劉麗莎 鐘燕霄 田 晴 劉 敏 潘 勤 章曉聯(lián) 羅鳳玲

(武漢大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系， 湖北 武漢 430071)

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起的慢性傳染病，是單一傳染源的頭號(hào)死亡原因[1]。世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，2021年全球結(jié)核潛伏感染人群接近20億，新發(fā)病例987萬(wàn)[1]。近年來(lái)耐藥結(jié)核病以及人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)和M.tb共感染患者的增多，給我國(guó)結(jié)核病防治工作帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)[2]。同時(shí)，卡介苗(bacillus Calmette-Guérin, BCG)作為當(dāng)前廣泛使用的抗結(jié)核疫苗，保護(hù)效力存在不足[3]。因此，進(jìn)一步探索M.tb逃逸免疫殺傷的機(jī)制對(duì)于結(jié)核病的研究、診斷和治療具有重要意義。

1998年，英國(guó)Sanger中心和法國(guó)Pasteur研究所聯(lián)合報(bào)告了M.tbH37Rv全基因組序列圖[4]。通過(guò)全基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與M.tbH37Rv或牛分枝桿菌相比，BCG基因組有一部分缺失片段，被稱為M.tb的差異區(qū)域(region of difference, RD)，通稱為RD區(qū)。RD區(qū)共有16個(gè)區(qū)域，可編碼129種蛋白質(zhì)，與M.tb的毒力密切相關(guān)[5]。目前對(duì)RD-1區(qū)的研究較多，RD-1區(qū)蛋白參與了M.tb感染后宿主細(xì)胞膜的破壞、免疫逃逸等諸多過(guò)程[6]。因此，研究RD區(qū)蛋白在結(jié)核病免疫中的作用具有重要意義。

研究表明，在M.tb感染的過(guò)程中，Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而破壞機(jī)體對(duì)M.tb的免疫反應(yīng)，有利于M.tb在細(xì)胞內(nèi)的存活[7]。M.tb的強(qiáng)毒力會(huì)使白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)依賴型Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)降低，從而誘導(dǎo)更高水平的Ⅰ型IFN[8-9]。M.tb的毒力主要是由毒力因子ESAT-6分泌系統(tǒng)1(ESAT-6 secretion system 1, ESX-1)相關(guān)蛋白決定[10]。ESX-1基因簇位于RD-1區(qū)，參與M.tb宿主逃逸，對(duì)M.tb至關(guān)重要。EspJ是由Rv3878編碼的蛋白，屬于ESX-1分泌相關(guān)蛋白，目前EspJ在M.tb感染過(guò)程中的具體功能尚不清楚。

本研究擬通過(guò)Rv3878基因原核表達(dá)載體，構(gòu)建表達(dá)EspJ的重組恥垢分枝桿菌(MycolicibacteriumSmegmatis,M.s)及重組BCG，探究Rv3878基因編碼的EspJ蛋白在結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞中的作用，以期進(jìn)一步闡明EspJ的生物學(xué)功能，為結(jié)核病診治及新型疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

M.tb標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv [strain ATCC(美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)) 25618]和M.s菌株[strain ATCC 70084]由武漢大學(xué)ABSL-Ⅲ實(shí)驗(yàn)室提供，并由本實(shí)驗(yàn)室凍存。BCG、大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5α(strain ATCC 25922)、E.coliBL-21(strain ATCC BAA-1025)由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。pMV261、pMV361及pGEX-KG質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞和動(dòng)物

RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。BALB/c小鼠，6～8周齡，雌性，購(gòu)自湖北省疾控中心。本研究已通過(guò)我校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：18021B)。

1.3 主要試劑

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)

Middlebrook 7H9、Middlebrook 7H11及Middlebrook OADC購(gòu)自BD公司；基因組提取試劑盒與溶菌酶購(gòu)自TIANGEN公司；Proteinase K購(gòu)自Roche公司。

1.3.2 PCR、RT-qPCR及酶切鑒定

質(zhì)粒提取和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購(gòu)自Vazyme公司；EcoRⅠ、Hind Ⅲ購(gòu)自Promega公司；DNA Ligation High Kit購(gòu)自TOYOBO公司。PCR和RT-qPCR引物、DNA marker均在武漢擎科生物技術(shù)有限公司訂購(gòu)。

