梁 娟，張倩玉，魏海英，于盟盟，牟丹丹，王 磊

(日照市海洋與漁業(yè)研究院，山東 日照 276826)

孔雀石綠(Malachite green，MG)是一種人工合成的有機化合物，它既是染料，也是殺菌劑[1]，在治理魚卵中霉菌和殺滅魚體寄生蟲以及防治魚類水霉病、爛鰓病等方面效果顯著[2-3]，也曾被廣泛應(yīng)用于蝦卵、蟹卵中寄生蟲和真菌的治療與預(yù)防?？兹甘G進入生物體后，絕大部分通過生物轉(zhuǎn)化代謝為脂溶性隱色孔雀石綠(Leucomalachite green，LMG)并能夠穩(wěn)定地殘留在魚類等水產(chǎn)品的脂肪組織中[4]。經(jīng)研究證明，MG/LMG具有致癌、致畸和致突變等毒副作用[1-5]，已被大多數(shù)國家明令禁止在人類可食用的動物源性食品中使用?！吨腥A人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號》文件中規(guī)定，MG/LMG在所有食品動物中禁止檢出。但由于MG/LMG價格低廉、療效好，相關(guān)理想的替代藥品尚未出現(xiàn)，導(dǎo)致在水產(chǎn)育苗、養(yǎng)殖中其被非法使用的情況屢禁不止，因此通過對苗種中MG/LMG的檢測，可以從水產(chǎn)養(yǎng)殖源頭上監(jiān)控水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

目前，水產(chǎn)品中MG/LMG的檢測方法有GB/T 19857—2005、GB/T 20361—2006、SN/T 1768—2006、SC/T 3021—2004等標(biāo)準(zhǔn)方法，但截至目前，針對水產(chǎn)苗種中MG/LMG殘留量的檢測，國家相關(guān)部門尚未發(fā)布國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等標(biāo)準(zhǔn)方法。2007年10月9日，山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布地方標(biāo)準(zhǔn)DB37/T 713—2007《水產(chǎn)苗種魚藥殘留限量》，其中規(guī)定的方法是大型儀器分析方法——高效液相色譜法。大型儀器分析方法雖然靈敏度高、準(zhǔn)確性好，常作為MG/LMG殘留檢測的確認(rèn)方法，然而水產(chǎn)苗種的繁育周期短、季節(jié)性強，若抽檢樣品用大型精密儀器進行檢測，受限于檢測技術(shù)復(fù)雜、前處理過程耗時長、檢測結(jié)果滯后等原因，當(dāng)陽性樣品檢測結(jié)果上報給漁業(yè)主管部門時，苗種已被銷售。這種情況不但貽誤最佳執(zhí)法時機，而且容易使含有MG/LMG的陽性樣品流向養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，從源頭就出現(xiàn)水產(chǎn)品質(zhì)量安全隱患。因此，在實際檢測工作中，建立靈敏度高、特異性強、快速簡便的ELISA法具有重要意義，可以為漁業(yè)質(zhì)量安全主管部門的管理工作提供及時的技術(shù)支撐，提高執(zhí)法工作的時效性。

目前檢測水產(chǎn)苗種中MG/LMG殘留量的主要方法有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7-8]、高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)[9]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[10]、高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[4，11-12]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[3，13-15]、免疫膠體金法(GICT)[5]等。本文參照GB/T 19857—2005[16]《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》對美國柏爾生物技術(shù)公司提供的試劑盒使用方法進行優(yōu)化改進，以期建立對不同基質(zhì)水產(chǎn)苗種中MG/LMG殘留量進行定性、定量測定的ELISA分析方法，為基層檢測人員降低檢測結(jié)果的假陽性率和假陰性率以及提高其可靠性提供建議。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

