宮再興，徐慶剛

（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，南昌 330006）

腎透明細(xì)胞癌 （Renal Cell Carcinoma, RCC），是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一， 來源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)， 發(fā)病率僅次于前列腺癌和膀胱癌[1]。 目前腎癌的病因尚不明確， 可能與遺傳、吸煙、肥胖、高血壓及抗高血壓治療等因素有關(guān)，促使研究者從各個層面研究探討， 尋求新的治療策略。 長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt 的不能編碼蛋白質(zhì)的RNA 分子， 但是可以從多個層面調(diào)控蛋白質(zhì)的編碼基因的表達水平[2]。近年來， 各國學(xué)者對lncRNA 的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)并證實多個lncRNA 的異常表達與惡性腫瘤息息相關(guān)[3]。 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasisassociatedlungadenocarcinomatranscript1,MALAT1）是一個高度保守和豐度的lncRNA，位于人類染色體11q13.1 上，主序列包括了8000 多個核苷酸，廣泛分布于人體各組織器官中， 通過多種方式在表觀遺傳學(xué)水平上引起腫瘤細(xì)胞的惡性增殖， 侵襲能力上升，凋亡減弱，進而影響腫瘤患者的病情進展及后期藥物的治療效果等。 我們通過干涉非編碼RNA MALAT1 的表達，研究對人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 的影響， 為腎細(xì)胞癌的診療提供新的策略。

1 實驗材料與方法

1.1 材料 人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 細(xì)胞由中國科學(xué)院（上海）細(xì)胞類型培養(yǎng)研究所購得，shRNA由上海依祥生物技術(shù)有限公司合成，TRIZOL 試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，MALAT1 引物、Lipofectamine 2000 reagent 均 購 自 美 國Invitrogen 公 司，qPCR 試 劑 盒 購 自TaKaRa 公 司，RPMI 1640 培養(yǎng)基、牛血清白蛋白（Albumin Bovine V） 均購自美國Gibco 公司，ABI7900 型Realtime-PCR 儀購自美國ABI 公司，CCK-8 Cell Counting Kit 購自諾唯贊生物， 全自動板式酶標(biāo)儀購自奧地利TECAN 公司，24 孔板用細(xì)胞培養(yǎng)池（透明PET膜8.0 μm） 購自美國Corning 公司，PRIMER IPAGE 11-59 BP、FACSCalibur 流式細(xì)胞儀購自BD 公司，Annexin V/PI apoptosis kit 購自聯(lián)科生物。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染 實驗分三組：實驗組（shRNA-MALAT1組）、陰性對照組（shRNA-NC 組）、正常培養(yǎng)組。 用胰蛋白酶消化細(xì)胞后并計數(shù)，將細(xì)胞以1×105/孔接種在六孔板上， 加入2 mL 含F(xiàn)BS 的細(xì)胞培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱中， 當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量≥80%時，按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM 2000 說明書依次轉(zhuǎn)染，每組平行3 孔，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，便于后續(xù)試驗。

1.2.2 qPCR 檢測各組MALAT1 基因的表達 轉(zhuǎn)染36 h 后提取RNA， 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，MALAT1 引物為5′-TGCAGCCCGAGACTTCTGT -3′，5′-GCTTC TGCGTTGCTAAAATGG-3′。 GAPDH 引 物 為5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，5′-GTGGTC GTTGAGGGCAATG-3′。 進行qPCR，95 ℃預(yù)變性30 s 后，進入40 個循環(huán)：95 ℃10 s； 60 ℃30 s。

1.2.3 CCK8 檢測各組細(xì)胞生長情況 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期， 用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，接種到96 孔板（每組設(shè)定5 個復(fù)孔），放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于接種后0 h、24 h、48 h、72 h 加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)37 ℃孵育2 h，450 nm 波長下利用酶標(biāo)儀測定各孔板各組細(xì)胞的吸光值。

1.2.4 Trsanwell 小室檢測各組細(xì)胞侵襲能力 用胰蛋白酶將各組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液， 收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1～10×105個/mL，用移液槍吸取100 μL， 接種于預(yù)先鋪膠4℃過夜的Transwell 上室， 加入500 μL 含趨化因子的培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48h，用棉簽小心擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定5 分鐘后用PBS 反復(fù)淋洗，再4 g/L 的結(jié)晶紫溶液染色。 在倒置顯微鏡下每個樣本隨機取5 個單獨視野并計數(shù)拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況 用不含EDTA 的胰蛋白酶將各組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸浮液， 并用預(yù)冷的PBS 洗滌。 先后加入100 μL 1 Binding Buffer 重懸細(xì)胞、5 μL Annexin V- FITC、10 μL PI 輕輕混勻，避光、室溫反應(yīng)5 min。 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 使用SPSS 26.0 對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，任意兩組間的數(shù)據(jù)分析使用t 檢驗，三組間數(shù)據(jù)分析使用單因素方差分析，P＜0.05 提示組間數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測 用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率（圖1A，1B）， 轉(zhuǎn)染成功標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞體內(nèi)有綠色熒光出現(xiàn)，且熒光細(xì)胞占比大于80%，轉(zhuǎn)染48 h 后用于后續(xù)實驗。

圖1 B 陰性空轉(zhuǎn)組（shRNA-NC 組）轉(zhuǎn)染后

圖1 A 實驗組（shRNA-MALAT1 組）轉(zhuǎn)染后

2.2 各組MALAT1 基因的qPCR 檢測 采用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測實驗組、陰性對照組、正常培養(yǎng)組腎透明細(xì)胞癌786-O 細(xì)胞中MALAT1 的表達量情況， 結(jié)果顯示， 實驗組MALAT1 表達水平（0.326±0.049）明顯低于陰性對照組（1.006±0.194）和正常培養(yǎng)組（0.982±0.161），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。提示沉默lncRNA MALAT1 效果顯著。