1.3.3 蛋白提取及多克隆抗體制備

異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；GST-Sephagarose 4B購(gòu)自GE公司。弗氏佐劑購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；ELISA包被液、TMB顯色液購(gòu)自Biolegend公司。

1.3.4 蛋白刺激細(xì)胞

培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Natocor公司；polymyxin B購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子購(gòu)自PeproTech公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green均購(gòu)自TOYOBO公司；TritonX100購(gòu)自Amresco公司；Mouse IFN-β ΕLISA Kit購(gòu)自武漢華聯(lián)科公司。

1.3.5 Western Blot

十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、過(guò)硫酸銨、吐溫-20及無(wú)水甲醇購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚丙烯酰胺購(gòu)自Biosharp公司；TEMED購(gòu)自谷歌生物公司；Tris Base、甘氨酸購(gòu)自Amresco公司；Marker購(gòu)自Bio-Rad公司；羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自ABclonal公司；β-actin單抗購(gòu)自Affinity Bioscience公司；ECL顯色底物購(gòu)自雅酶公司。

1.4 方法

1.4.1 PCR

1.4.2 原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

Rv3878 PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pGEX-KG分別經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后，用DNA連接酶連接得到pGEX-KG-Rv3878，轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落培養(yǎng)。提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并送武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行DNA基因測(cè)序。

1.4.3 重組蛋白的誘導(dǎo)提取及純化

將pGEX-KG-Rv3878轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落接種于液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素)，37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液吸光度值達(dá)0.6～0.8，加入IPTG，25℃、150 r/min培養(yǎng)16 h，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。碎菌后經(jīng)高速離心，留取上清和沉淀，并將轉(zhuǎn)化pGEX-KG的E.coliBL21和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌作為對(duì)照。上清中加GST-Sephagarose beads于4℃混勻儀孵育2 h。收集柱子后用PBS洗3遍，用Tris-HCL-還原型谷胱甘肽-Elution buffer于混勻儀4℃，30 min洗脫，得到GST-EspJ并進(jìn)行鑒定。

1.4.4 小鼠多克隆抗體的制備

取4只6～8周齡雌性BalB/c小鼠，剪尾取100～200 μL血清作為免疫前血清對(duì)照。針對(duì)每只小鼠，取同體積的100～200 μg蛋白與弗氏完全佐劑混合乳化，通過(guò)腹腔注射免疫小鼠。每隔7～10天，取同體積的50～100 μg蛋白與不完全佐劑混合超聲乳化后腹腔注射免疫，共免疫4～5次。眼球取血后可獲得多克隆抗體血清，置于-20℃保存。

1.4.5 ELISA

每孔加100 μL混合的1～2 μg EspJ與ELISA包被液，4℃過(guò)夜。PBST洗3次，拍干后每孔加250 μL 2% BSA 置于37℃孵育1 h。PBST洗3次，每孔加200 μL倍比稀釋的多抗血清(1∶200～1∶409 600)作為一抗，保留一孔作為空白對(duì)照，置于37℃孵育1 h。PBST洗5次，每孔加200 μL IgG-HRP，置于37℃孵育1 h。PBST洗5次，每孔加顯色液A、B液各50 μL，避光置于37℃孵育10～15 min，每孔加50 μL硫酸終止。測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(optical density，OD450)，計(jì)算效價(jià)。

1.4.6 重組蛋白GST-EspJ刺激小鼠巨噬細(xì)胞

將RAW264.7細(xì)胞和小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)接種于六孔板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%～80%，加入5 μg/mL和10 μg/mL已去除內(nèi)毒素的GST和GST-EspJ，分別刺激1 h、3 h、6 h、12 h。收取細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)INF-β mRNA表達(dá)水平，ELISA和Western blot檢測(cè)IFN-β的含量及變化。

1.4.7 Western blot

將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜放入5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1 h，用TBS-吐溫20 [0.5%] (TBST)洗滌，加入一抗抗體溶液，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗3次，加入羊抗鼠或兔IgG-HRP，室溫孵育1 h。TBST洗3次，滴加顯色液后在ECL化學(xué)發(fā)光儀中顯色。

