廖沁，曾來生，陳楊，劉星，蔣鑫萍，楊淙茗，謝雨，曾山，謝家和，

（1.贛南醫(yī)學(xué)院，贛州 341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心江西分中心，贛州 341000）

人類腸道微生物區(qū)系包含數(shù)千種不同的細(xì)菌分類群，以及各種古生菌、真核微生物和病毒，總計(jì)300 多萬個(gè)基因， 并蘊(yùn)藏著巨大的新陳代謝能力[1]。 胃腸道中的微生物在營養(yǎng)吸收、維生素合成、能量獲取、 炎癥調(diào)節(jié)和宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[2-3]。 反過來，許多內(nèi)在和外在因素可以影響腸道微生物，比如妊娠[4]、年齡[5]、飲食[6-7]等因素。 另外腸道—腦軸[8]、腸道—肌軸[8]和腸道—肝軸[9]的發(fā)現(xiàn)，表明腸道微生物和宿主外周組織之間存在雙向通信。

眾所周知，運(yùn)動(dòng)對心肺健康、肌肉力量、葡萄糖代謝、免疫系統(tǒng)和心理健康都有積極的影響[10]。 研究表明， 運(yùn)動(dòng)和腸道微生物區(qū)系組成之間存在聯(lián)系[11]。越來越多的研究揭示了微生物區(qū)系對運(yùn)動(dòng)成績、康復(fù)和疾病模式的各種指數(shù)有間接影響，例如通過肌動(dòng)因子和其他細(xì)胞因子發(fā)出信號， 調(diào)節(jié)下丘腦—垂體—腎上腺軸的激活， 以及影響與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的代謝途徑[12-14]。 研究還表明了運(yùn)動(dòng)個(gè)體腸道微生物區(qū)系組成的特殊特征[13]以及運(yùn)動(dòng)對久坐人群腸道微生物區(qū)系組成的影響[14]。研究還明確了運(yùn)動(dòng)對不同年齡不同性別個(gè)體的腸道微生物區(qū)系的有益影響[15-17]。

然而， 這些結(jié)果只能證實(shí)運(yùn)動(dòng)和微生物種群之間的關(guān)聯(lián)， 并不能確定運(yùn)動(dòng)和腸道菌群改變的因果關(guān)系。 此外研究大多集中在運(yùn)動(dòng)員和社會人群，由于性別、年齡、運(yùn)動(dòng)模式和強(qiáng)度等因素的差異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的爭議性。 在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)影響腸道菌群[18]，但是鮮有研究報(bào)道游泳運(yùn)動(dòng)對小鼠腸道菌群的改變。 本實(shí)驗(yàn)將探究游泳運(yùn)動(dòng)對小鼠腸道菌群的影響， 進(jìn)而從腸道菌群的角度對運(yùn)動(dòng)給人體帶來的改變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康8 周齡的雄性C57BL/6 雄鼠，體重（27.72±0.91）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司浙江倉， 動(dòng)物許可證號：SCXK （浙）2019-0001。 小鼠按12 h∶12 h 人工明暗周期，早上六點(diǎn)開燈，動(dòng)物房溫度（24±1）℃，4 只/籠飼養(yǎng)在贛南醫(yī)學(xué)院SPF 級動(dòng)物房， 給予充足的水和標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。 小鼠隨機(jī)分為游泳組和靜坐組，每組8只。

1.2 游泳方案 在30～32 ℃的150 cm × 70 cm 的錐形水缸中裝滿＞25 cm 的水，第一天游泳持續(xù)10 min，每天遞加10 min，直至一周后游泳90 min，總計(jì)28 d。上午下午各一趟。所有游泳時(shí)間均在9:00 AM-11:00 AM,及3:00 PM-5:00 PM。 同時(shí)，將靜坐組的小鼠關(guān)在籠子里作為對照。

1.3 腸道菌群樣本取材 游泳運(yùn)動(dòng)結(jié)束四周后，將待取樣的小鼠放進(jìn)干凈的鋪有無菌濾紙的籠子里，小鼠排便后立即收集糞便樣本，單個(gè)小鼠收集3～5 粒糞便置于無菌的EP 管。 每只小鼠更換新的無菌濾紙和籠子。 取得糞便后液氮速凍，-80 ℃保存，用于腸道菌群16s rRNA 測序。