MK3微孔板酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；微量移液器、多道微量移液器，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；PL202-L電子精密天平，梅特勒托利多儀器上海有限公司；TG16-WS2臺式高速離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；渦旋混合器，美國Talboys公司；KQ-5200DE超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；DC-24水浴氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司；10D經(jīng)濟型純水儀，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司；DNP-9002BS-III電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；BCD-215KS海爾電冰箱，青島海爾股份有限公司；-10～50℃、10%～90%RH溫濕度表，北京康威儀表有限責(zé)任公司；JYL-C022九陽料理機，九陽股份有限公司；96孔MG/LMG檢測試劑盒，美國柏爾生物技術(shù)公司；去離子水；分析純乙腈，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；分析純正己烷，天津科密歐試劑有限公司。

1.2 樣品

試驗所用樣品為國家北方蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系日照站、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)刺參產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系日照綜合試驗站和山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)魚類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系日照東港綜合試驗站等產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系試驗站提供的中國對蝦(Penaeuschinensis)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、刺參(Stichopusjaponicus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)等不同基質(zhì)苗種樣品，以及取自日照市轄區(qū)內(nèi)經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)、東港區(qū)、嵐山區(qū)等各區(qū)縣風(fēng)險監(jiān)測樣品。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

取100 μL 10×濃縮氧化劑(Oxidant solution)液加入到900 μL乙腈中，按9∶1比例稀釋為1×Oxidant Solution；將提取物A (Concentrate of extraction buffer A)固體濃縮袋用少量純水超聲振蕩至完全溶解，然后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用純水定容，配制成1×Extraction buffer A concentrate；取1 mL 10×濃縮樣品提取液B(Sample extraction buffer B)加入到9 mL純水中，按9∶1比例稀釋為1×Sample extraction buffer B；取10 mL 10×濃縮樣品提取液C(Sample extraction buffer C)加入到90 mL純水中，按9∶1比例稀釋為1×Sample extraction buffer C；將正己烷加入純水，超聲振蕩混合均勻，制備飽和正己烷；取10 mL 20×濃縮洗液(Wash solution)加入到190 mL純水中，按1∶19比例配制1×Wash solution；取100 μL 100×MG-生物素耦合物(MG-Biotin conjugate)加入到9.9 mL MG-生物素耦合物稀釋液(MG-Biotin conjugate Diluent)中，按1∶99比例配制成10 mL 1×MG-Biotin conjugate工作液；取100 μL 100×辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素(Streptavidin-HRP)加入到9.9 mL辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素稀釋液(Streptavidin-HRP diluent)中，按1∶99比例配制成10 mL 1×Streptavidin-HRP工作液。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，以上試劑，除1×Extraction buffer A concentrate可在室溫(22.5±2.5)℃下長期保存外，其余試劑均需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品處理

挑出樣品中餌料等雜質(zhì)，用去離子水清洗、瀝干，攪碎成糜狀，充分混合均勻；準(zhǔn)確稱取(2.00±0.01)g樣品置于25 mL聚丙烯離心管中，依次加入1 mL 1×Concentrate of extraction buffer A、0.4 mL 1×Sample extraction buffer B和6 mL乙腈，超聲振蕩20 min，在室溫(22.5±2.5)℃ 條件下4 000 r/min離心10 min；取10 mL聚丙烯離心管，并在管中加入300 mg(±40 mg)純化試劑(MG clean up mix)；移取2 mL乙腈上清液置于該離心管中，以最大轉(zhuǎn)速渦旋振蕩1 min后，在室溫(22.5±2.5)℃條件下靜置10 min；(22.5±2.5)℃、4 000 r/min離心10 min；移取1 mL上清液置于另一個10 mL聚丙烯離心管中，50～60℃水浴氮氣吹干。加入100 μL 1×Oxidant solution，最大轉(zhuǎn)速渦旋振蕩1 min；(22.5±2.5)℃、4 000 r/min離心1 min，靜置15 min；依次加入400 μL 1×Sample extraction buffer C和650 μL飽和正己烷，最大轉(zhuǎn)速渦旋振蕩1 min，(22.5±2.5)℃、4 000 r/min離心5 min；去除上層正己烷，下層溶液供酶標(biāo)板進行檢測。

1.3.3 酶聯(lián)免疫反應(yīng)