1.4.8 RT-qPCR

提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到互補(bǔ)DNA (complementary DNA, cDNA)，于-20℃儲(chǔ)存。RT-qPCR引物序列：鼠IFN-β引物序列為5’-ATGAGTGGTGGTTG-CAGGC-3’(F)和5’-TGACCTTTCAAATGCAGTAGATT-3’(R)；鼠GAPDH引物序列為5’-CATCACTGCCACCCAGAAGACT G-3’(F)和5’-ATGCCAGTGAG-CTTCCCGTTCAG-3’(R)；鼠IL-10引物序列為5’-AGTGGAGCAGGTGAAG-AGTG-3’(F)和5’-TTCGGAGA GAGGTACAAACG-3’(R)；鼠IL-1β引物序列為5’-CCCAACTGGTACATCAGCAC-3’(F)和5’-TCTGCTCATTCACGAAA-AGG-3’(R)。RT-qPCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×SYBR GREEN 10 μL，引物(F+R)1 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 1 μL。RT-qPCR程序：Holding stage：95℃ 1 min，cycle stage: 95℃ 15 s，退火58℃ 20 s，延伸72℃ 20 s并收集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。

1.4.9 重組恥垢分枝桿菌(rM.s::Rv3878)和重組BCG(rBCG::Rv3878)的構(gòu)建

將Rv3878構(gòu)建至pMV261和pMV361穿梭載體。在M.s感受態(tài)細(xì)胞中分別電轉(zhuǎn)化1～5 μg pMV261-Rv3878和pMV261，在BCG感受態(tài)細(xì)胞中分別電轉(zhuǎn)化2～5 μg pMV361-Rv3878和pMV361。用卡那霉素抗性的固體培養(yǎng)基分別篩選3天和4周，選擇單菌落作為rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878，并進(jìn)行PCR及Western Blot鑒定。

1.4.10 重組菌株刺激小鼠巨噬細(xì)胞

將RAW264.7和BMDM細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%～80%，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的M.s、rM.s::Rv3878、BCG、rBCG::Rv3878(MOI=10∶1)感染細(xì)胞1 h后洗去，加入培養(yǎng)基分別培養(yǎng)至3 h、6 h、12 h后收取細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)IFN-β、IL-1β、IL-10 mRNA表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，通過(guò)SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用means ± SEM表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rv3878的原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

提取M.tbH37Rv全基因組，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到Rv3878基因(圖1A)。將Rv3878構(gòu)建至原核表達(dá)載體pGEX-KG，經(jīng)轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定(圖1B)及DNA基因測(cè)序。酶切結(jié)果表明，單克隆1、3號(hào)構(gòu)建成功。DNA基因測(cè)序結(jié)果顯示其與Rv3878基因序列相符。原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-Rv3878構(gòu)建成功。

注： A：Rv3878的PCR擴(kuò)增；B：pGEX-KG-Rv3878的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定。M：DL2000 DNA marker圖1 Rv3878的原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

2.2 重組蛋白GST-EspJ的表達(dá)及純化

將pGEX-KG-Rv3878轉(zhuǎn)化到E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落培養(yǎng)，加IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)效果在25℃時(shí)最佳。誘導(dǎo)蛋白表達(dá)12 h后，提取純化重組蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分析鑒定(圖2)。結(jié)果顯示在54 kD處有明顯條帶，表明成功獲得GST-EspJ，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 GST-EspJ的表達(dá)及純化

2.3 抗EspJ蛋白鼠多克隆抗體的制備及效價(jià)檢測(cè)

用GST-EspJ免疫雌性BALB/c小鼠后收取血清，ELISA測(cè)定多克隆抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，經(jīng)GST-EspJ免疫的小鼠能產(chǎn)生針對(duì)EspJ的特異性抗體。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了稀釋濃度，取血清倍比稀釋后檢測(cè)血清OD450。結(jié)果顯示，隨著稀釋倍數(shù)的增加，其OD450隨之下降。免疫后血清OD450/免疫前血清OD450≥2.1時(shí)的稀釋濃度即為效價(jià)，經(jīng)計(jì)算效價(jià)為1∶204 800(圖3)。

圖3 抗EspJ蛋白鼠多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)

2.4 抗EspJ蛋白鼠血清多克隆抗體特異性驗(yàn)證

以GST-EspJ為抗原，多克隆抗體血清為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，Western Blot檢測(cè)多克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示，在54 kD處有特異性條帶，表明該抗體可特異性識(shí)別EspJ(圖4)。

