和多個羧基，離子化過程容易形成正離子，因此選用ESI+離子源進行分析。用DA的標準溶液通過流動注射分析(FIA)在正離子模式下進行母離子掃描，在已知化合物分子量的基礎(chǔ)上，將掃描范圍設(shè)定在200～500 m/z 之間，選擇正離子模式下強度最高的[M+H]+作為母離子。通過產(chǎn)物離子優(yōu)化，對母離子進行碰撞電離，針對自動搜索的產(chǎn)物離子m/z，在-0.5～+0.5 U的范圍內(nèi)，選擇峰強度較大的m/z作為子離子，其中豐度最高的子離子作為定量離子，同時根據(jù)響應(yīng)強弱選擇適宜的碰撞能(CE)，見表2。

表2 軟骨藻酸母離子、子離子和碰撞能量

2.2 色譜條件優(yōu)化

在表1梯度洗脫條件下，流動相A為甲醇溶液、流動相B為2 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(含0.1%甲酸)組合和流動相A為0.1%甲酸水溶液、流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液組合對DA響應(yīng)信號的影響結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，在“2.1”質(zhì)譜條件下，DA分別在2.1 min和2.3 min出峰，出峰時間相差不大，但后者的響應(yīng)更高，因此選擇0.1%甲酸水溶液(流動相A)和0.1%甲酸乙腈溶液(流動相B)作為流動相進行梯度洗脫。

2.3 凈化條件優(yōu)化

貝類中蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)含量較高[24]，要對提取液進行凈化以減少基質(zhì)效應(yīng)和對HPLC-MS/MS產(chǎn)生的干擾。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用4 mL 0.3%甲酸溶液洗脫，經(jīng)SAX固相萃取柱凈化后，回收率超過80%，而經(jīng)MAX固相萃取柱凈化后無目標峰出現(xiàn)(圖2)。

注：A.流動相A為甲醇溶液、流動相B為2 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(含0.1%甲酸)；B.流動相A為0.1%甲酸水溶液、流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液。

注：A.SAX固相萃取柱凈化；B.MAX固相萃取柱凈化。

在確定DA仍吸附在MAX固相萃取柱上后，分別考察了0.3%甲酸溶液、1.0%甲酸溶液和5.0%甲酸甲醇溶液作為洗脫液的洗脫效果，如圖3所示。HPLC-MS/MS檢測發(fā)現(xiàn)，5.0%甲酸甲醇溶液作為洗脫液時有目標峰出現(xiàn)，但回收率僅為10%左右；另外兩種洗脫液均未發(fā)現(xiàn)目標峰。

因此，選擇SAX固相萃取柱進行凈化；洗脫液酸性較強，會對質(zhì)譜產(chǎn)生一定影響，因而選擇0.3%甲酸溶液作為洗脫液。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍和檢出限

注：A.0.3%甲酸溶液洗脫；B.1.0%甲酸溶液；C.5.0%甲酸甲醇溶液。

本研究中基質(zhì)效應(yīng)為-3.4%，DA的響應(yīng)信號略微降低，屬于弱基質(zhì)效應(yīng)。為減少基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響，采用空白基質(zhì)液配制DA標準系列工作液，外標法定量測定。

以目標化合物的濃度為橫坐標(x)，定量離子的峰面積響應(yīng)值為縱坐標(y)進行線性回歸分析。在0.5～25.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.998，結(jié)果見表3。根據(jù)信噪比(S/N)≥3和信噪比(S/N)≥10計算檢出限(LOD)為1.5 μg/kg，定量限(LOQ)為5 μg/kg。

表3 DA線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.5 準確度和精密度

DA的加標回收率和精密度實驗結(jié)果如表4所示。DA在3個濃度水平的平均回收率為68.7%～92.4%，日內(nèi)相對標準偏差在5.4%～8.4%之間(n=6)，日間相對標準偏差在3.9%～5.1%之間(n=6)，滿足分析要求。

表4 加標回收率和精密度(n=6)

2.6 方法應(yīng)用

本研究通過HPLC-MS/MS對福州、寧德和莆田3個福建省沿海重點養(yǎng)殖區(qū)的136個貝類樣品進行DA檢測分析，包括牡蠣、縊蟶、貽貝、花蛤、鮑、扇貝6種貝類，檢測陽性樣品結(jié)果見表5。檢出DA的樣品有27個，檢出率為19.9%，檢出含量在5.2～406.4 μg/kg之間，未超過歐盟安全標準20 mg/kg。

表5 陽性樣品的DA含量

續(xù)表5

2.6.1 檢出DA的地理分布

福州、寧德和莆田DA的檢出率情況見圖4、圖5，3個海域的檢出率在14.7%～25.0%之間，檢出率相差不大。其中，福州市平潭縣、莆田市秀嶼區(qū)、城廂區(qū)和涵江區(qū)未檢出；福州市連江縣、寧德市福鼎市和莆田市北岸區(qū)檢出率較高，達到40%及以上；其他縣(市、區(qū))檢出率相差不大。