1.4 小鼠糞便微生物總DNA 提取和16S rRNA 基因測序

1.4.1 腸道菌群樣本DNA 提取 腸道樣本用E.Z.N.A.Stool DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）試劑盒提取DNA，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量，同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對DNA 進(jìn)行定量。

1.4.2 16S rRNA 的擴(kuò)增 16S rRNA 基因指的是基因組中編碼核糖體16S rRNA 分子對應(yīng)的序列。 該基因全長約1542 bp， 由9 個(gè)可變區(qū)和10 個(gè)保守區(qū)組成（可變區(qū)為V1 到V9），其中保守區(qū)反映了生物物種間的親緣關(guān)系， 而可變區(qū)則表明物種間的差異，且變異程度與細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)，被認(rèn)為是最適于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標(biāo)。對16s rRNA 的V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為341F:5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'和805R:5'-GACTA CHVGGGTATCTAATCC-3'；V4可變區(qū)擴(kuò)增引物為515F:5'-GTGYCAGCMGCCG CGGTAA-3' 和806R：5'- GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'；V4-V5 可變區(qū)擴(kuò)增引物為F：5’-GTGC CAGCMGCCG CGG-3’和R:5’-CCGTCAATTCMTT TRAGTTT-3’； 以及古菌的擴(kuò)增引物為F:5’-GYG CASCAGKCG MGAAW-3’和R:5’-GGACTACHVG GGTWTCTAA T-3’。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確證。

1.4.3 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序 PCR 產(chǎn)物由AMPure XT beads (Beckman Coulter Genomics, Danvers,MA, USA)純化，Qubit(Invitrogen, USA)定量。擴(kuò)增子池用于測序， 擴(kuò)增子文庫的大小和數(shù)量分別在Agilent2100 生物分析儀(Agilent，美國)和Illumina(Kapa Biosciences, Woburn, MA，美國)的文庫定量試劑盒上進(jìn)行評估。使用NovaSeq6000 測序儀進(jìn)行2×250bp 的雙端測序， 相應(yīng)試劑為NovaSeq 6000 SPReagentKit(500cycles)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

1.5.1 篩選與質(zhì)控 樣品在Illumina NovaSeq 平臺上按照制造商的建議進(jìn)行測序， 由LC-Bio 提供。根據(jù)樣品獨(dú)特的條形碼， 將配對端序列分配給樣品，并將建庫引入的barcode 和引物序列去除。 使用FLASH 合并匹配端讀取。

1.5.2 生信分析 根據(jù)fqtrim(v0.94)，在特定的過濾條件下對原始讀數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾， 以獲得高質(zhì)量的clean 標(biāo)簽。 使用Vsearch 軟件對嵌合序列進(jìn)行過濾(v2.3.4)。 利用DADA2 進(jìn)行解調(diào)，然后使用ASVs (Amplicon Sequence Variants)的概念構(gòu)建類OTU(Operational Taxonomic Units)表，獲得最終的feature 特征表以及特征序列，進(jìn)一步進(jìn)行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析等。 多樣性和多樣性通過歸一化到相同的隨機(jī)序列來計(jì)算。 然后根據(jù)SILVA(release 132)分類器，利用每個(gè)樣本的相對豐度對特征豐度進(jìn)行歸一化。 Alpha 多樣性用于分析樣本物種多樣性的復(fù)雜性，通過QIIME2 計(jì)算5 個(gè)指標(biāo)，包括Chao1、Observed、species,Goods coverage、Shannon、Simpson。 Beta 多樣性基于QIIME2 計(jì)算。采用Blast 進(jìn)行序列比對， 每個(gè)代表性序列用SILVA 數(shù)據(jù)庫對特征序列進(jìn)行注釋。其他圖是用R包（V3.5.2）實(shí)現(xiàn)的。