注：M：marker；1～4：分別為1～4號(hào)GST-EspJ蛋白免疫小鼠多克隆抗體圖4 Western blot驗(yàn)證抗EspJ蛋白鼠多克隆抗體的特異性

2.5 GST-EspJ蛋白對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞Ⅰ型干擾素的影響

用不同劑量的GST-EspJ刺激RAW264.7細(xì)胞，以及相同劑量GST-EspJ刺激巨噬細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)，RT-qPCR檢測(cè)IFN-β mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，GST-EspJ處理后小鼠巨噬細(xì)胞中INF-β mRNA表達(dá)水平明顯升高，在6 h達(dá)到峰值，且隨著蛋白刺激濃度的增加而升高(圖5A和5B)。隨后以10 μg/mL GST-EspJ刺激RAW264.7細(xì)胞，ELISA和Western blot檢測(cè)細(xì)胞IFN-β的含量變化，發(fā)現(xiàn)INF-β表達(dá)水平顯著升高，在12 h達(dá)到峰值(圖5C和5D)。以上結(jié)果證明EspJ蛋白可以促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞中Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。

注：A和B分別為5 μg/mL和10 μg/mL GST及GST-EspJ刺激RAW264.7細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)IFN-β mRNA表達(dá)水平；C和D為10 μg/mL GST及GST-EspJ刺激RAW264.7細(xì)胞，ELISA和Western blot檢測(cè)細(xì)胞裂解液中IFN-β的含量及表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖5 GST-EspJ蛋白促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素

2.6 成功構(gòu)建表達(dá)Rv3878基因的rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878

將Rv3878基因構(gòu)建至pMV261、pMV361穿梭載體，酶切鑒定結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖6A和6B)。將重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至M.s和BCG中，獲得rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878，并進(jìn)行PCR鑒定(圖6C和6D)及Western Blot鑒定(圖6E)。結(jié)果顯示，菌液PCR產(chǎn)物與Rv3878基因長(zhǎng)度相同，rBCG::Rv3878菌株包含Rv3878，并且可表達(dá)EspJ。以上結(jié)果表明rM.s::Rv3878、rBCG::Rv3878構(gòu)建成功。

注：A：pMV261-Rv3878的酶切鑒定； B：pMV361-Rv3878的酶切鑒定； C：rM.s::Rv3878的PCR鑒定； D：rBCG::Rv3878的PCR鑒定； E：rBCG::Rv3878蛋白表達(dá)驗(yàn)證圖6 表達(dá)M.tb Rv3878基因的rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878構(gòu)建和鑒定

2.7 rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878感染巨噬細(xì)胞后可促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的rMs::Rv3878和rBCG::Rv3878感染RAW264.7和BMDM細(xì)胞3 h、6 h和12 h(MOI=10∶1)，同時(shí)以空載菌株作為陰性對(duì)照，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞IFN-β、IL-1β、IL-10等細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，rMs::Rv3878和rBCG::Rv3878可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞中IFN-β的產(chǎn)生(圖7A和7B)。此外，rBCG::Rv3878感染BMDM細(xì)胞后還可促進(jìn)IL-1β和IL-10的表達(dá)(圖7C和7D)。

注：A：rM.s::Rv3878以MOI=10∶1感染RAW264.7細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)IFN-β mRNA表達(dá)水平；B～D：rBCG::Rv3878以MOI=10∶1感染BMDM細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)IFN-β、IL-1β、IL-10 mRNA表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1圖7 rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878感染巨噬細(xì)胞對(duì)Ⅰ型干擾素的影響

3 討論

結(jié)核病是一種慢性傳染病，可分為活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核病，約5%～10%的潛伏感染個(gè)體發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病[1]。在中國(guó)，結(jié)核病仍然是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅。結(jié)核病的早期診斷以及有效的疫苗研發(fā)對(duì)于結(jié)核病防控至關(guān)重要。因此，需要進(jìn)一步研究M.tb感染及免疫逃逸的機(jī)制，尋找新的生物標(biāo)志物和藥物及疫苗新靶點(diǎn)。