移取標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品上機液90 μL，置于對應(yīng)的酶標(biāo)板孔中；再按以上順序加入30 μL 1×MG-Biotin conjugate，輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，在室溫(22.5±2.5)℃條件下孵育30 min；小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，每孔加入洗滌液250 μL，輕輕振蕩混勻1 min，將孔內(nèi)液體甩干，重復(fù)洗板步驟3次，每次間隔10 s，在吸水紙上倒扣、排干，排干后若有氣泡，先用洗耳球吹破，再拍干；每孔加入100 μL 1×Streptavidin-HRP，輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，在室溫(22.5±2.5)℃條件下孵育15 min；再按照上述方法洗板3次；每孔加入100 μL底物(TMB substrate)，輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，在室溫(22.5±2.5)℃條件下孵育15～20 min；每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)，輕輕振蕩混勻1 min，供上機測定(在上機前30～40 min打開酶標(biāo)儀，以使儀器狀態(tài)穩(wěn)定，并將測試波長設(shè)定為450 nm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲振蕩試驗

選取中國對蝦、三疣梭子蟹、刺參、牙鲆4種不同基質(zhì)的MG/LMG陰性樣品，每種基質(zhì)樣品分別稱取相同10份，均添加為1.00 μg·kg-1加標(biāo)水平，每2份為一組，設(shè)5個平行組，在固定超聲頻率為40 kHz的試驗條件下，分別超聲振蕩10、15、20、25、30 min，以考察超聲振蕩時間對MG/LMG檢出水平和樣品乳化現(xiàn)象的影響(表1)。試驗結(jié)果顯示，在10～20 min范圍內(nèi)，MG/LMG檢出水平隨著時間的延長而提高，樣品提取液狀態(tài)良好，未出現(xiàn)混濁和乳化現(xiàn)象；20 min之后，樣品提取液開始出現(xiàn)混濁和乳化現(xiàn)象，且MG/LMG檢出水平降低，這可能是多次使用正己烷去乳化層引起MG/LMG損失所致。由此可見，超聲振蕩適用于MG/LMG的提取，且最佳時間為20 min。

表1 超聲振蕩時間對樣品檢出水平和乳化現(xiàn)象的影響

2.2 靜置時間驗證

樣品加入乙腈超聲振蕩后，過快收集容易同時收集含有少量水滴的乙腈[11]，使氮吹操作困難，濃縮時間增加；靜置時間過長，易產(chǎn)生乳化、乳化層含水量高等不利后續(xù)試驗進行的情況[15]。本文對65份不同基質(zhì)樣品進行陽性篩選，以驗證靜置時間對后續(xù)試驗的影響：相對于靜置10 min，靜置5 min氮吹時間延長；靜置15 min氮吹時間與其相差不大，但有些樣品開始出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可能是樣品中溶于乙腈的雜質(zhì)析出所致。由驗證結(jié)果可知，本方法的最佳靜置分層時間為10 min。

2.3 線性范圍與檢出限

本文采用0、0.050 0、0.150、0.500、1.50、4.50 ng·mL-16個濃度梯度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 0，樣品稀釋倍數(shù)為1.5倍，故將0.075 μg·kg-1定為本方法的最低檢出限。與國家標(biāo)準(zhǔn)推薦的HPLC法[17]和LC-MS/MS法[16]相比，ELISA法檢出限較低、靈敏度較高(表2)，在0.050 0～4.50 ng·mL-1水平范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(表3)，可以對樣本中MG/LMG的殘留定量測定。由此可知，采用ELISA法作為MG/LMG監(jiān)控技術(shù)手段具有可行性。

表2 ELISA法和大型儀器分析法的檢出限與定量限

表3 ELISA法和大型儀器分析法的線性范圍

2.4 加標(biāo)回收率與精密度(RSD)