1.5.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（±s）表示,兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)對腸道菌群物種組成豐度的分析 圖1是兩組基于一致性進(jìn)行繪制的稀釋曲線， 曲線趨于平緩，證明本實(shí)驗(yàn)測序數(shù)據(jù)量已飽和，即測序數(shù)據(jù)合理，可以反映樣本中大多數(shù)的微生物信息。 進(jìn)而對兩組小鼠腸道糞便的樣本進(jìn)行測序， 統(tǒng)計(jì)運(yùn)動(dòng)后OUT 數(shù)量， 用Venn 圖展示不同組之間共有和差異的OTU 數(shù)目。 由圖2 可知，靜坐組OTU 數(shù)目為1658，運(yùn)動(dòng)組數(shù)目為821，共有數(shù)目為707。結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)組OTU 數(shù)目明顯降低， 提示游泳運(yùn)動(dòng)可能降低菌群豐富度。

圖1 靜坐組和運(yùn)動(dòng)組的稀釋曲線

圖2 靜坐組和運(yùn)動(dòng)組腸道菌群OUT 的Venn 圖

2.2 運(yùn)動(dòng)對腸道菌群Alpha 多樣性的分析 α 多樣性是度量單個(gè)樣本內(nèi)有多少種微生物物種， 以及每個(gè)物種所占比例的指標(biāo)， 關(guān)注的是樣本自身的菌群豐富度和均勻度。 靜坐組和運(yùn)動(dòng)組的腸道菌群微生物的Alpha 多樣性分析表明，圖3 顯示反映樣本中物種豐富度的Observed species 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

圖3 靜坐組和運(yùn)動(dòng)組腸道菌群Alpha 多樣性比較

2.3 運(yùn)動(dòng)對腸道菌群Beta 多樣性的分析 Alpha多樣性與Beta 多樣性一起構(gòu)成了總體多樣性或一定環(huán)境群落的生物異質(zhì)性，Beta 多樣性是指不同環(huán)境群落之間的物種差異性。 圖4 是通過主成分PCA（Principal Component Analysis)對靜坐組和運(yùn)動(dòng)組的腸道菌群進(jìn)行分析。 結(jié)果顯示靜坐組菌群明顯聚集，并且與運(yùn)動(dòng)組有一定的距離，說明兩組之間有一定的差異。 于是對兩組的腸道菌群進(jìn)行門水平分析，結(jié)果如圖5 所示，靜坐組和運(yùn)動(dòng)組的前三優(yōu)勢菌群都是擬桿菌門， 厚壁菌門以及變形菌門。 這表明運(yùn)動(dòng)對腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成沒有明顯影響，但是運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致擬桿菌門豐度降低，厚壁菌門以及變形菌門豐度增加。

圖4 靜坐組和運(yùn)動(dòng)組腸道菌群的PCA 分析

圖5 靜坐組和運(yùn)動(dòng)組腸道菌群門水平相對豐度比較

進(jìn)一步對腸道菌群進(jìn)行屬水平分析，結(jié)果見圖6。 與靜坐組的優(yōu)勢菌群相比，運(yùn)動(dòng)組的擬桿菌屬、杜氏藻屬下降，但是有益菌乳酸菌屬、毛螺菌屬明顯上升。

圖6 靜坐組和運(yùn)動(dòng)組腸道菌群屬水平相對豐度比較

2.4 顯著差異菌群分析 為了進(jìn)一步探究運(yùn)動(dòng)和靜坐組之間的差異物種， 對腸道菌群物種進(jìn)行LEfSe （Linear Discriminant Analysis Effect Size）分析，尋找生物標(biāo)記物。 結(jié)果如圖7 所示，主要展示了LDA score 大于預(yù)設(shè)值（>2）的顯著差異物種，即不同組間顯著差異物種的影響程度，數(shù)值越大，差異越顯著。 此外運(yùn)動(dòng)組屬水平上遲緩埃格特菌屬、另枝菌屬、克里斯滕森菌屬、真桿菌屬、瘤胃球菌-UCG-013、瘤胃球菌-UCG-014 以及異桿菌屬豐度明顯高于靜坐組， 在科水平上真桿菌科和瘤胃球菌科的豐度也高于靜坐組。