RD區(qū)與M.tb的毒力密切相關(guān)，有多個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)抗原，一直是M.tb感染機(jī)制研究及新疫苗研發(fā)熱點(diǎn)。關(guān)于RD-1區(qū)的研究較多，RD-1區(qū)全長(zhǎng)9.5 kb，包含9個(gè)閱讀框，即Rv3871～Rv3879c。RD-1區(qū)是M.tb的主要毒力因子，參與了M.tb感染、免疫逃逸等致病過(guò)程[11]。如培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein-10，CFP-10)和ESAT-6是兩種免疫優(yōu)勢(shì)RD-1區(qū)蛋白，可形成毒力決定簇激活免疫應(yīng)答，參與結(jié)核病發(fā)病過(guò)程[12]。ESAT6分子量低且免疫原性高，在結(jié)核病診斷和亞單位疫苗開(kāi)發(fā)方面有重要價(jià)值[13]?，F(xiàn)已有研究嘗試將部分RD-1區(qū)基因?qū)隑CG構(gòu)建重組菌株，可增強(qiáng)疫苗保護(hù)性[14]。PE35 (Rv3872)、PPE68 (Rv3873)蛋白可使巨噬細(xì)胞IL-10增加及IL-12降低，參與M.tb的免疫逃逸過(guò)程[15]；二者相互作用時(shí)結(jié)構(gòu)由無(wú)序向有序轉(zhuǎn)變，使M.tb毒力增強(qiáng)[16]。高毒力M.tb感染巨噬細(xì)胞時(shí)會(huì)誘導(dǎo)高水平Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。在M.tb感染中，高濃度的Ⅰ型IFN會(huì)通過(guò)促進(jìn)免疫抑制分子的產(chǎn)生和降低巨噬細(xì)胞對(duì)IFN-γ激活的反應(yīng)等，使細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)存活，加重對(duì)宿主的損害[17]。Rv3878是RD-1區(qū)的基因，其編碼的EspJ屬于EXS-1相關(guān)蛋白，因此推測(cè)EspJ可誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。

我們構(gòu)建了Rv3878原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)提純得到GST-EspJ，用GST-EspJ刺激小鼠巨噬細(xì)胞后檢測(cè)到細(xì)胞Ⅰ型IFN表達(dá)水平明顯升高。之后構(gòu)建了rMs::Rv3878和rBCG::Rv3878，感染小鼠巨噬細(xì)胞后同樣發(fā)現(xiàn)Ⅰ型IFN表達(dá)增強(qiáng)。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)EspJ可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，推測(cè)其參與了M.tb感染及免疫逃逸的過(guò)程。目前對(duì)EspJ在M.tb感染過(guò)程中擔(dān)當(dāng)?shù)慕巧胁磺宄?，接下?lái)還需對(duì)EspJ促進(jìn)巨噬細(xì)胞Ⅰ型IFN產(chǎn)生的具體機(jī)制做進(jìn)一步的探究。

目前臨床檢測(cè)M.tb的免疫學(xué)方法主要有結(jié)核素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)和IFN-γ釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRA)，我國(guó)應(yīng)用最普遍的是IGRA中的T-SPOT。這些診斷方法的敏感性和特異性仍存在不足，無(wú)法有效識(shí)別可能發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的高危患者，而且在評(píng)價(jià)抗結(jié)核治療中的作用有限。因此，結(jié)核病診斷需要RD區(qū)蛋白抗原聯(lián)合應(yīng)用。已有研究證明，T細(xì)胞對(duì)Rv3878的反應(yīng)可預(yù)測(cè)患者進(jìn)展為活動(dòng)性肺結(jié)核的可能性，也可作為結(jié)核病進(jìn)展的預(yù)后標(biāo)志物。T細(xì)胞對(duì)Rv3873和Rv3879c的反應(yīng)也有疾病診斷和預(yù)后評(píng)估的作用[18]。ESAT-6、CFP-10與Rv3878等聯(lián)合診斷顯示出了比T-SPOT更高的靈敏度和特異度[19]。RD區(qū)蛋白抗原在作為臨床診斷試劑或亞單位疫苗方面顯示出巨大潛力。

綜上所述，我們證實(shí)了由Rv3878編碼的EspJ蛋白可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，有利于M.tb在細(xì)胞內(nèi)的存活，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。Rv3878是M.tb的毒力相關(guān)基因之一，RD區(qū)蛋白抗原聯(lián)合應(yīng)用是結(jié)核病新型診斷方法和疫苗研發(fā)的熱點(diǎn)。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步深入探討Rv3878的功能，為結(jié)核病的診斷和預(yù)防提供新的方向和靶點(diǎn)。