同大型儀器分析法的自動進樣方式不同，ELISA法是手動進樣。正確把握可調(diào)試移液器“吸二打一”的操作手法[18]是減少偶然誤差、增加微量進樣穩(wěn)定性和確保RSD的有效方法。對于食品中禁用藥物，回收率應(yīng)在方法檢測下限、兩倍方法檢測下限和十倍方法檢測下限進行加標(biāo)回收率試驗[19]。不同種類的樣品之間性質(zhì)差異很大，會導(dǎo)致不同的基質(zhì)效應(yīng)，而基質(zhì)效應(yīng)對反應(yīng)的干擾是影響ELISA法檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。樣品中的雜蛋白、脂肪、色素等物質(zhì)會影響抗體與抗原的結(jié)合，降低方法靈敏度與穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陽性或假陰性。本方法選取4種不同基質(zhì)的MG/LMG陰性樣品，分別做0.075、0.150、0.750 μg·kg-13個加標(biāo)水平的檢測，每個加標(biāo)水平設(shè)6組重復(fù)，3個加標(biāo)水平回收率均在79.7%～104.5%之間，RSD測定范圍為3.3%～7.9%(表4)。相對刺參苗種，三疣梭子蟹、牙鲆、中國對蝦等苗種可能分別由于蟹殼、魚骨、蝦殼等不可食部分的影響，使樣品空白的檢出水平偏高，導(dǎo)致3個加標(biāo)水平的平均回收率均較低，但4種不同基質(zhì)樣品的回收率和RSD均符合漁業(yè)主管部門的質(zhì)量控制規(guī)定。由此可見，本文所建立的方法具有良好的準(zhǔn)確度和RSD，適用于不同基質(zhì)水產(chǎn)苗種中MG/LMG殘留量的測定。

表4 不同基質(zhì)、不同加標(biāo)水平回收率和RSD(n=6)

2.5 正己烷試驗

為證明飽和正己烷的提取效果，分別用正己烷試劑與飽和正己烷做除脂凈化試驗，中國對蝦、三疣梭子蟹、刺參、牙鲆等苗種各稱取6份，均添加1.00 μg·kg-1加標(biāo)水平，方式設(shè)3組重復(fù)，分別計算平均檢出水平。結(jié)果顯示，對于同一苗種，用飽和正己烷去脂的樣品檢出濃度較高(表5)，因此用純水對正己烷試劑進行飽和具有必要性。

表5 正己烷試劑與飽和正己烷去脂MG/LMG檢出水平比對

3 討論

3.1 提取劑的選擇

分析水產(chǎn)品中MG/LMG常用的提取溶劑為乙腈、甲醇、乙醇、戊醇，白志榮等[10]、宋凱等[13]均發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇、戊醇等醇類與水的互溶性較強，會將水產(chǎn)品中部分水溶性蛋白提取出來，帶來更多雜質(zhì)，使提取溶液渾濁，不利于后續(xù)凈化；GB/T 19857—2005[16]《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》規(guī)定提取劑為乙腈；宮向紅等[7]研究表明乙腈有利于沉淀蛋白，有一定的凈化作用。故本方法選取乙腈為提取溶劑。

3.2 渦旋振蕩的優(yōu)化改進

胡萍等[8]發(fā)現(xiàn)采用超聲波振蕩提取相比渦旋混合器與傳統(tǒng)的搖床，更能均質(zhì)充分與提取完全，可提高反應(yīng)體系對MG/LMG的結(jié)合，同時還有樣品反應(yīng)同步、準(zhǔn)確度提高等優(yōu)點。但是，超聲提取時間過短容易混合不勻、提取不充分，造成假陰性；隨著超聲提取時間的延長，樣品中MG/LMG的提取效率有所增加[20]，同時也會溶解出更多的雜質(zhì)成分造成乳化現(xiàn)象。因此，把握好超聲振蕩時間是操作的關(guān)鍵。在實際檢測工作中，一般將20個樣品作為同一批次進行檢測，每個樣品需要渦旋振蕩提取4 min，共需80 min。本方法依據(jù)GB/T 19857—2005優(yōu)化為超聲振蕩提取，該種方式20 min即可完成，使提取時間縮短、工作效率提高，故本方法將渦旋振蕩提取優(yōu)化為超聲振蕩提取。