2.6.2 檢出DA的時間分布

采集的136個貝類樣品中，2020年5月采集的有26個，2021年4月有33個，2021年5月有36個，2021年6月有41個。2021年5月檢出率為11.1%，比上年同期減少10%。2021年4—6月檢出率呈逐漸遞增趨勢(0%～41.5%)，見圖6。

2.6.3 檢出DA的品種差異

采集的136個樣品中包括牡蠣、縊蟶、貽貝、花蛤、鮑、扇貝6種貝類。由圖7可知，DA主要在花蛤、牡蠣和貽貝中檢出，檢出率為13.6%～35.7%；縊蟶、鮑和扇貝中均未檢出DA。

3 討論

福建省僅2012年至2018年7月就發(fā)生赤潮56起[25]，赤潮的頻繁暴發(fā)，導(dǎo)致我省海域養(yǎng)殖貝類受到不同程度的污染，貝類毒素中毒事件屢次發(fā)生：如2011年6月寧德市福鼎、霞浦等地發(fā)生震驚全國的食用貽貝中毒事件，造成168人中毒；2014年6月至7月，福州羅源、漳州等地發(fā)生織紋螺中毒事件；2015年6月，福建莆田發(fā)生織紋螺中毒事件，致使2歲男童留下嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥等[26]；2017年漳州、泉州海域發(fā)生有毒鏈狀裸甲藻(Gymnodiniumcatenatum)赤潮，致使赤潮影響海域濾食性貝類麻痹性貝毒(Paralytic shellfish poison，PSP)超標，造成多地民眾因食用濾食性貝類而發(fā)生中毒事件[27]。在這種形勢下，對貝類毒素的分析研究越來越重要。

由于受儀器設(shè)備的限制，國家還未頒布使用HPLC-MS/MS法檢測貝類中失憶性貝類毒素的標準。本研究參照GB 5009.198—2016《食品安全國家標準 貝類中失憶性貝類毒素的測定》，并結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)，建立了檢測貝類體內(nèi)DA殘留的方法。通過對凈化條件的改進、色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，有效解決了樣品中雜質(zhì)對DA檢測的影響。DA在0.5～25.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.998，檢出限(LOD)為1.5 μg/kg，定量限(LOQ)為5 μg/kg。在5.0、12.5、50.0 μg/kg 3個濃度水平下的平均回收率為68.7%～92.4%，日內(nèi)相對標準偏差在5.4%～8.4%之間(n=6)，日間相對標準偏差在3.9%～5.1%之間(n=6)。LC-MS法DA檢出限為3 μg/kg，定量限為10 μg/kg[19]，而本文建立的HPLC-MS/MS方法比常規(guī)LC-MS法的進樣量低5倍，且靈敏度高2倍，能夠有效減少對儀器的污染，更好地凈化貝類樣品中的脂肪、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，消除基質(zhì)效應(yīng)，具有快速、高效、高靈敏度和高準確度等優(yōu)點。

運用建立的方法對福州、寧德、莆田3個重點海域的136個貝類樣品進行DA檢測。分析發(fā)現(xiàn)福建貝類中DA含量總體水平較低，但仍有少量檢出，主要在花蛤、牡蠣和貽貝中，含量在5.2～406.4 μg/kg之間，檢出率為13.6%～35.7%。有研究表明，通常情況下溫度升高會促使更多DA的產(chǎn)生。比如成列擬菱形藻(P.seriata)在4～15℃范圍內(nèi)、多列擬菱形藻(P.australis)在5～25℃范圍內(nèi)、澳洲擬菱形藻在23～30℃范圍內(nèi)，DA的產(chǎn)量會隨溫度的升高而有所增加[28]，這與本研究2021年4—6月檢出率呈逐漸遞增趨勢(0%～41.5%)檢測結(jié)果一致。從現(xiàn)有文獻報道來看，貝類中存在一定水平的毒素污染。吉薇等從11批次樣品中檢出9批次有DA積累，檢出率為81.8%，其中鈍齒短槳蟹中DA含量為18.2 mg/kg，已接近歐盟安全標準[29]。陳西平等在14個批次樣品中檢出7個樣品含有DA，含量在 0.4～8.1 mg/kg，檢出率達50%[30]。王恒對采集的13種貝類共39份樣品檢測，DA檢出率為64%[31]。因此要加強對貝類中DA的監(jiān)測，為我國統(tǒng)一DA安全標準的制定提供參考。

本方法檢測低限達到5 μg/kg，且線性關(guān)系良好，滿足歐盟規(guī)定的DA 20 mg/kg安全標準，適用于貝類中DA的日常檢測和監(jiān)控，為相關(guān)部門強化貝類質(zhì)量安全監(jiān)管、加強貝類風(fēng)險管控、推動貝類產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展提供參考依據(jù)。