圖7 LEfSe 及LDA 值分布柱狀圖

2.5 腸道菌群功能預(yù)測 對兩組腸道菌群進(jìn)行KEGG 功能分析，并篩選出具有顯著性組間差異的通路。 根據(jù)組間t-test 差異檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路結(jié)果見圖8。運(yùn)動(dòng)組集中在UDP-N-acetyl-Dglucosamine biosynthesis I、superpathway of polyamine biosynthesis I、1,4 -dihydroxy -6 -naphthoate biosynthesis II、peptidoglycan maturation、superpathway of glycol metabolism and degradation、pyrimidine deoxyribonucleotides de novo biosynthesis III等通路。 而靜坐組集中在superpathway of Lthreonine biosynthesis、superpathway of β-Dglucuronide and D -glucuronate degradation、superpathway of 5 -aminoimidazole ribonucleotide biosynthesis、superpathway of hexuronide and hexuronate degradation 等通路。

圖8 t-test 組間通路差異分析圖

3 討論

3.1 游泳運(yùn)動(dòng)對小鼠腸道菌群微生物組成的影響運(yùn)動(dòng)可以影響人體腸道菌群的數(shù)量和構(gòu)成[19]，Carbajo 等[20]研究證明運(yùn)動(dòng)可以改變大鼠的腸道菌群。 本研究同樣發(fā)現(xiàn)，游泳運(yùn)動(dòng)改變了小鼠腸道菌群的豐度及比例。 運(yùn)動(dòng)組小鼠的菌群豐富度降低，體現(xiàn)在有害菌的減少以及有益菌的增加。 其中擬桿菌門豐度降低， 而厚壁菌門和變形菌門的豐度增加。 與肥胖相關(guān)的腸道微生物區(qū)系的特征是擬桿菌的減少[21]。 Akoi 等[22]發(fā)現(xiàn)厚壁菌門/擬桿菌門的比值和運(yùn)動(dòng)量正相關(guān)。 腸道厚壁菌門可以產(chǎn)生丁酸鹽抵抗患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)[23]。而有益的腸道變形菌門在人類非酒精性肝病中降低[24]。本研究證明了游泳運(yùn)動(dòng)可以調(diào)節(jié)菌群構(gòu)成和種類， 抑制致病菌的產(chǎn)生，增加益生菌的定植。

在菌屬水平上，和靜坐組相比，運(yùn)動(dòng)組的乳酸菌屬和毛螺菌屬明顯上升。 其他研究也證實(shí)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致乳酸菌和毛螺菌表達(dá)增加[25-26]。 乳酸菌是功能已經(jīng)確認(rèn)的益生菌， 可以改善嚙齒類動(dòng)物在力竭運(yùn)動(dòng)后的腸道屏障性能[27]和抗氧化狀態(tài)[28]，并減輕炎癥反應(yīng)[29]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)老年缺血性心肌病患者乳酸菌水平顯著降低[30]。而毛螺菌屬可以介導(dǎo)過敏反應(yīng)[31]、增加食欲[32]以及抵抗兒童腹瀉[33]。我們的實(shí)驗(yàn)說明游泳運(yùn)動(dòng)可以影響和改善宿主腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能。 但是值得注意的是，這種菌群的變化可能是暫時(shí)的， 或許需要長期重復(fù)的運(yùn)動(dòng)來使腸道菌群發(fā)生持久的改變。