3.3 靜置時間對樣品濃縮的影響

水產(chǎn)育苗用水中藻類較多、水質(zhì)黏性大，苗種體表清洗不徹底以及MG/LMG具有很強的親脂性[14]等原因，導(dǎo)致樣品加入1×Concentrate of extraction buffer A和1×Sample extraction buffer B振蕩混合時容易形成共軛現(xiàn)象，靜置時乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，分層不明顯，不利于MG/LMG的提取。用乙腈作為提取劑，可以減輕乳化現(xiàn)象。對于如何達到更好的防乳化效果，關(guān)鍵應(yīng)把握好乙腈加入之后的最佳靜置分層時間。

3.4 記號筆的優(yōu)化改進

MG/LMG是常用的三苯甲烷類工業(yè)染料，被廣泛應(yīng)用于紡織印染、油墨、涂料中，大部分黑色記號筆油墨中含有MG/LMG[14]。在檢測過程中用該顏色記號筆進行標(biāo)記，會因油墨中MG/LMG的遷移和滲透特性，使樣品呈現(xiàn)假陽性。本文對65份不同基質(zhì)樣品進行陽性篩選，篩選過程中離心管用黑色記號筆進行標(biāo)記，其中有6份樣品結(jié)果呈現(xiàn)假陽性，假陽率達到9.2%。針對篩選出的假陽性樣品，改用紅色記號筆對離心管進行標(biāo)記，用本文建立的ELISA法進行檢測，結(jié)果為陰性，后續(xù)又用LC-MS/MS法對其結(jié)果進行確證，結(jié)果均為陰性。綜上所述，選用紅色記號筆對離心管進行標(biāo)記，可以最大限度地排除黑色記號筆中油墨的干擾，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

3.5 正己烷的優(yōu)化改進

農(nóng)業(yè)部1192號公告-1-2009《水產(chǎn)苗種違禁藥物抽檢技術(shù)規(guī)范》[21]規(guī)定，苗種樣品的制備應(yīng)整尾/只絞碎混合均勻。動物源食品中肝臟基質(zhì)復(fù)雜、脂肪含量高，再加上雜蛋白、色素等雜質(zhì)的干擾，提取液極易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。當(dāng)乳化現(xiàn)象嚴(yán)重到一次不能徹底去除時，需要增加正己烷的去脂次數(shù)。但多次去脂會造成MG的損失，使得樣品檢出水平降低，容易導(dǎo)致樣品的假陰性。本方法將正己烷優(yōu)化為純水飽和正己烷，可以在有效去除乳化層的基礎(chǔ)上，減少MG的損失，確保方法的靈敏度和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本文采取了超聲振蕩提取、飽和正己烷去乳化層以及用紅色記號筆對離心管標(biāo)記等優(yōu)化措施，建立了對不同基質(zhì)水產(chǎn)苗種中MG/LMG殘留量進行定性、定量測定的ELISA分析方法。通過檢測實際樣品進行驗證，4種不同基質(zhì)樣品(中國對蝦、三疣梭子蟹、刺參、牙鲆等苗種)中MG含量在0.050 0～4.50 ng·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 0，方法檢出限為0.075 0 μg·kg-1。在0.075 0、0.150、0.750 μg·kg-1的加標(biāo)水平下，平均回收率為79.7%～104.5%，RSD為3.3%～7.9%，由此可知優(yōu)化措施具有可行性。與大型儀器分析方法相比，ELISA法還具備分析成本低、操作步驟簡單、有機試劑使用量少、對人體傷害和環(huán)境污染危險性小等優(yōu)點，是目前水產(chǎn)苗種中較為理想的應(yīng)急篩查和常規(guī)檢測方法[22]。通過多年實際檢測結(jié)果可知，用本方法檢出的陽性樣品，后續(xù)再用GC-MS/MS法進行對其確證，檢測結(jié)果二者一致。因此，本方法可用于實際樣品的檢測，能夠較好地滿足水產(chǎn)苗種質(zhì)量安全監(jiān)管部門的需要。