圖2 MALAT1 在各組腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 中的相對表達量（*P＜0.05）

2.3 沉默lncRNA MALAT1 的表達對各組癌細(xì)胞增殖的影響 采用CCK8 法檢測實驗組、陰性對照組、 正常培養(yǎng)組腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 的增殖情況分別為（1.710±0.081），（1.977±0.292），（2.003±0.277），并繪制細(xì)胞生長曲線，見圖3。 與正常培養(yǎng)組和陰性對照組相比， 實驗組癌細(xì)胞增殖細(xì)胞活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示沉默lncRNA MALAT1 的表達能夠明顯抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 的增殖。

圖3 CCK8 檢測各組腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 增殖情況曲線圖（*P＜0.05）

2.4 沉默lncRNA MALAT1 表達對各組癌細(xì)胞侵襲能力的影響 采用Trsanswell 侵襲實驗檢測實驗組、 陰性對照組、 正常培養(yǎng)組腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 的穿透Matrigel 膠轉(zhuǎn)移到Trsanswell 膜背面的細(xì)胞數(shù)，與正常培養(yǎng)組（110.40±7.925）和陰性對照組（106.40±4.722）相比，實驗組（54.40±7.403）侵襲細(xì)胞個數(shù)明顯降低（圖4），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而與正常培養(yǎng)組相比，陰性對照組侵襲細(xì)胞數(shù)量無明顯差異（P＞0.05，圖5）。 提示沉默lncRNA MALAT1 的表達能夠明顯降低腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 的侵襲能力。

圖4 Trsanwell 侵襲實驗檢測各組腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞數(shù)量（400 倍）

圖5 Trsanswell 侵襲實驗檢測各組腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞數(shù)量柱狀圖（*P＜0.05）

2.5 沉默lncRNA MALAT1 表達對各組癌細(xì)胞凋亡的影響 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測實驗組、陰性對照組、 正常培養(yǎng)組腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 的平均凋亡率，與正常培養(yǎng)組（22.456±2.443）%和陰性對照組（21.586±2.285）%相比，實驗組的癌細(xì)胞凋亡率（80.158±6.181）%明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖6），而陰性對照組細(xì)胞凋亡與正常培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡無明顯差異（P＞0.05，圖7）。 提示干涉lncRNA MALAT1 的表達能夠明顯增加腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 的凋亡。

圖6 各組流式細(xì)胞細(xì)胞檢測圖

圖7 流式細(xì)胞儀檢測各組腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡柱狀圖（*P＜0.05）

3 討論

RCC 作為致死率最高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，每年全世界約有40.3 萬新發(fā)病例[4]，盡管早期腎癌可以通過手術(shù)治療達到臨床治愈， 但是仍有約35%患者表現(xiàn)為晚期或轉(zhuǎn)移性RCC。 伴隨高通量測序與生物信息分析技術(shù)的飛速發(fā)展， 促進我們從遺傳學(xué)的角度認(rèn)識和探究RCC 的診治， 越來越多的研究證明，lncRNA 在RCC 的發(fā)生、 發(fā)展和預(yù)后中扮演重要的角色[5]。

Ji P[6]等在2003 年預(yù)測早期非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移時首次發(fā)現(xiàn)肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1)，在其超保守的3' 端存在一個tRNA 樣三葉草的二級結(jié)構(gòu)， 可以被核糖核酸酶P 和Z 識別與切割, 生成近3' 端的短RNA 和兩種RNAMALAT1， 剩余的3' 端與RNase Z 結(jié)合并剪切,生成一個長度為61nt 的成熟tRNA 樣轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)[7]。多項實驗研究證明MALAT1 通過調(diào)控選擇性剪接、 基因轉(zhuǎn)錄、 細(xì)胞周期以及充當(dāng)miRNA的海綿等方式參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后。

我們通過構(gòu)建shRNA 載體，沉默非編碼RNA MALAT1 在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MALAT1 基因的表達后，腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O 的細(xì)胞增殖降低，侵襲能力下降，細(xì)胞凋亡增加，提示lncRNA MALAT1 的過表達可能是導(dǎo)致腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、 發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要原因，查閱相關(guān)文獻，推測MALAT1 可能通過改變mRNAs 前體的選擇性剪接[8]；或通過與起始復(fù)合體(PRC2)結(jié)合，阻止組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(EZH2)與HIV-1 長末端重復(fù)(LTR)啟動子結(jié)合，使PRC2所介導(dǎo)的組蛋白無法甲基化[9]；或通過誘導(dǎo)三甲基化的組蛋白3 賴氨酸(H3K9)合成增多[10]，從而達到抑制靶基因的表達，誘發(fā)惡性腫瘤的生成。 提示敲除或沉默非編碼基因MALAT1 對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著明顯的抑制作用。 同時MALAT1 可以競爭性地結(jié)合miRNA， 使miRNA 與靶基因的結(jié)合減少[11]， 而上調(diào)MALAT1 的表達可以使得miR-101減少，可以促進癌細(xì)胞增殖并減少癌細(xì)胞凋亡率[12]。提示敲除非編碼基因MALAT1 可能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲，改善患者預(yù)后。

綜上所述，通過沉默lncRNA MALAT1 表達能夠抑制癌細(xì)胞增殖，降低侵襲，增加凋亡。 其作用機制可能涉及P13K/Akt 信號通路和EZH2/βcatenin 信號通路，以及相關(guān)蛋白的表達，在后續(xù)的動物實驗中將進一步探討lncRNA MALAT1 在腎細(xì)胞癌中的機制研究， 為臨床上腎透明細(xì)胞癌的診療提供新的思路。