另外我們還發(fā)現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)組腸道菌群的遲緩埃格特菌屬、另枝菌屬、真桿菌屬、Ruminococcaceae-UCG-013、Ruminococcaceae-UCG-014、 克里斯滕森菌屬以及異桿菌屬豐度也明顯高于靜坐組。 研究報(bào)道低水平的遲緩埃格特菌和老年人的脆弱指數(shù)正相關(guān)[34]，并且與生物學(xué)年齡呈正相關(guān)，與實(shí)際年齡無關(guān)[35]。而另枝菌屬在線粒體障礙模擬的衰老模型中表達(dá)增加[36]，不過我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明游泳運(yùn)動(dòng)過后小鼠腸道中另枝菌屬表達(dá)也升高， 結(jié)合其他不同的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)， 我們推測同樣的菌群在不同的模型中的表達(dá)和作用也有所區(qū)別。Ruminococcaceae-UCG-013 在雞球蟲病感染中明顯 降 低[37]， 而Ruminococcaceae-UCG-014 的 增 加可以減緩焦慮情緒[38]，使人體免受負(fù)面情緒的干擾。 自閉癥患者治療前后的腸道菌群也有上述改變[39]。我們的實(shí)驗(yàn)同樣觀察到游泳運(yùn)動(dòng)的小鼠更為興奮并且有活力， 這或許提示小鼠上述表型的改變和運(yùn)動(dòng)優(yōu)化腸道菌群的組成有關(guān)。 在不同的人群和多項(xiàng)研究中， 腸道克里斯滕森菌的相對豐度和身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）成負(fù)相關(guān)，并且與肥胖和炎癥性腸病等疾病有關(guān)[40]。 另外異桿菌可以參與3-羥基十八烯酸對結(jié)腸炎的治療[41]。在科水平上真桿菌科和瘤胃球菌科的豐度在運(yùn)動(dòng)組也顯著增加。真桿菌科持續(xù)存在于纖維溶解的腸道群落中，是健康腸道微生物區(qū)系的重要組成部分， 而在炎癥性腸病患者中可以觀察到它們的耗竭。 此外瘤胃球菌科因其對人體的有益作用而廣為人知， 比如與長壽[42]、心臟代謝[43]、骨關(guān)節(jié)炎[44]、肺癌[45]和帕金森病[46]等有關(guān)。以上結(jié)果證明運(yùn)動(dòng)有助于提高腸道菌群的健康程度， 或許運(yùn)動(dòng)可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物從而防治胃腸道，神經(jīng)和心血管等疾病。

3.2 游泳運(yùn)動(dòng)對小鼠腸道菌群微生物基因功能的影響 腸道菌群的功能和宿主之間存在緊密聯(lián)系，腸道微生物除能夠合成蛋白質(zhì)外， 還可以合成多種維生素， 其代謝產(chǎn)物還會在腸道內(nèi)有一定的作用，這與機(jī)體的免疫息息相關(guān)[47]。 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)KEGG功能分析發(fā)現(xiàn)， 運(yùn)動(dòng)組表達(dá)增加的通路主要集中在葡萄糖無氧氧化途徑，乳酸代謝，蛋白質(zhì)合成，脂代謝和信號傳導(dǎo)， 而正常組豐度增加的通路主要有葡萄糖有氧氧化途徑和遺傳信息。 說明運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體需要更多的能量來維持消耗，包括利用蛋白質(zhì)脂肪等，并且由于瞬時(shí)大量的運(yùn)動(dòng)，部分葡萄糖更多地參與了無氧氧化。 我們的研究還發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)會激活部分信號傳導(dǎo)通路， 進(jìn)而促進(jìn)腸道菌群發(fā)揮代謝作用， 并以此來調(diào)控其他器官或組織對運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)。

綜上所述， 運(yùn)動(dòng)作為非藥物和無創(chuàng)的治療手段，在改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成、調(diào)節(jié)人體腸道微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等方面具有積極的作用和獨(dú)特的意義。 本實(shí)驗(yàn)證明了游泳運(yùn)動(dòng)可以增加小鼠腸道菌群中健康的細(xì)菌種類、微生物多樣性、能量代謝能力和微生物相關(guān)的代謝物。 游泳運(yùn)動(dòng)還可以通過調(diào)節(jié)菌群變化進(jìn)而改善負(fù)面情緒。 本研究可以讓人們對運(yùn)動(dòng)和腸道微生物有進(jìn)一步的認(rèn)識， 并對運(yùn)動(dòng)對人體的好處有更深刻的理解。 有望為全民體育運(yùn)動(dòng)提供理論指導(dǎo)。 但是本實(shí)驗(yàn)還存在樣本量不夠，小鼠和人體的腸道存在一定差異的問題。因此仍需要更深層次地去探討運(yùn)動(dòng)和腸道菌群的關(guān)系。